專利名稱：一種肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)，特別地，涉及一種肝細(xì)胞和肝
枯否細(xì)胞(又稱Kupffer細(xì)胞)的體外共同培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
肝臟是人體中的重要器官，具有合成、代謝、解毒等功能。原代肝細(xì)胞的 體外培養(yǎng)有著廣泛的應(yīng)用價值，如研究肝細(xì)胞的生理、病理，應(yīng)用于細(xì)胞移植、 藥物學(xué)檢測等，同時還可用于作為生物型人工肝(Bio-artificial Liver, BAL)
生物反應(yīng)器的的主體細(xì)胞。體外培養(yǎng)肝細(xì)胞技術(shù)的優(yōu)化是研制開發(fā)BAL生物反 應(yīng)器的核心與關(guān)鍵之一。
然而，將分離的肝細(xì)胞用于上述多種用途中存在的主要問題之一是原代肝 細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時間短，且很多分化功能是瞬時的，在培養(yǎng)物中僅持續(xù)幾小 時至幾天，限制了肝細(xì)胞的應(yīng)用。
一些研究報告認(rèn)為，肝細(xì)胞與非實質(zhì)細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，更接近肝細(xì)胞 在體內(nèi)生存環(huán)境，有利于延長肝細(xì)胞生存時間并保持功能。然而，這些研究均 是采用含有多種細(xì)胞成分的非實質(zhì)細(xì)胞與肝細(xì)胞混合培養(yǎng)，且無固定的培養(yǎng)流 程和標(biāo)準(zhǔn)化搡作程序(standard opration procedure )。
在肝臟的非實質(zhì)細(xì)胞中，Kupffer細(xì)胞是數(shù)量僅次于竇狀內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)的另 一肝非實質(zhì)細(xì)胞，約占肝臟非實質(zhì)細(xì)胞的25-40%，屬巨噬細(xì)胞，主要起著清除 內(nèi)毒素、細(xì)菌、病毒和腫瘤細(xì)胞的功能，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。但 肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞在一個培養(yǎng)體系中共同培養(yǎng)，由于這兩種細(xì)胞屬不同
種類的細(xì)胞，體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境相差大，因此要在體外建立一個標(biāo)準(zhǔn)化、 簡單易行的培養(yǎng)體系，實現(xiàn)兩種細(xì)胞既能良好存活生長、并且能同時呈現(xiàn)兩種 細(xì)胞的功能具有相當(dāng)大的難度。
1994年，汪謙等人(大鼠肝細(xì)胞、K叩ffer細(xì)胞和Ito細(xì)胞的分離與培養(yǎng). 中華實驗外科雜志.1994，11 (2):72-72 )在研究中提及將大鼠肝細(xì)胞、Kupffer 細(xì)胞和Ito細(xì)胞這三種細(xì)胞兩兩或三位一體混合培養(yǎng)比單獨培養(yǎng)在形態(tài)學(xué)和功 能上都顯示優(yōu)越，但該論文中未論及具體如何培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在普通培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞和 Kupffer細(xì)胞的體外共培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)可延長原代肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)時間，且 保持肝細(xì)胞的功能，可用于構(gòu)建生物型人工肝支持系統(tǒng)、藥物學(xué)檢測、肝細(xì)胞
移植、生產(chǎn)白蛋白等。
本發(fā)明所述的技術(shù)方案包括
一種肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征是將肝細(xì)胞和 Kupffer接種于含80-120 ml/L小牛血清，110-135u/L胰島素，90-110jug /L 胰高血糖素，90-110jug /L氫化可的松，1. 0-3. Og/L NaHC03, 8-120萬U/L青 霉素的pH為7-7. 5的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)板上，置于恒溫WC, 5%二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后倒去培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)液沖洗，每天換液；其中肝細(xì) 胞和K叩ffer細(xì)胞數(shù)量比在9-15:1之間；優(yōu)選方案，二種細(xì)胞的數(shù)量比為 10-14:1;比較優(yōu)選地方案，二種細(xì)胞的數(shù)量比為11-13:1;最優(yōu)選方案，二種 細(xì)胞的數(shù)量比為12: 1。
本發(fā)明比較優(yōu)選的技術(shù)方案
乳豬肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于肝細(xì)胞和
Kupffer細(xì)胞的數(shù)量比在9-15: 1之間；優(yōu)選方案，二種細(xì)胞的數(shù)量比為10-14: 1; 比較優(yōu)選地方案，二種細(xì)胞的數(shù)量比為11-13:1;最優(yōu)選方案，二種細(xì)胞的數(shù)量 比為12: 1。
研究表明，肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞二者比例在9-15:1之間，肝細(xì)胞和 K叩ffer細(xì)胞在體外存活時間明顯延長，且具有較好的肝細(xì)胞功能，能對安定 和乙酰氨基酚的清除率較高；尤其二者數(shù)量比為12: 1時，肝細(xì)胞和Kupffer細(xì) 胞在體外存活時間最長，對安定和乙酰氨基酚的清除率最高。
在本發(fā)明中，用于獲得肝細(xì)胞的肝臟供體優(yōu)選是哺乳動物的正常的或者轉(zhuǎn) 基因動物，比較優(yōu)選的是人、狒狒、豬、牛、馬、犬或羊等；最優(yōu)選的是人、 豬。
對于在生物型人工肝生物反應(yīng)器的應(yīng)用，肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的肝臟供 體來源比較優(yōu)選的是豬供體，尤其是乳豬供體。優(yōu)選豬齡在2個月之內(nèi)，比較 優(yōu)選為l個月之內(nèi)，更優(yōu)選在20天之內(nèi)；優(yōu)選豬體重在20kg之內(nèi)，比較優(yōu)選 在10kg之內(nèi)，更優(yōu)選在5kg之內(nèi)。
細(xì)胞分離
本發(fā)明所述的分離原代肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的方法，可以使用本領(lǐng)域所 公知的任何方法。優(yōu)選的方法是Seglen的二步灌流法或者是對其改進(jìn)的方法。 本發(fā)明通過釆用改良的Seglen的二步灌流法，建立了以肝門靜脈為流入道的IV 型膠原酶離體灌流法分離乳豬肝實質(zhì)細(xì)胞，以及聯(lián)合Percoll液密度梯度離心 法分離Kupffer細(xì)胞。該操作程序穩(wěn)定、高效、實用。所獲乳豬肝細(xì)胞數(shù)量、 活率基本能滿足構(gòu)建生物人工肝的要求。且采用低速離心，并縮短離心時間， 可很好地清除上清中的細(xì)胞碎片。IV型膠原酶對肝細(xì)胞的損傷較小，在培養(yǎng)后，
本發(fā)明所述的共培養(yǎng)的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞可以來源于同一種動物，也 可以來源于不同種動物；可以來源于同一只動物，也可以來源于不同只動物。
細(xì)胞培養(yǎng)
用含適量的小牛血清，胰島素，胰高血糖素，氫化可的松，NaHC03,青霉 素，DMEM培養(yǎng)基將肝細(xì)胞懸液密度調(diào)整為肝細(xì)胞數(shù)約5x105—1xl07ml，取6孔培 養(yǎng)板一塊，播種肝細(xì)胞于其中，K叩ffer細(xì)胞根據(jù)肝細(xì)胞數(shù)量調(diào)節(jié)到相應(yīng)比例后 加入，置于恒溫37"C5y。二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后倒去培養(yǎng)上清，用少 量培養(yǎng)液沖3次，每天換液。分別收集肝細(xì)胞與K叩ffer細(xì)胞培養(yǎng)過程中不同時 間內(nèi)的上清液，以1000g的離心速度離心3分鐘，去除細(xì)胞碎片，將處理后的培 養(yǎng)上清置于一20"C的冰箱中保存以備藥物濃度及生化功能檢査。
本發(fā)明所述的細(xì)胞數(shù)量可釆用本領(lǐng)域公知的計數(shù)方法計數(shù)。 本發(fā)明所述的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞在分離后直接按照一定的比例混合后
共培養(yǎng)。
所述肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞可作為細(xì)胞懸浮液或在適合動物細(xì)胞或組織培 養(yǎng)的表面上培養(yǎng)和維持，如培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等。也可以將所述細(xì)胞摻 入到生物反應(yīng)器中，以懸浮形式或在諸如培養(yǎng)珠或纖維的培養(yǎng)基質(zhì)或在平面或 膜上鋪板的形式培養(yǎng)。
細(xì)胞鑒定
肝細(xì)胞的鑒定可選擇通用的經(jīng)典方法。Kupffer細(xì)胞的鑒定可采用吞噬試驗 和免疫組織化學(xué)方法。肝細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參考公開的文獻(xiàn)進(jìn)行鑒
本發(fā)明肝細(xì)胞功能檢觀U分析
表征肝細(xì)胞功能的任何分析方法都可以用于確定原代肝細(xì)胞的長期功能。 肝細(xì)胞功能的分析方法為本領(lǐng)域所熟知，包括，但不局限于分析肝細(xì)胞酶的活 性，測定由肝細(xì)胞表達(dá)的蛋白和化合物，以及測定肝細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。 由肝細(xì)胞表達(dá)的蛋白和化合物包括，但不局限于尿素，白蛋白。肝臟是白蛋白 唯一的合成器官，白蛋白的分泌是完全分化的肝細(xì)胞的特征，可以用標(biāo)準(zhǔn)的 ELISA檢測方法測定?？赏ㄟ^檢測尿素向靛酚的轉(zhuǎn)化測定尿素的合成。
眾所周知，肝臟的P450系統(tǒng)是正常肝臟功能的重要組成部分。該系統(tǒng)直接 完成肝臟轉(zhuǎn)化功能和代謝功能。因此，生物人工肝臟是否具有P450系統(tǒng)的作用， 成為評價其人工肝臟性能的可靠與實用的指標(biāo)圖。而其中最能反映P450系統(tǒng) 作用的當(dāng)屬于安定等藥物的轉(zhuǎn)化清除試驗。安定和對乙酰氨基酚對肝臟均有毒 性，當(dāng)肝細(xì)胞功能良好同時在有K叩ffer的支持下，如體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞能夠 在這兩種藥物作用下繼續(xù)長期生存，并且代謝這兩種藥物，說明培養(yǎng)的細(xì)胞系 具有合成、代謝和解毒功能。本發(fā)明研究結(jié)果表明，合適比例的肝細(xì)胞和K叩ffer
細(xì)胞共同培養(yǎng)時，具有優(yōu)化的合成、代謝和解毒功能。 本發(fā)明的應(yīng)用
本發(fā)明任一所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，可用于構(gòu) 建生物型人工肝支持系統(tǒng)；比較優(yōu)選的，乳豬肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共
同培養(yǎng)技術(shù)可用于構(gòu)建生物型人工肝支持系統(tǒng)；可用于生產(chǎn)白蛋白；可用于篩
選和研究用于治療肝臟疾病的候選藥物等。
在用于構(gòu)建體外的肝臟輔助裝置時，可用于患有急性或爆發(fā)性肝功能衰竭 的患者的治療裝置。該裝置可以起者臨時支持裝置的作用，能夠暫時提供肝臟 功能，直到肝臟移植或者患者自身的肝臟再生。
本發(fā)明的關(guān)鍵和優(yōu)勢
本發(fā)明的關(guān)鍵在于選擇確定了肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)的比
例，從而延長了肝細(xì)胞的生存時間，保持了肝細(xì)胞的功能。Kupffer細(xì)胞的主要
生理功能包括吞噬和清除功能，分泌包括IL-1, TNF-a,HGF在內(nèi)的各種細(xì)胞因
子，分泌前列腺素和氧化類物質(zhì)，殺滅腫瘤細(xì)胞。但Kupffer細(xì)胞在肝損傷和
肝衰竭的發(fā)生中又常常起著不良的作用，在病理情況下對肝實質(zhì)細(xì)胞有殺傷作
用。K叩ffer細(xì)胞是肝竇中潛在的活性氧來源，受刺激激活化后可產(chǎn)生并釋放活
性氧。有實驗證實Kupffer細(xì)胞是肝缺血再灌注損傷初期活性氧的主要來源，
在缺血再灌注損傷的初期，Kupffer細(xì)胞可因補體系統(tǒng)的激活而激活，還可自身
活化，釋放活性氧和蛋白酶等，介導(dǎo)肝臟的損傷，并激活中性粒細(xì)胞攻擊肝實
質(zhì)細(xì)胞，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致肝組織的嚴(yán)重?fù)p傷(JaeschkeH,FarhoodA,B肌tista AP,et al.Complement activates Kupffercells and neutrophils during reperfusion after hepatic ischemia.Am J Physiol,1993,264(4Ptl):G801-G809)。另一方面，Kupffer細(xì)胞釋放的
TNF， IL-1， IL-6等細(xì)胞因子與肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的細(xì)胞因子瀑布學(xué)說相一致。 而實驗中新分離的肝實質(zhì)細(xì)胞有細(xì)胞膜的損傷，有可能使Kupffef細(xì)胞激活， 導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞對肝細(xì)胞的殺傷作用。本發(fā)明通過調(diào)整肝細(xì)胞和Kupffer細(xì) 胞在體外培養(yǎng)體系中的比例，獲得了簡單實用的解決這兩種細(xì)胞功能上互相沖 突造成損傷的技術(shù)方案。
本發(fā)明的優(yōu)勢在于體外肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的共培養(yǎng)可釆用普通的培養(yǎng) 基和培養(yǎng)板，不需復(fù)雜的技術(shù)和稀有材料，成本低，實用性強(qiáng)；乳豬肝細(xì)胞和 Kupffer細(xì)胞，是能夠直接用于構(gòu)建生物型人工肝支持系統(tǒng)的一種細(xì)胞； 一定比 例的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞共同培養(yǎng)時，可延長肝細(xì)胞在體外的存活時間，且 具有合成、代謝和解毒功能。


圖l新分離的肝細(xì)胞(光鏡10x20)
圖2.新分離的Kupffer細(xì)胞(光鏡10x20)
圖3.單獨培養(yǎng)148小時后的枯否細(xì)胞(光鏡10 x 20)
圖4.單獨培養(yǎng)216小時后的肝細(xì)胞(光鏡10x20)
圖5肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按8: 1混合共培養(yǎng)216小時(光鏡10 x 20)
圖6肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按16: 1混合共培養(yǎng)216小時(光鏡10 x 20)
圖7肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按12: 1混合共培養(yǎng)216小時(光鏡10 x 20)
圖8肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按12: 1混合共培養(yǎng)240小時(光鏡10 x 20)
具體實施例方式
以下通過具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但并不限于此。 實施例1乳豬肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共培養(yǎng)
將細(xì)胞數(shù)量比為12:1的乳豬肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞接種于含100 ml/L小牛 血清，125u/L胰島素，lOO)ig/L胰高血糖素，100Mg/L,氫化可的松，2. 0g/L NaHC03， 10萬U/L青霉素的pH為7. 2的畫EM培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板上，置于恒 溫37'C, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后倒去培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)液沖3 次，每天換液。
以下通過實驗來說明乳豬肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞單獨培養(yǎng)、共培養(yǎng)情況下 的培養(yǎng)效果 一.材料和方法
1. 實驗動物實驗乳豬由云南省原種豬場提供，日齡小于20天，體重小于5kg, 健康，雌雄不限，實驗前4小時斷乳，清潔皮毛后備用。
2. 主要試劑 collagenase IV、臺盼藍(lán)(trypan blue) 、 L-谷氨酸鈉、D-葡萄
糖丙酮酸鈉購自美國Sigma公司；新生小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；DMEM 培養(yǎng)基為Gibic公司；Percoll細(xì)胞分離液購自Pharmacia公司；注射用青霉素、 鏈霉素為華北制藥股份有限公司；肝素、HEPES、氯化按、EDTA、 NaH2P042H20、 地塞米松、胰島素、硫噴妥鈉、肝素、Nacl、 Kcl、 Na2HP04. 12&0等均為國產(chǎn)制 劑和分析純；D-Hanks液、PBS、 Percol 1工作液均為自制。 3.乳豬肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞的分離 3. l.乳豬肝實質(zhì)細(xì)胞的分離
以2. 5%硫噴妥鈉(0. 6—lml/kg)腹腔注射麻醉乳豬，常規(guī)方法消毒皮膚鋪 單，沿腹正中線開腹。暴露門靜脈、腸系膜上靜脈等并注入肝素鈉100—150u，沿 門靜脈插管并固定。結(jié)扎肝動脈，胃左右靜脈脾靜脈腸系膜下靜脈等。保留 門靜脈插管，離斷肝臟韌帶及其它血管及系膜并將肝臟移入無菌篩網(wǎng)中夾閉肝 下腔靜脈，先自門靜脈灌注前灌注液，速度為350ml/min,待肝臟充盈后打開肝 下腔靜脈并繼續(xù)灌注直至流出液清晰為止(約2000ml， 6min)。再循環(huán)灌注酶灌 流液，速度為7Qml/min,直至肝臟變軟，包膜發(fā)亮為止停止灌注(約400ml ),將 肝臟置入預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中頓性撕裂肝組織，去除包膜和筋膜，加入D-Hanks 液終止消化后，以100目篩網(wǎng)過濾離心洗滌3次100g/min, 3min。所得下層及單個 肝細(xì)胞。
3. 2. Kupffer細(xì)胞分離
用percoll液密度梯度離心法分離Kupffer細(xì)胞。取l/2混合肝細(xì)胞懸液用 200目尼龍網(wǎng)過濾除去肝細(xì)胞團(tuán)塊等，50g 3min，離心除肝實質(zhì)細(xì)胞，上清再以 300glOmin離心，沉淀細(xì)胞重復(fù)洗滌一次后用20ml PBS液垂懸待用。將25ml肝非 實質(zhì)細(xì)胞液鋪于兩層percoll液上，800g/min，40C, 20min離心，整個離心管的液 體分成四層，kupffer細(xì)胞位于第三帶50y。層，收集該帶細(xì)胞用等體積的PBS液稀
釋，40C下900g離心10min,DMEM培養(yǎng)液垂懸肝細(xì)胞。Kupffer細(xì)胞經(jīng)免疫組織化
學(xué)染色鑒定。
4. 培養(yǎng)條件 按實驗分組將肝細(xì)胞和/或K叩ffer接種于含100 ml/L小牛血 清，125u/L胰島素，lOOiag /L胰高血糖素，lOOpg/L,氫化可的松，2. Og/L NaHC03， 10萬U/L青霉素的畫EM培養(yǎng)基(pH7. 2)的6孔培養(yǎng)板上，置于恒溫 37°C, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后倒去培養(yǎng)上清，用少量培養(yǎng)液沖3 次，每天換液。
5. 實驗分組 A組空白對照組
B組單純肝細(xì)胞培養(yǎng)組
C組單純Kupffer細(xì)胞培養(yǎng)組
D組肝細(xì)胞Kupffer細(xì)胞(8: 1 )組
E組肝細(xì)胞Kupffer細(xì)胞(12: 1 )組
F組肝細(xì)胞Kupffer細(xì)胞(16:1)組
6. 肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞的形態(tài)觀察及功能檢測
6. l肝細(xì)胞及K叩ffer細(xì)胞形態(tài)觀察用倒置顯微鏡及全自動顯微攝影裝置動態(tài)
觀察記錄培養(yǎng)中肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞的生長情況及其形態(tài)學(xué)改變。
6. 2白蛋白濃度的測定在Olympus AU-2700全自動生化分析儀上采用溴甲酴綠
法測定培養(yǎng)的i-io天內(nèi)加有氯化銨的細(xì)胞培養(yǎng)上清白蛋白的含量。培養(yǎng)上清白
蛋白的測定采用標(biāo)準(zhǔn)的溴甲酚綠法在Olympus AU2700全自動生化分析儀測定， 釆用Olyrapus公司的配套試劑并按照操作手冊方法進(jìn)行檢測。 6. 3安定轉(zhuǎn)化功能測定在培養(yǎng)基中加入30mg/L安定標(biāo)準(zhǔn)品培養(yǎng)24h后，用高 效液相色譜儀測定上清中安定的濃度，連續(xù)10天取樣分析。該方法由發(fā)明者課
題組制定(見文獻(xiàn)韋嘉(通訊作者).體外培養(yǎng)肝細(xì)胞安定代謝能力的高效液
相測定法.肝臟2008， 2: 129-131)
6. 4醋氨酚清除功能測定在培養(yǎng)基中加入50mg/L醋氨酚標(biāo)準(zhǔn)品培養(yǎng)24h后，
用自動熒光偏振免疫法測定上清中醋氨酚的濃度，連續(xù)10天取樣分析。熒光偏 振血藥濃度檢測儀型號為TDxFLx，配套試劑及儀器均為美國雅培公司，按照操 作手冊方法進(jìn)行檢測。
表1 前灌流液和酶灌流液的配制組成
前灌流液用時其中每升加入地酶灌流液用時其中每升加入地塞米松 塞米松4Qmg，葡萄糖1.0g,青4Qmg,葡萄糖1. Og,青鏈霉素各0. lg, 鏈霉素各O. lg，最后用NaOH調(diào)最后用NaOH調(diào)至PH 7.4,過濾除菌，4 至PH 7. 3，過濾除菌，4 。C保存，。C保存，37。C水浴加熱。其中膠原酶臨
37 r水浴加熱。 用時再加入。
g/L
組分
g/L
NaCl8. 176NaCl8. 0
KC10. 403Kcl0. 4
Na2HPO,0. 114Na2HP04.12H200.151
HEPES5. 958NaH2P04.2H200. 078
EDTA2. 253HEPES2. 38
L-谷氨鈉0. 336CaC120. 56
D-葡萄糖0. 129Collage 40. 5
丙酮酸鈉0. 253Tryps ininhibi tor0. 05
MC032. 1NaHC030. 35
DMEM培養(yǎng)基的組成稱量匿EM13. 4g; NaHCO山2g; HEPES10. 0ml (1. 5mol/L) 調(diào)節(jié)PH7.2，三蒸餾水加至1L,其它組分的終濃度見下表2。加入孔徑O. 22，
過濾除菌，分裝，4。C儲存。
表2 DMEM培養(yǎng)基中其它成分及濃度
成分終濃度
EGF20ng/ml
地塞米松40 |i g/ml
胰島素lOjig/ml
胰高血糖素10|ig/ml
NGF100 (ig/ml
矽酸鈉10-5mol/ml
亞油酸10-5mol/ml
1oy。胎牛血清100ml
7.統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)值以^+s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析
二、試驗結(jié)果
l.肝細(xì)胞及K叩ffer細(xì)胞產(chǎn)率、活率及細(xì)胞總數(shù)
經(jīng)改良的灌流系統(tǒng)對乳豬肝臟行膠原酶離體灌流，每頭乳豬新鮮分離的肝 細(xì)胞總數(shù)達(dá)(3. 5士l.l)x109,細(xì)胞活率達(dá)(92士 2)% , K叩ffer細(xì)胞的產(chǎn)量平均 為(2. 35±0. 5) x108,純度為(95±4) %。
2. 肝細(xì)胞及K叩ffer細(xì)胞形態(tài)觀察
剛分離的肝細(xì)胞為透亮、呈球形且邊界清晰，其間有少數(shù)非實質(zhì)細(xì)胞(圖1); 剛分離的枯否細(xì)胞為球形，右上角為聚集的肝實質(zhì)細(xì)胞團(tuán)塊(圖2)。
3. 肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞的單獨培養(yǎng)及二者不同比例混合培養(yǎng)生長、存活狀況
各培養(yǎng)組中成活的肝細(xì)胞均從2~3h開始貼壁，至24h活細(xì)胞全部貼壁， 死細(xì)胞則漂浮于培養(yǎng)液上清中；成活的K叩ffer細(xì)胞至2h全部貼壁。
單獨培養(yǎng)的Kupffer至148小時時，細(xì)胞生長良好，極度伸展，呈梭形(圖 3)，培養(yǎng)至216小時時，細(xì)胞死亡達(dá)50%。
肝細(xì)胞單獨培養(yǎng)組，肝細(xì)胞于一周后即開始出現(xiàn)少量的死亡細(xì)胞漂浮，隨 培養(yǎng)時間的延長，漂浮細(xì)胞明顯增多，且細(xì)胞生長增值緩慢，至細(xì)胞培養(yǎng)216 小時時細(xì)胞基本全部死亡(圖4)。
肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按8: 1混合共培養(yǎng)216小時后可見肝實質(zhì)細(xì)胞多數(shù)死亡；
剩下的枯否細(xì)胞仍有存活(圖5)，肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按16:1混合組細(xì)胞多數(shù) 已死亡(圖6);
12:1組肝細(xì)胞的生長、增殖較其他比例共同培養(yǎng)組和肝細(xì)胞單獨組的細(xì)胞 增殖迅速，細(xì)胞貼壁后體積變大，逐漸鋪展開來，向正常肝細(xì)胞的形態(tài)演變， 呈島嶼狀或條索狀，共培養(yǎng)216小時后可見細(xì)胞生長良好，呈集落生長(圖7), 肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞按12: 1混合共培養(yǎng)240小時后可見肝實質(zhì)細(xì)胞多數(shù)仍存活， 部分死亡，密度較前稀疏(圖S),培養(yǎng)至3周時細(xì)胞全部死亡。 5.安定轉(zhuǎn)化功能及醋氨酚清除功能檢測
每隔24小時換液一次，以1000r/min離心去除細(xì)胞碎片，并分別采用高效
液相色譜儀和自動熒光偏振分析儀檢測對安定和醋氨酚藥物的清除效果。 5. l安定轉(zhuǎn)化功能
表3 不同培養(yǎng)組安定轉(zhuǎn)化功能比較(單位mg/L)
組別 N 安定濃度；士s
對照(A) H 29. 3650±0. 38839
K卯ffer組(B) 10 29. 1488±0. 23953
肝細(xì)胞組(C) 10 25. 4975±1. 33698
8: 1組(D ) 10 25. 4531±1. 55508
12: 1組(E) 10 23. 7881土1. 00529*
16: 1組(F)_^_24. 7981±0. 99440
*經(jīng)方差分析兩兩比較E組與A、 B、 C、 D組比較安定濃度顯著降低(P<0. 05 )。 5. 2醋氨酴清除功能檢測
表4 對乙酰氨基酚清除功能比較(單位mg/L)
組別 N 醋氨酚^s
對照(A) 44, 4395±0. 89466~
Kupffer組(B) 1 0 40. 4400±0. 40057
肝細(xì)胞組(C) 10 38. 5270±2. 31004
8: 1組(D) 10 39. 3230±2. 36752
12: 1組(E) 10 33. 6430±1. 5168**
<formula>formula see original document page 16</formula>
"經(jīng)方差分析兩兩比較E組與A、 B、 C、 D和F組比較，對乙酰氨基酚濃度
顯著降低(P<0. 05)。
6.白蛋白測定結(jié)果
表5白蛋白測定結(jié)果(單位g/L) 組另'J n x + s
從表中顯示出12: l組的白蛋白合成水平較其他組高。 以上結(jié)果表明，當(dāng)肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞二者數(shù)量比例在8-16: l之間時， 能明顯延長肝細(xì)胞在體外的存活時間，尤其在二者比例為12: 1時，肝細(xì)胞在 體外存活時間最長，且能保持較好的合成、分泌、解毒功能。
' 10 3. 2000±0. 07071
b 10 3. 2700±0. 12517
e 10 3. 6200±0. 49677
|_d 10 3. 6000±0. 48477
12:1組6 10 3. 7100±0. 44833
16:l組t 10 3. 6300±0. 43410
照否獨u
對枯單ci^
權(quán)利要求
1.一種肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征是將肝細(xì)胞和Kupffer接種于含80-120ml/L小牛血清，110-135u/L胰島素，90-110μg/L胰高血糖素，90-110μg/L氫化可的松，1.0-3.0g/L NaHCO3，8-120萬U/L青霉素的pH為7-7.5的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)板上，置于恒溫37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后倒去培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)液沖洗，每天換液；其中肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比在9-151之間。
2、 如權(quán)利要求l所述的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征是 將肝細(xì)胞和K叩ffer接種于含100 ml/L小牛血清，12Su/L胰島素，lOO]dg /L胰高血糖素，lOOyg /L，氫化可的松，2.0g/L NaHC03, 10萬U/L青霉 素的pH為7. 2的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)板上，置于恒溫WC, 5%二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后倒去培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)液沖洗，每天換液。
3、 如權(quán)利要求2所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在 于肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比在10-14: 1之間。
4、 如權(quán)利要求3所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在 于肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比在11-13: 1之間。
5、 如權(quán)利要求4所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在 于肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞比例在12: 1。
6、 如權(quán)利要求5所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在 于肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞為哺乳動物的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞。
7、 如權(quán)利要求6所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于哺乳動物為乳豬、乳牛或人。
8、 如權(quán)利要求7所述的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在 于乳豬肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比為在9-15: 1之間。
9、 如權(quán)利要求8所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特征在 于乳豬肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比為在10-14: 1之間。
10、 如權(quán)利要求9所述的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特 征在于乳豬肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比為在11-13: 1之間。
11、 如權(quán)利要求10所述的肝細(xì)胞和K叩ffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)，其特 征在于乳豬肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞數(shù)量比為U:l。
12、 權(quán)利要求1-11任一所述的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共同培養(yǎng)技術(shù)在 構(gòu)建生物型人工肝支持系統(tǒng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在普通培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的體外共培養(yǎng)技術(shù)，其特征是將肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞以一定比例混合培養(yǎng)，可延長原代肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)時間，優(yōu)化肝細(xì)胞的功能，可用于構(gòu)建生物型人工肝生物反應(yīng)器、藥物學(xué)檢測、肝細(xì)胞移植等。
文檔編號C12N5/06GK101368170SQ20081014714
公開日2009年2月18日 申請日期2008年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月21日
發(fā)明者何凌滔, 嘉 韋 申請人:韋 嘉;何凌滔