本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

伴隨著基因分子診斷技術(shù)的迅猛發(fā)展，PCR、RT-PCR、Real-Time PCR、LAMP等新技術(shù)正以其高特異性、敏感性和時(shí)效性慢慢地在取代傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)和生化鑒定等敏感性低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的檢測(cè)方法。同時(shí)由于臨床診斷技術(shù)的不斷提高，其對(duì)檢測(cè)技術(shù)的敏感性要求也越來越高，這里就包括檢測(cè)敏感性AS(analytical sensitivity)和臨床敏感性CS(clinical sensitivity)。例如呼吸道感染、腹瀉病原體感染、腦炎腦膜炎病原體感染等疾病常常是由多個(gè)混合病原體感染引起，如果僅僅檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)，臨床敏感性及其臨床的指導(dǎo)意義也會(huì)大大降低。

目前為了提高檢測(cè)敏感性多采用熒光定量PCR技術(shù)，熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR的基礎(chǔ)上在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在靶序列擴(kuò)增過程中，隨著PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加，并逐漸累積形成一條擴(kuò)增曲線，通過熒光擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性及定量分析的方法。

如今體外診斷行業(yè)依靠單重?zé)晒舛縋CR技術(shù)作為分子診斷工具已有二十多年，單重PCR檢測(cè)具有檢測(cè)通量低、檢測(cè)成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以解決單重PCR檢測(cè)通量低、檢測(cè)成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問題。

本發(fā)明示出一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括：

PCR體系中引入了與核酸模板互補(bǔ)的探針和特異性引物，設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，所述PCR擴(kuò)增循環(huán)的過程中，每個(gè)循環(huán)均在延伸步驟中進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度采集，并通過對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析；所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)；所述特異性引物標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)和引物熒光報(bào)告基團(tuán)；

所述PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，通過采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分析。

進(jìn)一步，所述通過實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析的步驟包括：

通過酶水解所述探針產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析。

進(jìn)一步，所述通過采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分析的步驟包括：

采集所述特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分析。

進(jìn)一步，所述特異性引物的5’端修飾標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)，所述特異性引物中間位置標(biāo)記引物熒光報(bào)告基團(tuán)。

進(jìn)一步，所述引物猝滅基團(tuán)與所述引物熒光報(bào)告基團(tuán)之間的間距為15-25nt。

進(jìn)一步，所述探針的Tm值高于所述特異性引物的Tm值5℃-10℃。

進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增程序包括；

預(yù)變性和酶激活溫度為95℃，時(shí)間為1min；

逆轉(zhuǎn)錄溫度為60℃，時(shí)間為30min；

cDNA預(yù)變性溫度為95℃，時(shí)間為1min；

變性溫度為95℃，時(shí)間為15s；

退火溫度為60℃，時(shí)間為30s；

延伸及熒光采集的溫度為72℃，時(shí)間為30s；

熔解曲線分析的溫度為55℃-95℃。

進(jìn)一步，所述特異性引物包括：目標(biāo)靶序列一特異性引物和目標(biāo)靶序列二特異性熒光引物；

所述目標(biāo)靶序列一特異性引物的核酸序列為：SEQ ID NO:1AAGAACACAGATCTCGAGGCTCTC和SEQ ID NO:2GTCTCCATTTCCATTTAGGGCATTC；

所述目標(biāo)靶序列二特異性引物的核酸序列為：SEQ ID NO:4[BHQ1]-TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]CC和SEQ ID NO:5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG。

進(jìn)一步，所述探針的核酸序列為：SEQ ID NO:3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例示出一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括：PCR體系中引入了與核酸模板互補(bǔ)的探針和特異性引物，設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，所述PCR擴(kuò)增循環(huán)的過程中，每個(gè)循環(huán)均在延伸步驟中進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度采集，并通過對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析；所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)；所述特異性引物標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)和引物熒光報(bào)告基團(tuán)；所述PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，通過采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分析。本發(fā)明是基于酶水解探針產(chǎn)生熒光信號(hào)及特異性引物擴(kuò)增后，產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)兩種技術(shù)原理，針對(duì)單色熒光通道中目標(biāo)靶序列一核酸的檢測(cè)采用酶水解探針的方式，目標(biāo)靶序列二的核酸的檢測(cè)使用采用熔解曲線的方式，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在單色熒光通道中同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)靶點(diǎn)的檢測(cè)和分析，本發(fā)明解決了傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法無法用一支反應(yīng)管里有限數(shù)量的檢測(cè)通道提高靶點(diǎn)檢測(cè)通量的問題，極大的提升了單管PCR反應(yīng)檢測(cè)的通量，為科研及臨床復(fù)雜的混合病原體感染檢測(cè)及多基因遺傳的檢測(cè)提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施例示出的一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的流程圖；

圖2為引物熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間的標(biāo)記位置做了不同間距的處理測(cè)得熒光強(qiáng)度圖；

圖3為檢測(cè)模板中只有甲型流感InfA時(shí)的熔解曲線；

圖4檢測(cè)模板中只有甲型流感InfA時(shí)的擴(kuò)增曲線；

圖5為檢測(cè)模板中只有甲型流感InfB時(shí)的熔解曲線；

圖6檢測(cè)模板中只有甲型流感InfB時(shí)的擴(kuò)增曲線；

圖7為檢測(cè)模板中既有InfA也有InfB時(shí)的熔解曲線；

圖8為檢測(cè)模板中既有InfA也有InfB時(shí)的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例示出一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，如圖1所示，所述方法包括：

S101，PCR體系中引入了與核酸模板互補(bǔ)的探針和特異性引物，設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，所述PCR擴(kuò)增循環(huán)的過程中，每個(gè)循環(huán)均在延伸步驟中進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度采集，并通過對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析；

其中，所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)；所述特異性引物標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)和引物熒光報(bào)告基團(tuán)；

S102，所述PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，通過采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分析。

進(jìn)一步，所述特異性引物的5’端修飾標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)，所述特異性引物中間位置標(biāo)記引物熒光報(bào)告基團(tuán)。

進(jìn)一步，所述通過對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析的步驟包括：

通過酶水解所述探針產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析。

進(jìn)一步，所述引物猝滅基團(tuán)于所述引物熒光報(bào)告基團(tuán)之間的間距為15-25nt。

在特異性引物設(shè)計(jì)中對(duì)引物熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間的標(biāo)記位置做了不同間距的處理，結(jié)果如圖2，其中1為引物熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間間距大于25nt，2為引物熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間間距為15-25nt，3為引物熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間間距小于15nt。

其中以這兩個(gè)基團(tuán)標(biāo)記位置相距15-25nt為最佳實(shí)驗(yàn)效果，當(dāng)間距大于25nt或者小于15nt實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不理想，其中以小于15nt效果最不好，分析可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)寡聚核苷酸長(zhǎng)度太短時(shí)，其標(biāo)記的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)在單鏈和雜合雙鏈時(shí)熒光產(chǎn)生效率均不高，這應(yīng)該是由熒光基團(tuán)的熒光一直被猝滅基團(tuán)所猝滅所導(dǎo)致。

本發(fā)明中所提供的方法為一種在單色熒光通道中進(jìn)行雙靶點(diǎn)檢測(cè)的多重?zé)晒釶CR技術(shù)，更具體地說為一種實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)合終點(diǎn)熔解曲線分析的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，PCR體系中熒光的產(chǎn)生方式為酶水解探針產(chǎn)生熒光和特異性引物雜交產(chǎn)生熒光，兩種發(fā)生方式相結(jié)合。

本發(fā)明中提到的熔解曲線法實(shí)現(xiàn)方式為，在靶點(diǎn)的特異性引物的5’端標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)，在特異性引物中間位置標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)，引物猝滅基團(tuán)和引物熒光報(bào)告基團(tuán)之間的間距最后優(yōu)選為15-25nt，隨著PCR不斷的擴(kuò)增，PCR體系內(nèi)將會(huì)積累大量帶有熒光的擴(kuò)增靶序列片段，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線法分析，當(dāng)溫度低于擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)的Tm值時(shí)，帶熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物在體系中為相互雜交的DNA雙鏈狀態(tài),此時(shí)由于熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的物理位置較遠(yuǎn)，故而熒光報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光不能被猝滅基團(tuán)猝滅，體系可以檢測(cè)到熒光信號(hào)；當(dāng)溫度高于擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)的Tm值時(shí)，帶熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物在體系中以DNA單鏈的形式存在，這時(shí)由于寡聚核苷酸的分子柔性，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)與猝滅基團(tuán)的物理位置較近，進(jìn)而熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被猝滅基團(tuán)所猝滅，體系檢測(cè)不到熒光信號(hào)。

靶核苷酸序列特異性引物和探針的設(shè)計(jì)：

本發(fā)明中靶核酸序列特異性引物和探針設(shè)計(jì)，除了要考慮保證序列的保守性和特異性外，還需對(duì)選擇為熔解曲線法的靶點(diǎn)的引物作特殊修飾處理，即在特異性引物的5’端修飾標(biāo)記猝滅基團(tuán)，同時(shí)在特異性引物的中間修飾標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，其中猝滅基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)的間距優(yōu)選為15-25nt。

PCR反應(yīng)體系的配比：

多重反應(yīng)體系中，靶點(diǎn)Real time PCR反應(yīng)體系組成至少含有如下組份：PCR buffer、DNA聚合酶、dNTPs、引物、探針以及催化DNA聚合酶所需要的金屬陽離子。

本發(fā)明的優(yōu)選方案為：

SEQ ID NO:1AAGAACACAGATCTCGAGGCTCTC；

SEQ ID NO:2GTCTCCATTTCCATTTAGGGCATTC；

SEQ ID NO:3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC；

其中熒光報(bào)告基團(tuán)與猝滅基團(tuán)標(biāo)記的位置為：[熒光報(bào)告基團(tuán)]-CTGCAGTCCTCGC[T-猝滅基團(tuán)]CACTGGGCAC-[猝滅基團(tuán)]；

SEQ ID NO:4[BHQ1]-TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]CC；

SEQ ID NO:5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG；

本發(fā)明實(shí)施例示出的一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，根據(jù)靶核酸序列的保守性，選取保守性較好的區(qū)域，進(jìn)行擴(kuò)增的特異性引物和探針的設(shè)計(jì)，其中探針的Tm設(shè)計(jì)要高于特異性引物5-10℃，同時(shí)在探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，在探針的3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)。在擴(kuò)增開始時(shí)，探針與模板結(jié)合，隨后，DAN聚合酶的5’端→3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，從而熒光定量PCR擴(kuò)增儀可接收到熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，指數(shù)期時(shí)，產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，因此可以在反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測(cè)產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。

進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

預(yù)變性和酶激活溫度為95℃，時(shí)間為1min；

逆轉(zhuǎn)錄溫度為60℃，時(shí)間為30min；

cDNA預(yù)變性溫度為95℃，時(shí)間為1min；

變性溫度為95℃，時(shí)間為15s；

退火溫度為60℃，時(shí)間為30s；

延伸及熒光采集的溫度為72℃，時(shí)間為30s；

熔解曲線分析的溫度為55℃-95℃。

進(jìn)一步，所述在擴(kuò)增結(jié)束后繪制熔解曲線的步驟包括：

擴(kuò)增結(jié)束后每上升0.5℃采集一次熒光信號(hào)，繪制熔解曲線。

本發(fā)明的檢測(cè)方法為Real time RT-PCR，將RNA逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增結(jié)合起來，同時(shí)在PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。Real time RT-PCR反應(yīng)過程為：

1)cDNA合成；

2)cDNA預(yù)變性，時(shí)間和長(zhǎng)度取決于靶核苷酸長(zhǎng)度及堿基組成，預(yù)變性的溫度一般為90℃-105℃，時(shí)間一般為1-10min，預(yù)變性的目的為使雙鏈核苷酸序列徹底分離為單鏈；

3)變性，溫度一般為90℃-105℃，時(shí)間一般為10s-30s；

4)退火，使各引物退火檢測(cè)核酸的靶序列上。退火的溫度通常為40℃-60℃，退火的時(shí)間可以是10s-60s；

5)延伸，引物與模板結(jié)合，開始合成新的雙鏈DNA，延伸溫度一般為40℃-80℃，延伸時(shí)間可以是10s-5min。本發(fā)明實(shí)施例的優(yōu)選方案為：

結(jié)果分析：

當(dāng)該檢測(cè)通道只有72℃的擴(kuò)增曲線，且在溶解曲線分析時(shí)無熔解曲線峰時(shí)，該通道檢測(cè)結(jié)果為只檢測(cè)到設(shè)計(jì)為探針的目標(biāo)靶序列一；

當(dāng)該檢測(cè)通道沒有72℃的擴(kuò)增曲線，但在溶解曲線分析時(shí)有熔解曲線峰時(shí)，該通道檢測(cè)結(jié)果為只檢測(cè)到設(shè)計(jì)為熔解曲線檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二；

當(dāng)該檢測(cè)通道既有72℃的擴(kuò)增曲線，且在溶解曲線分析時(shí)有熔解曲線峰，則該通道檢測(cè)結(jié)果為既檢測(cè)到設(shè)計(jì)為探針的目標(biāo)靶序列一，又檢測(cè)到設(shè)計(jì)為熔解曲線的目標(biāo)靶序列二；

當(dāng)該檢測(cè)通道既沒有72℃的擴(kuò)增曲線，且在溶解曲線分析時(shí)也沒有熔解曲線峰時(shí)，該通道檢測(cè)結(jié)果為既沒有檢測(cè)到設(shè)計(jì)為探針的目標(biāo)靶序列一，又沒有檢測(cè)到設(shè)計(jì)為熔解曲線的目標(biāo)靶序列二；

為證明該發(fā)明方法的可行性，進(jìn)行了以呼吸道檢測(cè)為載體的研究：

其中1為甲型流感InfA；2為甲型流感InfB；3為甲型流感InfA和甲型流感InfB

其中在FAM通道中設(shè)計(jì)為探針檢測(cè)目標(biāo)靶序列一為：甲型流感InfA，設(shè)計(jì)為熔解曲線分析目標(biāo)靶序列二為InfB。測(cè)試結(jié)果為：

(1)當(dāng)檢測(cè)模板中只有甲型流感InfA時(shí)，結(jié)果如圖3和圖4所示，檢測(cè)中只有擴(kuò)增曲線而沒有熔解曲線峰；

(2)當(dāng)檢測(cè)模板中只含有InfB時(shí)，結(jié)果如圖5和圖6所示，檢測(cè)中沒有擴(kuò)增曲線而只有熔解曲線峰；

(3)當(dāng)檢測(cè)模板中既有InfA也有InfB時(shí)，結(jié)果如圖7和圖8所示，檢測(cè)中既有擴(kuò)增曲線也有熔解曲線峰；

可見，本發(fā)明是基于DNA聚合酶水解探針產(chǎn)生熒光信號(hào)及特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)的兩種技術(shù)原理，針對(duì)單色熒光通道中一個(gè)目標(biāo)靶序列一的檢測(cè)采用探針，目標(biāo)靶序列二的檢測(cè)使用采用熔解曲線的方式，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在單色的熒光通道中同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)靶點(diǎn)檢測(cè)和分析。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明的實(shí)施例示出一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括：PCR體系中引入了與核酸模板互補(bǔ)的探針和特異性引物，設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，所述PCR擴(kuò)增循環(huán)的過程中，每個(gè)循環(huán)均在延伸步驟中進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度采集，并通過對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析；所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)；所述特異性引物標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)和引物熒光報(bào)告基團(tuán)；所述PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，通過采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分析。本發(fā)明是基于酶水解探針產(chǎn)生熒光信號(hào)及特異性引物擴(kuò)增后，產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)兩種技術(shù)原理，針對(duì)單色熒光通道中目標(biāo)靶序列一核酸的檢測(cè)采用酶水解探針的方式，目標(biāo)靶序列二的核酸的檢測(cè)使用采用熔解曲線的方式，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在單色熒光通道中同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)靶點(diǎn)的檢測(cè)和分析，本發(fā)明解決了傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法無法用一支反應(yīng)管里有限數(shù)量的檢測(cè)通道提高靶點(diǎn)檢測(cè)通量的問題，極大的提升了單管PCR反應(yīng)檢測(cè)的通量，為科研及臨床的復(fù)雜的混合病原體感染檢測(cè)及多基因遺傳的檢測(cè)提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮說明書及實(shí)踐這里公開的發(fā)明后，將容易想到本發(fā)明的其它實(shí)施方案。本申請(qǐng)旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途或者適應(yīng)性變化，這些變型、用途或者適應(yīng)性變化遵循本發(fā)明的一般性原理并包括本發(fā)明未公開的本技術(shù)領(lǐng)域中的公知常識(shí)或慣用技術(shù)手段。說明書和實(shí)施例僅被視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由下面的權(quán)利要求指出。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不局限于上面已經(jīng)描述并在附圖中示出的精確結(jié)構(gòu)，并且可以在不脫離其范圍進(jìn)行各種修改和改變。本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求來限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南圣湘生物科技有限公司

<120> 一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Influenza virus type A

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gtctccattt ccatttaggg cattc 25

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<211> 24

<212> DNA

<213> Influenza virus type A

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ctgcagtcct cgctcactgg gcac 24

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<213> Influenza virus type B

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ttcaaatatc agacaaaaac aaaaccaatc c 31

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<212> DNA

<213> Influenza virus type B

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tgtctatttt gttgctttaa taatcgag 28