專利名稱：一種實時熒光rt-pcr檢測h7亞型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測H7亞型禽流感病毒的試劑盒，特別是涉及 以一步法實時熒光RT-PCR反應技術早期、快速診斷H7亞型禽流感病毒感染的試劑盒。本 試劑盒可以檢測咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的AIV-H7 。
本發明的目的是提供一種使用一步法實時熒光RT-PCR技術來定性及定量檢測樣 品中AIV-H7的試劑盒，特別是涉及AIV-H7的早期感染在實驗室診斷中的應用。其基本原理 是利用一對寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉錄酶(RT酶)、 耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、RNA酶抑制劑(RNasin)、高質量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 以及Mg2+等RT-PCR反應緩沖液中，通過DA7600、ABI7500等市售的熒光PCR擴增儀實現靶 多核苷酸的循環擴增，從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。
本發明所提供的檢測樣品中AIV-H7的試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液(即 TRIZOL核酸抽提試劑)、RT-PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品和定量參考品并加 蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于 RT-PCR擴增反應液中用于靶多核苷酸擴增的正向引物AIV-H7-F和反向引物AIV-H7-R的序 列分別是5' -GAATACAGATAGACCCAGTGAAATTGA-3' (SEQ ID NO : 1)禾P 5' -GCAAATGAAAAC CAATCCCATT-3' (SEQ IDNO :2)。 根據本發明的一個優選實施方案，RT-PCR擴增反應液中用于靶多核苷酸擴增和監 測體系的寡核苷酸探針AIV-H7-P的序列是5' -CATGATGCCCCGAAGCTAAACCATAAG-3' (SEQ ID NO :3)。 根據本發明的另一個優選實施方案，其中RT-PCR擴增反應液由(a)耐熱DNA聚合 酶(Taq酶)、(b)逆轉錄酶(RT酶)、(c)RNA酶抑制劑(RNasin) 、 (d)脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs) 、 (e)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物，(f)能夠與雙鏈靶多核 苷酸的第二條鏈結合的反向引物，(g)和能夠與靶多核苷酸結合并且兩末端分別結合有熒 光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針組成。 根據本發明的另一個優選實施方案，其中用于RT-PCR擴增反應液中的最佳引物 濃度為0. 38 ii mol/L、探針濃度為0. 20 ii mol/L ;
根據本發明的另一個優選實施方案，其中用于RT-PCR擴增反應液中的鎂離子最
佳濃度為2. 0mmol/L、Taq酶最佳用量為5U/反應、RT酶最佳用量為100U/反應、RNasin最
佳用量為20U/反應、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳濃度為0. 21mmol/L。 根據本發明的另一個優選實施方案，其中用于RT-PCR擴增的最佳反應溫度和時
間為40。C逆轉錄25min ;然后94。C預變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環。 根據本發明的另 一個優選實施方案，其中陰性質控品為生理鹽水。 根據本發明的另一個優選實施方案，其中陽性質控品為含有擴增目標片段的體外
轉錄RNA，濃度為1. 0X1()4個EID50。 根據本發明的另一個優選實施方案，其中定量參考品為含有擴增目標片段的體外 轉錄RNA，包括4個濃度梯度1. OX 107個EID50、1. OX 106個EID50、 1. 0X 105個EID50、 1. 0X1()4個EID50。 本發明提供的一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測出AIV-H7的最低濃度 為1. OX 103個EID50，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。 本發明針對AIV-H7基因組保守基因片段設計特異引物和探針，可檢測出AIV-H7， 但不能檢測出非AIV-H7病原體，如新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病 毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、AIV-H5、 AIV-H9等，說明本試劑盒具有很好的特異 性。 本發明提供的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉 或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的AIV-H7 ;可為靈敏、快速早期診斷AIV-H7感染提供可 靠的實驗證據；同時由于能準確定量，所以可對療效進行有效監測。
圖1顯示線性與靈敏度參考品的檢測結果圖。針對模板數為1. OX 102 1. OX 108 個EID50的線性與靈敏度參考品進行實時熒光RT-PCR檢測分析，檢測結果表明，當病毒量 為1.0Xl(f個EID50時，檢測樣品的Ct值在32左右，即檢測靈敏度可到達1.0Xl(f個 EID50。 圖2顯示定量參考品擴增結果的標準曲線圖。針對模板數為1.0X104 1.0X107 個EID50的定量參考品進行實時熒光RT-PCR檢測分析，繪制得到的標準曲線斜率(Slope) 為-3. 5177，在Y軸截距(Interc印t)為43. 0125，相關系數的平方(R2) =0.9910。
圖3顯示3個陽性參考品的檢測結果圖。3個陽性參考品的熒光擴增曲線有明顯 指數增長期，并與設定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值分別為20. 70、23. 73、 28. 38，可明確判定為陽性。 圖4顯示10個陰性參考品的檢測結果圖。10個陰性參考品的擴增曲線平直或斜 向下且與閾值線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。10個陰性參考品分別為與AIV-H7 感染有相似癥狀的8種病毒樣品(新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病 毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、AIV-H5、 AIV-H9)以及2份正常禽類的咽喉拭子和 泄殖腔拭子樣品。 圖5顯示3個臨床陽性標本的擴增曲線。3個標本的Ct值分別是22. 58、24. 41、 27. 50，結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性。
具體實施例方式
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。 實施例1 :H7亞型禽流感病毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑的研制 1、引物和探針的設計通過對Genbank數據庫已有的AIV-H7核酸序列以及國內外
已發表文獻中報導的核酸序列進行序列比對分析，以AIV-H7基因組的基質蛋白編碼基因
(M基因)的保守片段為擴增靶位點，選擇無二級結構且高度保守的區段，根據引物探針設
計的基本原則，利用軟件，人工設計多對引物和探針。 2、樣本的選擇根據國內外相關文獻報道表明，可以選擇咽喉拭子、泄殖腔拭子、 肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品。
3、反應體系的建立與優化 樣品的準備以病毒培養鑒定為陽性的3份AIV-H7樣品作為陽性參考品；以病 毒培養鑒定為陰性的10份非AIV-H7樣品作為陰性參考品，分別為8種病毒樣品(新城 疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、 AIV-H5、AIV-H9)以及2份正常禽類的咽喉拭子和泄殖腔拭子樣品。分別用TRIZ0L提取上 述陽性參考品與陰性參考品的RNA，待用。 引物探針的篩選以上述1中設計的多組引物探針分別檢測上述的陽性參考品 與陰性參考品的RNA，經反復試驗，篩選出特異性、靈敏度和重復性好的最佳引物探針組合 (如序列表中SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :3)。 引物探針濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 0. 20 ii mol/L至0. 5 ii mol/L濃度梯度的引物和從0. 10 y mol/L至0. 5 y mol/L濃度梯度的 探針進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的引物濃度為0. 38 ii mol/L、探針濃度 為0. 20iimol/L。 Taq酶用量的優化在25 y L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 1U(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行RT-PCR反應，經多次重復試驗，最終確定 最佳的Taq酶用量為5U/反應。 RT酶用量的優化在25iiL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 50U(酶單位)至400U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定 最佳的RT酶用量為100U/反應。 RNasin用量的優化在25y L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應進行RT-PCR反應，經多次重復試驗，最終確定 最佳的RNasin用量為20U/反應。 dNTPs濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmo1/ L至0. 25mmol/L濃度梯度的dNTPs進行RT-PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的 d證s濃度為0. 21,1/L。 反應溫度的優化根據酶的活性和寡多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時 間進行了優化，經多次重復試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為4(TC逆轉錄25min ; 然后94。C預變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環。 4、靈敏度實驗將濃度為1. 0 X 109個EID50的滅活AIV-H7培養上清，10倍梯度稀釋成1. 0X1()8個EID50、1. 0X1()7個EID50、1. 0X1()6個EID50、1. 0X1()5個EID50、1. 0X104 個EID50、 1. OX 103個EID50、 1. OX 102個EID50作為線性與靈敏度參考品，進行實時熒光 RT-PCR檢測分析，當病毒量為1. 0X 103個EID50時，檢測樣品的Ct值在32左右，即檢測靈 敏度可到達1.0Xl(f個EID50(如附圖1所示)。 5、標本檢測以咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等作為待檢 標本，分別用TRIZOL提取標本的RNA后，經上述優化建立的核酸擴增體系檢測，結果表明 本試劑盒可以很靈敏的檢測出臨床標本中的AIV-H7。 實施例2 :H7亞型禽流感病毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其使用
1、制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50m1/管)1管、RT-PCR擴增反應
液(20iU/管)24管、陰性質控品aooia/管)i管、陽性質控品aooia/管)i管、定量
參考品(50iU/管)4管。 2、標本采集、運送和保存 2. 1適用樣本類型咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等。
2. 2樣品采集與前處理(注意無菌操作) 2. 2. 1活禽樣品——取咽喉拭子、泄殖腔拭子或新鮮糞便拭子，具體采集方法如 下 1)咽喉拭子采取時要將拭子深入喉頭及上腭裂來回刮3 5次，取咽喉分泌液；
2)泄殖腔拭子將拭子深入泄殖腔轉一圈沾取糞便；對于易造成損傷的小珍禽， 直接用拭子沾取適量新鮮糞便； 3)將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1. Oml PBS的離心管中，編號備用。
2. 2. 2內臟或肌肉樣品——用無菌鑷剪夾取待檢樣品2. Og于研缽中充分研磨，再 加10mlPBS混勻，或置于組織勻漿器中，加入10ml PBS勻漿，然后將組織懸液轉入無菌離心 管中3，000rpm離心10min，取上清液轉入離心管中，編號備用。 2. 2. 3血清或血漿——用無菌注射器直接吸取(不少于400iU)至無菌離心管中， 編號備用。 2. 3保存與運送采集或處理的樣本在2 8t:條件下保存應不超過24h ;若需長 期保存，須放置-7(TC冰箱，但應避免反復凍融(最多凍融3次)。采集的樣品密封后，采用 保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運送到實驗室。
3、檢測步驟
(l)RNA提取 A.取N個(N = 1管陰性質控品+待測樣本數)滅菌的1. 5ml離心管，作好標記。 B.每管分別加入600 ii 1 Trizol試劑，然后分別加入200 y 1的陰性質控品或待測
樣品上清液(充分混勻后吸取)，充分振蕩混勻15s，室溫靜置3 5分鐘； C.每管加入200 ii 1氯仿，上下顛倒混勻10秒后，12， OOOrpm離心4分鐘; D.小心吸取無色上層液體(注意不可觸及中間絮狀層)，轉移至新滅菌的1. 5ml
離心管，然后加入lOiU RNA提取液A(充分混勻后吸取)，充分吸打混勻，8，000rpm離心1
分鐘后，小心棄去所有液體；E.加入溶液C (確認已加入無水乙醇)800 iil，充分吸打混勻，8， OOOrpm離心1分
鐘，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)；
F.將離心管敞開蓋，擺在通風櫥中風干15分鐘(也可使用開放式加熱器于60°C干燥5分鐘，需防止樣本交叉污染)，然后加入30 1 DEPC H20，吸打混勻管中沉淀，得到白色的懸濁液，可直接用于檢測，也可存于-7(TC待用。
(2) RT-PCR反應與結果分析 分別取陰性質控品、標本、陽性質控品、定量參考品各5iU，加入PCR反應管中進行RT-PCR擴增。RT-PCR循環條件是40。C逆轉錄25min ;然后94。C預變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環。 反應結束后保存檢測數據文件。根據RT-PCR擴增結果所得到的曲線圖調節分析參數，使標準曲線(Std curve)窗口下的定量參考品標準曲線達到最佳(即相關系數的平方(R2) >0.97)(參見附圖2所示)。由附圖3可以看出，3個陽性參考品的熒光擴增曲線有明顯指數增長期，并與設定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值分別為20. 70、23. 73、28. 38;在附圖4中，由于10個陰性參考品的擴增曲線平直或斜向下且與閾值線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。最后由儀器自動分析計算出未知標本的測定數值。
實施例3 :應用H7亞型禽流感病毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒定量檢測臨床樣品 所有實驗過程在哈爾濱獸醫研究所國家禽流感參考實驗室完成，臨床樣品由哈爾濱獸醫研究所國家禽流感參考實驗室提供，包括咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本等樣品類型；標本RNA提取、RT-PCR反應與結果分析參照實施例2進行。
RT-PCR反應結束后，根據擴增曲線先調節分析參數，使標準曲線(Std curve)窗口下的定量參考品標準曲線達到最佳(即相關系數的平方(R2) >0.97)，然后分析臨床樣品。臨床樣品的檢測結果如附圖5所示3個臨床陽性標本擴增曲線的Ct值分別是22.58、24.41、27. 50，結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性；參照同一次試驗中定量參考品的標準曲線圖(如附圖2所示)可以判定3個臨床陽性標本的AIV-H7濃度分別為6. 42X 105個EID50、1. 94X 105個EID50、2. 56X 104個EID50。序列表〈110〉中山大學達安基因股份有限公司〈120〉 一種實時熒光RT-PCR檢測H7亞型禽流感病毒的試劑盒〈140〉〈141〉〈160>3〈210>1〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。〈400>1〈210>2
〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。〈400>2gc朋3tg3朋accaatccc3tt〈210>3〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。〈400>3catgatgccccgsmgcteaaccateag
權利要求
一種檢測樣品中H7亞型禽流感病毒存在的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液、RT-PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品和定量參考品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中RT-PCR擴增反應液包括耐熱DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，兩末端分別結合有熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針，其特征在于RT-PCR擴增反應液中用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別為正向引物AIV-H7-F5’-GAATACAGATAGACCCAGTGAAATTGA-3’；反向引物AIV-H7-R5’-GCAAATGAAAACCAATCCCATT-3’。
2. 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應液中所使用的寡核苷酸探 針AIV-H7-P的序列為5' -CATGATGCCCCGAAGCTAAACCATAAG-3'。
3. 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應液中正向引物濃度為 0. 38 ii mol/L、反向引物濃度為0. 38 y mol/L、寡核苷酸探針濃度為0. 20 y mol/L。
4. 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應液中耐熱DNA聚合酶的濃 度為5U/反應。
5. 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應液中逆轉錄酶的濃度為 100U/反應。
6. 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應液中RNA酶抑制劑的濃度 為20U/反應。
7. 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應液中脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs)的濃度為0. 21mmol/L。
8. 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于用于RT-PCR擴增的反應溫度和時間為 40。C逆轉錄25min ;然后94。C預變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環。
9. 根據權利要求l的試劑盒，其特征還在于所檢測的樣品可選自但不局限于咽喉拭 子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品。
全文摘要
本發明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術早期、快速診斷H7亞型禽流感病毒感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發明的試劑盒實現對咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的H7亞型禽流感病毒的快速早期檢測和定量分析。
文檔編號C12Q1/68GK101736091SQ200810218940
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月7日 優先權日2008年11月7日
發明者何蘊韶, 李明, 李 杰, 王秋泉, 程鋼, 胡守旺, 鄧中平, 高秀潔 申請人:中山大學達安基因股份有限公司