專利名稱：：利用基因置換技術改造力達霉素產生菌的方法
技術領域：
：本發明涉及利用基因置換技術改造抗生素產生菌染色體以構建新型抗生素產生菌的方法，具體而言，是用力達霉素輔基蛋白基因與具有腫瘤靶向性多肽的融合基因，取代力達霉素生物合成基因簇中的輔基蛋白基因(caW)，以獲得能產生既具靶向性、又有抗腫瘤活性的力達霉素重組菌株。
背景技術：
：一般抗癌藥物的毒性很大，采用單抗偶聯靶向給藥可以減少毒副作用。單抗偶聯物雖然具有體內分布特異性，在腫瘤耙部位的濃度較高，但偶聯物實際到達腫瘤細胞尤其是實體瘤深部細胞的數量有限。這與腫瘤組織的特異性和偶聯物分子的大小等因素有關。烯二炔類抗腫瘤抗生素由于其很強的抗癌活性，更適于制備成為單抗導向藥物。力達霉素是由球孢鏈霉菌(5&印to^ces^o&邵orusC-1027)產生的一種具有極強抗腫瘤活性的新型烯二炔抗生素，由脂溶性發色團和輔基蛋白非共價鍵結合組成。烯二炔結構的發色團具有極強的細胞毒作用，輔基蛋白對發色團的穩定起保護作用。IV型膠原酶能夠破壞基質的平衡，在多種人類腫瘤細胞以及腫瘤新生血管內皮細胞中均呈高表達。抑制IV型膠原酶的活性，即可抑制腫瘤細胞的侵襲轉移和腫瘤血管的生成。研究表明，以源于抗IV型膠原酶單克隆抗體3G11單鏈抗體scFv或可分泌單域抗體VH等作為導向藥物的載體，^^僅可以提供腫瘤靶向性，而且其自身就具有抑制腫瘤的效果。此外，含RGD(即Arg-Gly-Asp)的小肽能夠特異性地與0￥03整合素結合，而0,03整合素在很多腫瘤組織中呈高表達，與腫瘤的侵襲轉移密切相關。所以，RGD等小肽亦可形成導向藥物的載體。本研究所已將輔基蛋白與抗IV型膠原酶單鏈抗體融合蛋白(scFv-LDP)在中成功表達，表達出來的蛋白可以裝配力達霉素的發色團，并在體外和動物體內試驗中均獲得很好的效果。然而不足之處是，大腸桿菌所表達的融合蛋白集中在包涵體內，包涵體所含外源蛋白未經正確折疊，也未形成正確折疊的二硫鍵，一般不具有天然構象，也不具有生物活性，所以必須在體外變性、復性以恢復其生物學活性。目前已經發展了上百種復性方法，但是沒有一種方法適用于所有外源蛋白的表達。大腸桿菌表達出來的Fv-LDP融合蛋白在應用之前，需經過人工變性復性，以及發色團的體外裝配等，工藝十分復雜。本發明的目的之一是，將力達霉素的輔基蛋白與具有腫瘤靶向性多肽如抗IV型膠原酶單鏈抗體scFv，或可分泌單域抗體vh進行偶聯，形成融合蛋白。本發明的目的之二是，為使融合蛋白進一步小型化，構建了力達霉素輔基蛋白與腫瘤靶向肽RGD的融合蛋白。通過同源重組構建重組菌株，再經發酵獲得既具單抗靶向性，又有高效抗腫瘤活性的scFv-LDM、Vh—LDM、RGD—LDM等，進而可為臨床提供一種新的單抗靶向抗腫瘤藥物。本發明所述利用基因置換技術改造抗生素-力達霉素產生菌染色體以構建新型抗生素產生菌的方法，迄今為止，尚未見有國內外的相關報道。力達霉素的生物合成基因簇已被克隆(GenBank登錄號AY048670)。力達霉素輔基蛋白基因位于結構基因Al和A4之間，這為構建力達霉素的輔基蛋白與具有腫瘤靶向性多肽融合蛋白的基因操作提供了有利條件。
發明內容本發明提供了利用基因置換技術改造力達霉素產生菌的方法，即利用基因置換技術在力達霉素產生菌5^r印tofflycesWo6j'邵ot"sC-1027中，用力達霉素(lidamycin，LDM)輔基蛋白基因與具有腫瘤靶向性多肽的融合基因，取代力達霉素生物合成基因簇中的輔基蛋白基因(ca^D，獲得能夠產生既具靶向性、又有抗腫瘤活性融合蛋白的力達霉素重組菌株。本發明所述改造抗生素產生菌的方法，其總體步驟是1.確定編碼靶向肽的核酸序列本發明所涉及的靶向肽選自多種來源，包括但不限于腫瘤特異性抗原的單鏈抗體、單域抗體、具有腫瘤特異性結合活性的小肽等。本發明的一個優選實施方案中，所述靶向肽為抗IV型膠原酶單鏈抗體序列；另一個優選實施方案中，所述靶向肽為抗IV型膠原酶單域抗體序列；再一個優選實施方案中，所述靶向肽為環RGD十肽序列；2.設計相應引物，PCR方法擴增，獲得編碼靶向肽的基因片段；3.基因置換載體的構建包括，用于同源雙交換被置換基因兩臂的PCR擴增、選擇性標記基因片段的插入及與載體的連接；4.將基因置換載體導入C-1027產生菌；5.重組菌株的篩選和鑒定用選擇性標記進行篩選，以PCR、Southernblot進行染色體基因置換的鑒定，SDS-PAGE進行融合蛋白表達的檢測；6.基因置換重組菌株產生力達霉素的檢測根據力達霉素抗微生物抑菌活性與抗腫瘤活性具平行性的特點(趙春燕等，中國抗生素雜志，2005，(30):9)，將本發明所獲含融合蛋白重組菌株，用本領域公知的方法，在適于力達霉素產生的營養培養基和需氧培養條件下培養。例如，可在實驗室或工業發酵罐中通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態發酵)培養。在所述條件下，發酵進行大約30-200小時后，優選進行80-140小時后結束發酵。在發酵終點，通過監測發酵培養液的抑菌活性，監測重組菌株的生長狀況。本發明按照上述步驟，首先分別設計引物，以5".Wo&'^70i7/sC-1027的總DNA為模板進行PCR反應，在力達霉素輔基蛋白基因(caW)終止密碼子TGA兩側，擴增出用于雙交換兩臂的同源片段，以含有抗IV型膠原酶單鏈抗體質粒為模板，根據己知序列，PCR擴增抗IV型膠原酶單鏈抗體scFv;根據鏈霉菌偏好密碼子合成單域抗體VH;合成RGD十肽基因。將上述耙向多肽片段，分別與選擇性抗性標記-阿普霉素抗性基因片段連入質粒載體，最終得到可以用于同源雙交換的含靶向多肽-輔基蛋白基因(C3^J)的融合蛋白基因重組質粒。經驗證無誤后，轉化Eco7i'，通過接合轉移，轉入5.WoAi印orasC-1027中，對于抗性篩選正確的轉化子，經多次傳代培養進行確認，最終獲得重組菌株，其中的5".g乃W邵or^C-1027-scFv，已于2007年9月25日送交北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，編號為CGMCCNo.2187。本發明對重組菌株進行了PCR、測序和Southern驗證，結果確認構建正確。利用特定的培養基進行發酵，對發酵液進行SDS-PAGE分析表明，原輔基蛋白條帶消失，融合蛋白呈現表達，抗菌活性檢測也呈陽性。初步檢測表明，重組菌株可以產生有活性的力達霉素。發明效果本發明在力達霉素產生菌5Yr印to^ces《A^/邵or^C-1027中，用力達霉素輔基蛋白基因與具有腫瘤靶向性多肽的融合基因，取代力達霉素生物合成基因簇中的輔基蛋白基因(ca^),獲得能夠產生既具靶向性、又有抗腫瘤活性融合蛋白的力達霉素重組菌株。利用重組菌株，可以直接發酵產生含有所述融合蛋白的力達霉素，無需使用常規大腸桿菌表達融合蛋白和LDM體外拆分組裝的制備方法，既可大大簡化操作步驟，又可方便地用于制備具有不同腫瘤耙向性多肽的抗腫瘤導向藥物。圖l.重組菌株51.Wo6i卬o^A5C-1027-scFv構建示意圖其中E—同源重組左臂片段；G—同源重組右臂片段；ca^l—力達霉素輔基蛋白基因；Pl，P2—PCR驗證P片段引物位置；Ql，Q2—PCR驗證Q片段引物位置；Al—輔基蛋白左側基因片段；A4—輔基蛋白右側基因片段；Ara'—阿普霉素抗性基因；ca^4-scFv—單鏈抗體-輔基蛋白融合基因；圖2.S.Wo6y印orwsC-1027和51.^7oZ^印anvsC-1027-scFv的PCR驗證其中l一經ffi/7dlII單酶切的XDNA對照；2—原始菌株61.^oW印cot;sC-1027的P片段PCR驗證結果；3—原始菌株5.Wo&印orasC-1027的Q片段PCR驗證結果；4一重組菌株5.^o&'印on/sC-1027-scFv的P片段PCR驗證結果；5—重組菌株6".C-1027-scFv的Q片段PCR驗證結果；6—經&oRI禾Bft'/7dlII雙酶切的ADNA對照；圖3.原始菌株5.g7o/u'印orasC-1027和重組菌株5.WoWs;wr〃sC-1027-scFv的southernBlot分析其中1一M)NA經&oRI和附"dIII雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結果；2—原始菌株總DNA經fe/nHI酶切瓊脂糖凝膠電泳結果；3—重組菌株總DNA經B孤HI酶切瓊脂糖凝膠電泳結果；4一E片段作探針，人DNA經5boRI和&'"01111雙酶切后放射自顯影結果；5—E片段作探針，原始菌株總DNA經酶切后放射自顯影結果6_E片段作探針，重組菌株總DNA經fe/nHI酶切后放射自顯影結果；圖4.原始菌株5.^Zo6i印arasC-1027和重組菌株51.^o&'印or"sO1027-scFv的發酵產物SDS-PAGE分析其中l一力達霉素輔基蛋白LDP;2—原始菌株發酵液；3—重組菌株發酵液；4一低分子量標準蛋白Marker;圖5.重組菌株5:g7o&'sporusC-1027-FvH的PCR驗證結果其中1，4—MarkerIII"，500bp;3,000bp;2,000bp;1,200bp;800bp;500bp;200bp);2—重組菌株5.Wo6j'印or"sC-1027-FvH的左臂片段PCR驗證結果，長度3,000bp;3—重組菌株Wo&'印orysC-1027-FvH的右臂片段PCR驗證結果，長度2,000bp;圖6.重組菌株5".gA^J'印on/sC-1027-RGD十肽基因的PCR驗證結果其中1，4一經fcoRI禾卩歷'/dlII雙酶切的J)NA對照；2—重組菌株5:^o^'印orasC-1027-RGD十肽基因左臂PCR結果，長度為2143bp;3—重組菌株6".^/o/u'spo^/sC-1027-RGD十肽基因右臂PCR結果，長度為1562bp;具體實施方案.-以下所列實施例僅為便于本領域技術人員人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。<實施例1>質粒pBS-scFv的構建及轉化子篩選基礎質粒pBS03的構建以質粒pBluescriptIIKS+(Keiser等，PracticalStr印tomycesGenetics.Norwich:TheJohnInnesFoundation,2000.)為出發質粒，用酶切質粒pOJ446(來源同質粒pBluescriptIIKS+)得到鏈霉菌復制基因(or/T)，再用萬c/T酶切質粒pIJ680(來源同質粒pBluescriptIIKS+)得到硫鏈絲菌素抗性基因(將上述兩個基因片段依次連接進入質粒pBluescriptIIKS+，得到基礎質粒pBS03。分別設計引物，使用/YuDNA聚合酶，以6".^/oW印orr/sC-1027的總DNA為模板進行PCR反應，在輔基蛋白基因(csW)終止密碼子TGA兩側E和G擴增出用于雙交換的兩臂Al和A4，長度分別為1320bp和1000bp;以含有抗IV型膠原酶單鏈抗體基因的pKFvl027質粒(ZL專利號01131299.8)為模板，擴增抗IV型膠原酶單鏈抗體基因scFv，長度為750bp;質粒pKC1138(來源同質粒pBluescriptIIKS+)經萬柳HI和《§711酶切，得到阿普霉素抗性基因片段，長度1500bp。將上述四個片段連入質粒載體pBS03，最終得到可以用于同源雙交換的含ca^-sc/^V融合蛋白基因的重組質粒pBS-scFv。將構建好的重組質粒pBS-scFv轉化大腸桿菌￡co"ET12567(ATCC:BAA-525)，通過接合轉移轉入61.g7oW印or"sC-1027中，挑取接合轉移后發生雙交換的菌落，經抗性篩選，得到對阿普霉素有抗性而對硫鏈絲菌素敏感的轉化子(Am'Thios)SgA7力i印0rwsC-1027-scFv(圖l)，轉化子可以在含阿普霉素的S5(KN030.1%'NaCl0.05%,K2HP040.05%,FeS040.001%'MgS040.05%,Starch2%'Agar1.5%,pH7.5)平板上生長，而不能在含硫鏈絲菌素的S5平板上生長。<實施例2>PCR驗證重組菌株通過PCR方法，對所得到的轉化子(Am'ThioS)進行基因置換的驗證，其具體步驟是，針對雙交換兩臂外側的序列和單鏈抗體基因序列，分別設計引物，以轉化子5".Wo&'印Oi7/sC-1027-scFv和原始菌株5.WoW印oit/sC-1027總DNA為模板進行擴增。實驗設計的引物為P片段擴增Am抗性基因和scFv基因片段Pl:5'-CTCCTTCTCGCACATCGG-3'，P2:3'-CTACTCCTCAMCCCACCG-5';Q片段擴增scFv基因片段、輔基蛋白基因ca^f、和A4基因片段Ql:5，-GGGTGGCTGTCCTGGTTTC-3',Q2:3，CTTCCTCCCGTGCTAGTGG-5'<■PCR擴增結果表明，P片段長度為2000bp左右，Q片段長度為1800bp。轉化子得到了與預期一致的擴增產物(圖2)，由于引物Q1和P2位于scFv上，因而對照菌株沒有擴增產物。對PCR產物進行測序，結果表明，與力達霉素輔基蛋白基因融合所得轉化子中含有抗IV型膠原酶單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白基因融合的力達霉素基因重組菌株5.《A^y^wr"sC-而-scFv。<實施例3>SouthernBlot驗證重組菌株分別接種重組菌株和對照菌株于YEME培養基(酵母浸膏0.3%，蛋白胨0.5%,麥芽浸膏0.3%,葡萄糖1.0%，蔗糖34.0%，MgCl2.6H200.1%;pH7.0)中，避光，28'C培養48h,轉速250rpm，提取總DNA，用^mbHI酶切過夜，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，轉膜，用Al基因片段作探針，按GeneImagesCDP-StarDetectionKit說明書(美國AraershamBiosciences公司)進行Southern雜交分析。以Al基因片段作探針，SaMH酶切總DNA，重組菌株應得到4728bp、原始菌株應得到4041bp雜交片段，實驗結果表明，構建的重組菌株S.Wo&'印or"sC-1027-scFv正確，重組菌株中的融合蛋白基因已經成功取代ca^l基因(圖3)。<實施例4>重組菌株SDS-PAGE分析對重組菌株6".Wo&'印on/sC-1027-scFv進行發酵，發酵條件參照[趙春燕等，中國抗生素雜志，2005，(30):9]，避光，28°C，轉速250rpm，旋轉搖床振蕩培養48小時，以原始菌株Sg"&'印or^C-1027為陽性對照，于第五天分別取100ral重組菌株和對照菌株發酵液進行離心，離心后的上清，用飽和硫酸銨沉淀LDM-scFv融合蛋白，用少量的水溶解沉淀并透析，對透析液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，15%,120V)分析。結果顯示，WoZu'印o27isC-1027原始菌株發酵產物中明顯能夠分辨出輔基蛋白條帶(10.5KDa)，而在重組菌株S.Wo/^'印or"sC-1027-scFv發酵產物中，則不能檢測到該輔基蛋白條帶。重組菌株中，在預期的LDP-scFv蛋白大小的位置，可檢測到一條微弱條帶，分子量約38kD左右，而原始對照菌株中沒有該條帶，證明該條帶為表達的融合蛋白條帶(圖4)。<實施例5>重組菌株抗菌活性檢測對己經構建好的重組菌株51.Wo&'印027/sC-1027-scFv和原始菌株S.57oW鄧or"sC-1027進行發酵，以藤黃八疊球菌(Wcrococcus7"ewsCMCC:〈B〉28001)為鑒定菌，以原始菌株為陽性對照，用抑菌圈試驗來檢測重組菌株S.^o^'印o27^C-1027-scFv發酵液的抗菌活性。由于力達霉素同時具有強烈的抗腫瘤作用和抗革蘭氏陽性菌的作用，并且二者之間具有平行性(趙春燕等，微生物法測定力達霉素的效價，中國抗生素雜志，2005),因此，本發明采用更易操作的抑菌圈試驗來檢測重組菌株的分泌活性。結果表明，重組菌株XgA^i印o/7isC-1027-scFv發酵液在第五天能夠檢測到抑菌活性(表1)，表明所構建的重組菌株能夠產生力達霉素。表1重組菌株發酵液抑菌活性檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注g爐印o孺C-1027-tenP即5.^oW印mt;sC-1027-RGD十肽基因<實施例6>可分泌單域抗體VH與力達霉素融合蛋白重組菌株的構建按照實施例15相似的方法，本發明采用抗IV型膠原酶單域抗體VH(ZL專利號01131299.8)，根據鏈霉素偏好密碼子重新設計合成與力達霉素輔基蛋白偶聯的策略，既可縮短外源基因的長度，減少融合表達時的不利影響，又可利用VH具有類似scFv的抗體結合活性以及分子較小更易滲透到腫瘤組織內部的特點，同時使用鏈霉菌偏愛的密碼子和增加DNA序列中的GC含量來設計VH基因序列。借助DNAworks2.0軟件，設計合成了12條寡核苷酸片段，利用重疊PCR的方法，將這12個寡核苷酸片段拼接成完整的單域抗體VH基因(序列見SEQIDNO.l)。將重組質粒pBS-sdFvH轉化入大腸桿菌ET12567,再通過接合轉移轉入力達霉素原產生菌株5.Wo^'鄧o/7/sC-1027中，利用抗性差異，篩選得到重組菌株51.Wo6i鄰orwsC-1027-FvH，并對重組菌株進行了PCR驗證及發酵液SDS-PAGE檢測。PCR驗證(圖5)結果，左臂片段長度3000bp，右臂片段長度2000bp。初步判定，重組菌株構建成功。對重組菌株5.^/"i印o/77sC-1027-FvH發酵液活性初步測活結果見表1。<實施例7>可分泌環RGD十肽與力達霉素融合蛋白重組菌株的構建按照實施例15相似的方法，本發明參照文獻設計合成了含RGD的環狀十肽序列、RGD三肽和RGDSP五肽，并按同樣的重組菌株構建策略，將其分別融合在LDP的C末端構建質粒。其中,含RGD的環狀十肽序列見序列2(SEQIDNo.2)，將重組質粒接合轉移進原始菌株SWo&印orusC-1027，挑取重組子，進行了PCR驗證。左臂PCR引物分別為Ltl:5'CACGGACTACTGGMGGACACC3';U2:5'GCGACATGTTCGGCTGC3。右臂引物分別為Rtenl:5'ATCTTCAGGCGCAGCCGAACATGTC3';Rten2:3'CAAGCGTCTTCTGTCCGTGGC5'。試驗結果(圖6)表明，左臂PCR產物長度為2143bp，右臂PCR產物長度為1562bp，與預期的長度一致。初步證明,重組菌株構建成功。對重組菌株S.Wo6i印orwsC-1027-tenP發酵液活性初步測活結果見表1。序列表<110>中國醫學科學院醫藥生物技術研究所<120>利用基因置換技術改造力達霉素產生菌的方法<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>391<212>DNA<213>Streptomycesglobisporus<400>1LEGGGGSQVKLQQSGTEVV151015KPGASVKLSCKASGYIFTSY20253025DIDWVRQTPEQGLEWIGWIF30354045PGEGSTEYNEKFKGRATLSV50556065DKSSSTAYMELTRLRSEDSA70758085VYFCARG卯95CCACGGTCACCGTCTCCTCGTGAAGATCTCCTTVTVSSterDYYRRYFDLWGQG391<210>2<211>60<212>DNA<213>Streptomycesglobisporus<400>2LEGGGGSACRGDMFGCAter權利要求1.一種利用基因置換技術改造力達霉素產生菌的方法，其特征在于所述方法是將靶向性多肽與力達霉素輔基蛋白的融合基因取代力達霉素產生菌的輔基蛋白基因(cagA)，構建產生既具靶向性又有抗腫瘤活性的力達霉素重組菌株。2、權利要求1所述靶向性多肽是指可特異性地與腫瘤組織相結合的分子，其選自單鏈抗體scFv、単域抗體Vh、短肽RGD或其它具有靶向性的配體。3、權利要求1所述力達霉素重組菌株，是指51.^/o&'邵,"sC-1027-scFv，其于2007年9月25日送交北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，編號為CGMCCNo.2187。4、權利要求1所述的方法，其具體步驟是1)PCR擴增或合成耙向性多肽基因；2)PCR擴增所置換基因兩臂用于同源雙交換的基因片段；3)將l)、2)所述基因和選擇性標記基因片段與載體連接，構建基因置換載體；4)將基因置換載體導入力達霉素產生菌；5)用選擇性標記，以PCR、Southernblot和SDS-PAGE進行重組菌株的篩選和鑒定；6)基因置換重組菌株產生力達霉素的檢測。5、權利要求1所述方法構建重組菌株所產力達霉素在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發明涉及利用基因置換技術改造抗生素產生菌染色體以構建新型抗生素產生菌的方法，具體而言，是用力達霉素輔基蛋白基因與具有腫瘤靶向性多肽的融合基因，取代力達霉素生物合成基因簇中的輔基蛋白基因(cagA)，以獲得能產生既具靶向性、又有抗腫瘤活性的力達霉素重組菌株，利用重組菌株，可以直接發酵產生含有所述融合蛋白的力達霉素，無需使用常規大腸桿菌表達融合蛋白和LDM體外拆分組裝的制備方法，既可大大簡化操作步驟，又可方便地用于制備具有不同腫瘤靶向性多肽的抗腫瘤導向藥物。文檔編號C12N15/62GK101302490SQ200810111579公開日2008年11月12日申請日期2008年6月6日優先權日2007年10月9日發明者崔智慧,李保衛,斌洪,王麗非,胡云峰,邵榮光申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所