專利名稱：一種體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域。具體涉及體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法。
背景技術：
胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)是來源于胚胎胚泡期內(nèi)細胞團的多潛能細胞，具 有無限增殖能力和多向分化潛能(Evans MJ, 1981 Martin, 1981)。人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)被認為是細胞移植治療青少年糖尿病、Parkinson's病與心力衰竭 等疾病有前途的供體細胞(ThomsonJA，1998)，但是由于組織排斥和涉及到使用人類胚胎，其 應用受到限制。
最近，多個研究小組將四種轉(zhuǎn)錄因子基因通過病毒載體導入人類成體細胞，然后與小鼠 胚胎成纖維細胞(MEF)共培養(yǎng)，在體外獲得再程序化的胚胎干細胞人類多潛能千細胞(Lowry et al" 2008; Mali et al" 2008; Nakagawa et al., 2008; Park et al.， 2008; Takahashi et al" 2007b; Yu etal.,2007)。新近的報道證實，通過病毒載體導入Oct3/4和Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子基因，即可將人 成體細胞再程序化為多潛能干細胞(Danwei Huangfu, 2008)。這種誘導的多潛能干細胞(iPS細 胞)的特性與胚胎干細胞相似，具有向多種組織和細胞分化的潛能，有可能培育出患者特異的 多潛能干細胞用于疾病治療。
但是，上述研究得到的多潛能干細胞均存在以下缺陷①誘導和培養(yǎng)人類多潛能干細胞 的過程均需與小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)共培養(yǎng)，這就可能導致小鼠來源的病原體感染人類 iPS細胞，限制了其臨床應用。②以病毒為載體的基因轉(zhuǎn)染方式雖然效率高，但是存在生物安全性問題。專利申請?zhí)枮?200810035462.1 "的發(fā)明公布了一種多潛能干細胞的制備方法，該方 案將6種轉(zhuǎn)錄因子基因通過病毒載體導入成體細胞，來誘導多潛能干細胞，旨在提高誘導效率。 但該方法仍然存在上述兩種缺陷，此外，6種外源基因轉(zhuǎn)入使誘導的多潛能干細胞基因組復雜 多變。
因此，要獲得具有臨床應用潛能的患者自身多潛能干細胞，仍需要探索新的方法。首先， 盡量減少轉(zhuǎn)入基因的數(shù)目，簡化誘導過程。其次，要使整個誘導和培養(yǎng)過程無異源飼養(yǎng)層細 胞，無異種血清。再次，要盡量避免采用病毒載體進行基因轉(zhuǎn)導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術問題在于提供一種體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法。 實現(xiàn)上述技術問題的技術方案如下
一種體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法，包括如下步驟
①將兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog轉(zhuǎn)入成體細胞，在無異源飼養(yǎng)層細胞條件下的誘導培 養(yǎng)液中培養(yǎng)，誘導獲得多潛能干細胞克隆；②將誘導獲得的多潛能干細胞克隆在胚胎干細胞 培養(yǎng)液中、在無異源飼養(yǎng)層細胞的條件下培養(yǎng)擴增，并維持其多向分化潛能。
優(yōu)選地，所述步驟①中，兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog以基因形式與質(zhì)粒載體連接，擴 增純化后轉(zhuǎn)入成體細胞；或兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog以蛋白質(zhì)形式轉(zhuǎn)入成體細胞。
優(yōu)選地，所述細胞誘導培養(yǎng)液是以DMEM為基礎培養(yǎng)液，添加輔助因子包括終濃度為 5-50叫/L的堿性成纖維細胞生長因子(fibrobiast growth factor-2, bFGF)、 5-50嗎/L的激活素 A(Activin A)、 5-50|Lig/L的轉(zhuǎn)化生長因子(3 (transforming growth factor (3， TGF(3)、 5-50嗎/L的表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )等細胞因子中的一種或多種和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶 抑制劑如0.5-2mmol/L丙戊酸(valproic acid, VPA)或者5-20nmol/L曲枯抑菌素(trichostatin A, TSA)。
優(yōu)選地，所述輔助因子終濃度為lOpgZL的堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2, bFGF)、 10pg/L的激活素A(ActivinA)、 10嗎/L的轉(zhuǎn)化生K因子(3 (transforming growth factor (J, TGF卩)、10|ig/L的表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )。
優(yōu)選地，所述DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑為1mmol/L丙戊酸或20nmol/L曲枯抑菌素。
上述無異源飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)條件包括①采用與成體細胞來源一致的自體細胞作為飼 養(yǎng)層細胞，如皮膚成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞作為飼養(yǎng)層細胞；和/或②在無飼養(yǎng)層培 養(yǎng)時，在胚胎干細胞培養(yǎng)液中添加細胞因子，包含5-50pg/L的胰島素樣生長因子(insulin growth factor, IGF)、 5-50pg/L的激活素A(Activin A)、 5-50嗎/L的轉(zhuǎn)化生長因子卩(transforming growth factor (3， TGFp)和5-50嗎/L的表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )。細胞培養(yǎng) 皿/培養(yǎng)板用基質(zhì)膠(matrigel)或20pg/ml層粘連蛋白(laminin)包被。
本發(fā)明說述的成體細胞來源于人或靈長類動物，包括成纖維細胞、骨髓干細胞、粘膜 上皮細胞、淋巴細胞、毛囊細胞等。
本發(fā)明所述的胚胎干細胞培養(yǎng)液是由knockout DMEM、 20pg/L堿性成纖維細胞生K:因 子、20嗎/L白血病生長抑制因子、2mmol/L glutamax-I、 0.055mmol/L p-巰基乙醇、非必需氨 基酸、10%血清替代物、10% plasmanate(商品化的人類血漿蛋白制劑)以及抗生素組成的培養(yǎng) 基。由本發(fā)明所產(chǎn)生的無飼養(yǎng)層來源的多潛能干細胞(no feeder cell conditions derived induced pluripotent stem cell, NOF-iPS)具有與胚胎干細胞(ES)相似的特性，這些特性包括增殖能力、 表達胚胎干細胞標記、形成包含內(nèi)、中、外三個胚層的組織和細胞的畸胎瘤。
與現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明的優(yōu)點在于-
① 僅僅采用Oct3/4與Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因子基因或其蛋白質(zhì)形式進行誘導，而非病毒載體 介導的轉(zhuǎn)基因，即可再程序化成體細胞為多潛能干細胞。
② 誘導和培養(yǎng)多潛能千細胞在無異源飼養(yǎng)層細胞條件下進行。
③ 由本技術獲得的自體多潛能干細胞具有更好的生物安全性、能在體外誘導分化為神經(jīng) 細胞、胰島細胞、心肌細胞等多各種細胞用于細胞替代治療。


圖1.無異源飼養(yǎng)層細胞條件下誘導和培養(yǎng)人多潛能千細胞的技術概圖2.在無異源飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)條件下細胞生長曲線圖3.在無異源飼養(yǎng)層條件下誘導和培養(yǎng)的NOF-hiPS RT-PCR分析示意圖4.在無異源詞養(yǎng)層條件下誘導和培養(yǎng)的NOF-hiPS使裸鼠致崎示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明為，在人成體細胞中，通過轉(zhuǎn)染試劑將Oct3/4與Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因子導入細胞， 在無異源飼養(yǎng)層細胞條件下'誘導形成人的iPS克隆。當克隆長至足夠大時'挑取克隆進一 步體外培養(yǎng)擴增。請參見圖l。在無異源飼養(yǎng)層細胞條件下，連續(xù)傳代培養(yǎng)人iPS，通過生長 曲線分析表明，無異源詞養(yǎng)層細胞條件誘導的人多潛能細胞(NOF-hiPS)增殖能力與人胚胎干細胞(hES)相似。請參見圖2。在無異源飼養(yǎng)層條件下，誘導和培養(yǎng)的NOF-hiPS表達胚胎千 細胞相關基因，并產(chǎn)生包含三個胚層的畸胎瘤。請參見圖3、圖4。 實施例1.
按現(xiàn)有技術，從人細胞樣本中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR技術擴增Oct3/4 與Nanog基因。將純化后的Oct3/4與Nanog基因與質(zhì)粒載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行擴增。
分離培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，在無詞養(yǎng)層細胞條件下，將純化后的，分別含10嗎Oct3/4 與10嗎Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因子基因的質(zhì)粒，用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000 (Invi加gen公司)轉(zhuǎn)染 人成體細胞，在細胞誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該細胞誘導培養(yǎng)液以DMEM為基礎培養(yǎng)液，添加了 終濃度為10照/L的人堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2, bFGF)、終濃度為 10(ig/L的激活素A(Activin A)、終濃度為10嗎/L的轉(zhuǎn)化生長因子p(transforming growth factor (3， TGFp)、終濃度為10(ig/L的表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )等細胞因子和DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑終濃度為lmmol/L的丙戊酸(valproic acid， VPA)。
轉(zhuǎn)染后第3天，將細胞消化傳代至自體飼養(yǎng)層細胞(與誘導的細胞來源一致的細胞)，再 換用胚胎干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。隔R換液，在倒置顯微鏡下觀察細胞，直至多潛能干細胞 克隆長出。當誘導的多潛能干細胞克隆長至足夠大時，通過形態(tài)學篩選，挑取多潛能干細胞 克隆至自體飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)擴增。
胚胎千細胞培養(yǎng)液根據(jù)現(xiàn)有技術，是由knockout DMEM、 2(^g/L堿性成纖維細胞生長因 子、20叫/L白血病生長抑制因子、2mmol/L glutamax-I、 0.055mmol/L p-巰基乙醇、非必需氨基酸、10%血清替代物、10%plasmanate以及抗生素組成的培養(yǎng)基。
篩選形態(tài)勻質(zhì)的克隆，進一步采用免疫細胞化學檢測其表面標記(AP、 SSEA3/4、 TRA-l-60、 TRA-l-81)、 RT-PCR檢測人ES標記基因表達，將其注入免疫缺陷小鼠分析其產(chǎn)生畸胎 瘤的能力。通過上述逐步篩選最終得到具有多向分化潛能的、具有臨床應用價值的人自身多 潛能干細胞。
用Trizol試劑提取NOF-hiPS細胞總RNA，通過RT-PCR分析顯示，在無異源飼養(yǎng)層條 件下，通過轉(zhuǎn)染Oct3/4與Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因子得到的NOF-hiPS細胞表達FGF4、Rexl、Nanog、 Oct3/4、 Daxl等人胚胎干細胞標記基因。這些標記基因在未轉(zhuǎn)染Oct3/4與Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因 子的人皮膚成纖維細胞中沒有表達。參見圖3。
在無異源飼養(yǎng)層條件下，誘導和擴增培養(yǎng)的NOF-hiPS注入裸鼠(免疫缺陷小鼠)后， 能形成畸胎瘤。通過組織病理切片和免疫組織化學分析顯示，NOF-hiPS形成的畸胎瘤包含內(nèi)、 中、外三個胚層的組織和細胞的，表明其具有多向分化潛能。參見圖4。
實施例2.
分離培養(yǎng)人成體細胞，在無異源飼養(yǎng)層細胞條件(無飼養(yǎng)層或采用與成體細胞來源 -致 的自體細胞作為詞養(yǎng)層細胞)下，將市售的，分別含20嗎Oct3/4與20嗎Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因 子蛋白轉(zhuǎn)入人成體細胞，并在誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)。該誘導培養(yǎng)液以DMEM為基礎培養(yǎng)液，添 加了終濃度為40嗎/L人堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2, bFGF)、 40|_ig/L激 活素A(Activin A)、 35pg/L轉(zhuǎn)化生長因子ji(transforming growth factor (3， TGFp)、 35pg/L表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )等細胞囚子和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑如20nmol/L 曲枯抑菌素(trichostatinA,TSA)(以上都為終濃度)。細胞在誘導培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)一段時間后，換用胚胎干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。所述胚胎 干細胞培養(yǎng)液由knockout DMEM、 20〖ig/L堿性成纖維細胞生長因子、20pg/L白血病生長抑 制因子、2mmol/L glutamax-I、 0.055mmol/L卩-巰基乙醇、非必需氨基酸、10%血清替代物、 10%plasmanate以及抗生素組成的培養(yǎng)基。隔日換液，倒置顯微鏡下觀察細胞，直至多潛能干細胞克隆長出。當誘導的多潛能干細 胞克隆長至足夠大時，將其全部消化傳代至自體詞養(yǎng)層細胞培養(yǎng)擴增。細胞達到足夠數(shù)量后， 再在無詞養(yǎng)層細胞條件下培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層細胞條件為在胚胎干細胞培養(yǎng)液中添加細胞因子，包含10pg/L胰島素樣生 長因子(insulin growth factor, IGF)、 10|ag/L激活素A(Activin A)、 lOpg/L轉(zhuǎn)化生長因子 (3(transforming growth factor p， TGFp)和10Mg/L表皮生長因子(以上都為終濃度)，細胞培養(yǎng) 皿/培養(yǎng)板用基質(zhì)膠(matrigel)或20pg/ml層粘連蛋白(laminin)包被。進一步采用免疫細胞化學檢測其表面標記(AP、 SSEA3/4、 TRA-l-60、 TRA-1-81)、 RT-PCR 檢測人ES標記基因表達，將其注入免疫缺陷小鼠分析其產(chǎn)生畸胎瘤的能力。通過上述逐步 篩選最終得到具有多向分化潛能的、具有臨床應用價值的人自身多潛能千細胞。實施例3.分離培養(yǎng)人(或猴)成體細胞，將Oct3/4與Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因子基因或蛋白轉(zhuǎn)染人(或猴)成體細胞。在無飼養(yǎng)層細胞條件(或采用與人成體細胞來源一致的自體細胞作為飼養(yǎng)層 細胞)下誘導多潛能干細胞，該細胞誘導培養(yǎng)液以DMEM為基礎培養(yǎng)液，添加終濃度為6pg/L 堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2, bFGF)、 6|ig/L激活素A(Activin A)、 6pg/L 轉(zhuǎn)化生長因子卩(transforming growth factor |3， TGFp)、 6pg/L表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )等細胞因子和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑如0.5mmol/L丙戊酸(valproic acid, VP A) 或lOnmol/L曲枯抑菌素(trichostatinA,TSA)，以上都為終濃度。
轉(zhuǎn)染后第3-5天，細胞換用胚胎干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。隔日換液，在倒置顯微鏡下觀 察細胞，直至多潛能千細胞克隆長出。當誘導的多潛能干細胞克隆長至足夠大時，通過形態(tài) 學篩選，挑取多潛能干細胞克隆至無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)擴增。細胞培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板用基質(zhì)膠 (matrigel)或20|ag/ml層粘連蛋白(laminin)包被。
所述無伺養(yǎng)層培養(yǎng)時，是指在胚胎干細胞培養(yǎng)液中添加細胞因子條件下培養(yǎng)，細胞因子 包含3(Vg/L胰島素樣生長因子(insulin growth factor, IGF)、 30jug/L激活素A(Activin A)、 30pg/L轉(zhuǎn)化生長因子p(transforming growth factor (3, TGF(3)和30pg/L表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF )，以上都為終濃度。
進一步采用免疫細胞化學檢測其表面標記(AP、 SSEA3/4、 TRA-l-60、 TRA-1-81 )、 RT-PCR 檢測人ES標記基因表達，將其注入免疫缺陷小鼠分析其產(chǎn)生畸胎瘤的能力。通過上述逐步 篩選最終得到具有多向分化潛能的、具有臨床應用價值的人自身多潛能干細胞。
本說明書的上述實例僅僅是為了清楚說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施 方式的限定。凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引申出的顯而易見的變動仍包含在本發(fā)明的保護 范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法，其特征是，包括如下步驟①將兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog轉(zhuǎn)入成體細胞，在無異源飼養(yǎng)層細胞條件下的誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)，誘導獲得多潛能干細胞克隆；②將誘導獲得的多潛能干細胞克隆在胚胎干細胞培養(yǎng)液中、在無異源飼養(yǎng)層細胞的條件下培養(yǎng)擴增。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導和培養(yǎng)多潛能T細胞的方法，其特征是，所述步驟① 中，兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog以基因形式與質(zhì)粒載體連接，擴增純化后轉(zhuǎn)入成體細胞； 或兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog以蛋白質(zhì)形式轉(zhuǎn)入成體細胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導和培養(yǎng)多潛能千細胞的方法，其特征是，所述細胞誘 導培養(yǎng)液是以DMEM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)液，添加終濃度為5-50pg/L的堿性成纖維細胞生長 因子、5-5(Vg/L的激活素A、 5-5(^g/L的轉(zhuǎn)化生長因子(B、 5-50pg/L的表皮生長因子中的一 種或多種，以及0.5-2mmol/L丙戊酸或5-20nmol/L曲枯抑菌素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外誘導和培養(yǎng)多潛能下細胞的方法，其特征是，添加的堿性 成纖維細胞生長因子的終濃度為10|ng/L、激活素A的終濃度為10|Lig/L、轉(zhuǎn)化生長因子(3的 終濃度為10ng/L、和表皮生長因子的終濃度為l(Vg/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法，其特征是，所述丙戊酸 的終濃度為lmmol/L，所述曲枯抑菌素的終濃度為20nmol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法，其特征是，所 述無異源飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)條件為采用與成體細胞來源一致的自體細胞作為飼養(yǎng)層細胞； 和/或在步驟②時為無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，在胚胎干細胞培養(yǎng)液中添加細胞因子，該細胞因子包括有5-5(Vg/L胰島素樣生長因子、5-50pg/L激活素A、 5-50|ig/L轉(zhuǎn)化生長因子(3、和5-50pg/L表皮生長因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法，其特征是，所述成體細 胞為人或靈長類動物的成纖維細胞、骨髓干細胞、粘膜上皮細胞、淋巴細胞、或毛囊細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外誘導和培養(yǎng)多潛能干細胞的方法，該方法包括如下步驟將兩種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4與Nanog轉(zhuǎn)入成體細胞，在無異源飼養(yǎng)層細胞的條件下的細胞誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)，誘導獲得多潛能干細胞克隆；將誘導獲得的多潛能干細胞克隆在胚胎干細胞培養(yǎng)液中、在無異源飼養(yǎng)層細胞的條件下培養(yǎng)擴增，并維持其多向分化潛能。采用本發(fā)明產(chǎn)生的多潛能干細胞可避免移植排斥反應；無異源飼養(yǎng)層條件誘導的多潛能干細胞具有更好的臨床應用價值；采用Oct3/4和Nanog兩種轉(zhuǎn)錄因子基因或直接轉(zhuǎn)入相關蛋白，技術更簡潔，生物安全性更高。
文檔編號C12N5/10GK101402943SQ20081021913
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日
發(fā)明者堅 葛, 陳夢飛 申請人:中山大學中山眼科中心