專利名稱：：大白菜核質(zhì)互作雄性不育的srap標記及其用于輔助選擇育種的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的蔬菜品種選育與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及白菜的品種選育和分子標記輔助選擇育種方法，特別是一種大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記及其用于輔助選擇育種的應(yīng)用。近三十多年以來，植物雄性不育一直是作物遺傳育種、生物學研究的熱門領(lǐng)域。細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmicmalesterility,CMS)是其中最有利用價值的雄性不育類型。而以葉球為產(chǎn)品的大白菜，雖然不需要恢復(fù)系，利用方便，但用攜帶恢復(fù)基因的材料選育不育系程序麻煩、周期長，采用分子標記技術(shù)可以在苗期判斷是否帶有可育基因和不育基因、加快選育步伐。西北農(nóng)林科技大學園藝學院蔬菜科學系自20世紀70年代開展大白菜雄性不育研究，先后育成了CMS3411-7和CMS7311等不同來源、不同性狀的大白菜異源胞質(zhì)雄性不育系，并應(yīng)用于雜交一代大白菜制種。由于傳統(tǒng)的育性表型選擇要等到開花，通過田間直接觀察完成。對于攜帶恢復(fù)基因的優(yōu)良材料，要將其轉(zhuǎn)育為不育系，必須經(jīng)過雜交，自交，同時用不育系測交判斷其基因型等過程，操作起來費時費力，周期長，育種進程慢。為了加快大白菜胞質(zhì)雄性不育育種速度，采用現(xiàn)代生物技術(shù)，進行分子標記輔助育種十分迫切。分子標記是近年來研究的熱門領(lǐng)域，它以DNA為研究對象，具有以下顯著的優(yōu)越性(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物體的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否的問題；(2)數(shù)量極多，遍及整個基因組，可檢測到的基因座位幾乎是無限的；(3)多態(tài)性高，自然界存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；(4)表現(xiàn)為"中性"，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；'(5)有許多分子標記表現(xiàn)為共顯性(codominance),能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息，因而現(xiàn)已形成許多分子標記系統(tǒng)。SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism,SRAP)是由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性(sequencebasedamplifiedpolymorphism,SBAP)，作為——禾中新的分子標記技術(shù)，SRAP具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率的特點，在基因組中分布均勻，高頻率的共顯性則明顯優(yōu)于AFLP標記。SRAP是基于PCR的分子標記技術(shù)，具有與RAPD同樣的操作簡便性，僅在擴增產(chǎn)物的檢測上采用較復(fù)雜的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染技術(shù)，但是與瓊脂糖凝膠檢測相比，分辨率大大提高，而且不使用溴化乙錠，不會造成環(huán)境污染，減少操作危險性。多次重復(fù)試驗結(jié)果穩(wěn)定，克服了RAPD重復(fù)性穩(wěn)定性差的缺點。與AFLP相比，它無須繁瑣的操作，成本較低。SRAP的上游引物和下游引物可以通用，兩兩搭配組合，省卻了引物開發(fā)的困難，減少了合成引物的費用，同時也大大提高了引物的使用率。總之，分子標記不受基因表達時間、顯隱關(guān)系、環(huán)境因素等條件影響，利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記可在生育早期階段進行選擇，減少了選擇的盲目性，縮短了育種年限，從而可以大大提高育種效率，加快育種進程。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于。提供一種大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記及其采用該SRAP標記用于輔助選擇育種的應(yīng)用。本發(fā)明采用SRAP技術(shù)，尋找與育性基因緊密連鎖的SRAP分子標記，為開展大白菜核質(zhì)互作雄性不育分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記，其特征在于，該SRAP標記是特異片斷Rf24-5-3和特異片斷ms16-23-3，特異片斷Rf24_5-3的全長為366bp，特異片斷msl6-23-3的全長為372bp，其核酸序列分別為特異片斷Rf24-5-3:7!S46Ta:AWa;6^4/47GCTAACCTAACCGACTATTMCTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTATTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTA6TC7m^CgCC。特異片斷msl6-23-3:7^6TO:yU4a76^y47GCTAACCTAACCGACTATTMCTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACCATTTATCTTCTTTACMAMGTCMCTCTTTCCTTATCAGMTCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTA67r^77T67^C6K^7r。上述特異片斷Rf24-5-3及特異片斷msl6-23-3的兩端為SRAP引物，其序列為Me3:5'TGAGTCCAAACCGGAAT3'17bpEm3:5'GTCTGCGTACGMTTGAC3'18bp上述大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記，經(jīng)發(fā)明人的實驗證明，能夠用于輔助選擇育種的應(yīng)用。其輔助選擇育種的方法是，首先進行大白菜核質(zhì)互作雄性不育系與優(yōu)良恢復(fù)系雜交、然后單株自交得到F2代育性分離群體材料，接著進行單株DNA提取，SRAP引物擴增，SRAP標記在分離群體中分離規(guī)律分析，帶有陽性SRAP標記單株的選擇，具體包括下列步驟-1)基因重組群體材料的準備以大白菜核質(zhì)互作雄性不育系和恢復(fù)系雜交，單株自交，選取100粒200粒飽滿的F2代種子和親本種子催芽春化后播種于大田，在幼苗期給F2單株編號，于苗期取幼苗嫩葉片提取DNA備用，開花期鑒定植株育性；2)DNA提取A.取0.2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，塞入1.5mL的離心管中，放入液氮中速凍，用75%酒精浸泡過的干凈塑料研磨棒迅速研磨至粉末；B.向離心管中加700uL經(jīng)65。C預(yù)熱的1XCTAB提取液，提取液的配方是CTAB2%，Tris-HC110Ommol/L，EDTA20ramol/L，NaCl1.4mol/L，再加入8uLP-巰基乙醇，迅速混勻；C.隨后將離心管放入65'C水浴中，每間隔5min分鐘搖一次，水浴30min;D.取出離心管，加入與離心管內(nèi)的液體等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中，酚氯仿異戊醇=25:24:1，搖勻15min后，常溫下12000r/min離心10min;E.將上層液相(約700"L)轉(zhuǎn)移到另一離心管中，并加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，輕輕搖勻10min，常溫下12000r/min離心10min;'F.取上清(約500uL)，加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20。C條件下沉淀30min，4。C條件下12000r/min離心10min;G.棄上清，加入500ul75%乙醇洗滌沉淀2次，沉淀物室溫晾干；H.加入500uLTE緩沖液溶解DNA，加入0.3yLRNaseA(10Ug/uL)，混勻后離心，37。C保溫30min;I.待DNA完全溶解后，加入3mol/LNaAC溶液50uL和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-2(rC條件下沉淀30min;J.在4。C，12000r/m條件下離心10min，棄上清，加入75%的乙醇清洗沉淀12次，后加入75%乙醇，-20。C保存?zhèn)溆茫惶崛〉腄NA，經(jīng)純度檢測，證實純化較好，一般用滅菌的400500uLddH20稀釋，存于4。C中備用；3)SRAP—PCR擴增SRAP-PCR擴增在25uLPCR反應(yīng)體系中進行，反應(yīng)體系中有10XPCR緩沖液2.5uL，7鄰DNA聚合酶lUnit,MgCl2濃度為3.0mmol/L，上、下游特異性引物濃度分別為0.2umol/L，4種dNTP濃度各為0.2mmol/L，模板DNA40ng;PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94°C/5min、94°C/60s、35°C/60s、72°C/60s，4個循環(huán)后，94°C/60s、50°C/60s、72°C/60s,從第六步開始35個循環(huán)，72。C延伸lOmin;電泳將擴增產(chǎn)物與5uL的6XLoadingbuffer混勻，取4uL點入6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中，在250V下電泳2.5h,經(jīng)0.29&AgN03染色后用數(shù)碼相機照相，以DL2000marker為標準分子量；4)SRAP標記與細胞質(zhì)雄性不育性狀的連鎖關(guān)系針對目標基因的重組F2及F3群體，統(tǒng)計純合型雄性可育的單株、純合型雄性不育的單株和雜和型雄性可育單株中SRAP標記的數(shù)量，me3em3-366與可育核基因之間的交換值為3.876%,me3em3-372與不育核基因之間的交換值為4.142%。表明366bp帶與可育基因連鎖，372bp帶與不育基因連鎖。5)SRAP標記的特征及其選擇策略該SRAP標記為共顯性標記，在純合可育單株中能夠擴增me3em3-366特異帶、不育單株中能夠擴增me3em3-372特異帶、雜合可育單株同時具有兩條帶；對于重組分離群體，只要后代單株中檢測存在特異條帶me3em3-36就一定攜帶可育核基因，存在特異條帶me3em3-372就一定攜帶不育核基因，無需等到開花時期選擇，通過SRAP標記間接選擇育性性狀，能夠早期、快速、準確選擇分子育種。本發(fā)明對258個F2群體單株DNA用SRAP引物進行PCR擴增表明，在186個雄性可育株中183株有366bp特異帶，72個雄性不育株中65株無366bp特異帶，重組型植株10株，占總植株數(shù)的3.876%,即366bp標記帶與可育基因之間的交換值為3.876%。對186株可育株自交后代觀察得到了122株的育性分離結(jié)果，占65.6%，其中40個純合雄性可育株中38株有372bp特異帶，82雜合雄性可育株中77株有372bp特異帶，考慮到&可育株家系群體縮小，對不育株按相同比例縮小為47個雄性不育株都有372bp特異帶，重組型植株7株，占總植株數(shù)的4.142%，即372bp標記帶與不育基因之間的交換值為4.142%。在觀察的122個F3株系中，113個株系的育性表現(xiàn)與其F2單株的特異標記相一致，準確性達92.62%。圖1是CTAB法提取的大白菜基因組DNA檢測圖，其中M:DNA標準分子量入-DNA;1-16:隨機選取的16個單株DNA;圖2是可育池與不育池特異引物的篩選圖，其中M:DNA標準分子量DL2000;箭頭所指的為可育池中擴增出的特異譜帶me3em3-366;F:可育池DNA;S:不育池DNA;圖3是引物me3em3對親本和建池單株的檢測結(jié)果圖，其中M:DNA標準分子量DL2000;F:可育池DNA;S:不育池DNA;C:恢復(fù)系；F1:雜交一代；A:不育系；1-10:可育單株；11-20:不育單株；2，6:純合可育單株;18:交換單株；圖4是me3em3引物對F2單株檢測結(jié)果圖，其中M:DNA標準分子量DL2000;2卜32:可育單株；33-44:不育單株；26，30-32:純合可育單株；圖5是me3em3特異標記在其它材料中的檢測結(jié)果圖，其中M:DNA標準分子量DL2000;F:可育DNA池；S:不育DNA池；45-47:不育系06J37;48-50:恢復(fù)系01S275-3;51-53:恢復(fù)系01S279-3;54-67:F^代;以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的利用大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記進行分子輔助選擇育種方法對本發(fā)明作進一步的詳細說明。具體實施例方式本發(fā)明以大白菜胞質(zhì)雄性不育系06J45、恢復(fù)系01S325-1，及其雜交產(chǎn)生的R代、F2群體、F3家系為標記篩選材料，以不育系06J37、恢復(fù)系01S275-3、01S279-3及2個不育系06J452、06J37和3個恢復(fù)系01S325-1、01S275-3、01S279-3的17個Fi代群體為驗證材料。研究利用SRAP技術(shù)篩選與細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的特異性引物，進一步對特異片段克隆測序，通過&代及F3家系分離表現(xiàn)，計算連鎖距離，將SRAP標記應(yīng)用于分子育種。首先進行特異性引物篩選，特異性條帶的克隆測序，SRAP引物的驗證與分離群體分離規(guī)律分析。具體如下1.大白菜細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)性及不育性的遺傳分析對06J45X01S325-1的&分離群體258株植株進行了育性調(diào)査，結(jié)果雄性可育株186株，雄性不育株72株，經(jīng)x2測驗表明雄性可育與雄性不育的分離符合3:l(x。2二1.013，x。。s,=3.841)，表明該雄性不育系的育性恢復(fù)由單個顯性基因控制，不育性由一對隱性基因控制。2.小量法DNA提取12A.取0.2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，塞入1.5mL的離心管中，放入液氮中速凍，用75%酒精浸泡過的干凈塑料研磨棒迅速研磨至粉末；B.向離心管中加700uL經(jīng)65-C預(yù)熱的1XCTAB提取液，提取液的配方為CTAB2%，Tris-HC1100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L;再加入8uLP-巰基乙醇，迅速混勻；C.隨后將離心管放入65t:水浴中，水浴30min，中間每間隔5min分鐘搖一次；D.取出離心管，加入與離心管內(nèi)液體等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中，酚氯仿異戊醇=25:24:1,搖勻15min后，常溫下12000r/min離心10min;E.將上層液相(約700uL)轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，輕輕搖勻10min，常溫下12000r/min離心10min;F.取上清(約500yL)加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，使DNA抱團，-2(TC條件下沉淀30min，4。C條件下12000r/min離心10min;G.棄上清，加入500p175%乙醇洗滌沉淀2次，沉淀物室溫晾干；H.加入500uLTE緩沖液溶解DNA，加入0.3yLRNaseA(10yg/uL)，混勻，離心后37"C保溫30min;I.待DNA完全溶解后，加入3mol/LNaAC溶液50uL和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20。C條件下沉淀30min;J.在4。C，12000r/m條件下離心10min，棄上清，加入75%的乙醇清洗沉淀12次，后加入75%乙醇，-2(TC保存?zhèn)溆茫惶崛〉腄NA，經(jīng)純度檢測，證實純化較好(如附圖1)，用滅菌的400500uLddH20稀釋，存于4。C中備用。3.多態(tài)性SRAP引物的篩選擴增多態(tài)性引物篩選和標記分析本試驗共用88種SRAP引物組合在可育池和不育池中進行了擴增，經(jīng)過統(tǒng)計，每個泳道大約有20條帶左右。最后篩選到6對有多態(tài)性的引物對，其中me3em3經(jīng)3次重復(fù)擴增，在可育池和不育池之間均表現(xiàn)出一致的差異，即可育池DNA擴增產(chǎn)物比不育池DNA擴增產(chǎn)物多出1條大小為366bp的特異帶(如附圖2)。進而用該引物對親本和建池單株擴增，結(jié)果366bp的特異帶穩(wěn)定出現(xiàn)(如附圖3)，說明該帶與育性基因密切相關(guān)，命名為me3em3-366，同時發(fā)現(xiàn)引物me3em3擴增親本06J45和01S325-1、R(如附圖3)，結(jié)果出現(xiàn)了3種帶型，分別是恢復(fù)可育株01S325-1擴增出單一366bp特異帶、不育株06J45擴增出單一372bp帶、Fi同時擴增出366bp和372bp帶，在可育株建池單株中2株出現(xiàn)了可育株帶型、8株出現(xiàn)了R的帶型，不育株建池單株中1株為Fi的帶型、9株為不育株帶型，可見這兩條帶具有共顯性特點。4.SRAP共顯性標記的驗證及連鎖分析用引物me3em3擴增分析F2分離群體(如附圖3、圖4)。經(jīng)過統(tǒng)計3種帶型比例為父本帶型h代帶型母本帶型=59:131:68，經(jīng)x2測驗符合1:2:1的分離規(guī)律(x。2二0.691，xQ.。5,22=5.991)，由此可見該SRAP標記是一種共顯性標記，可以區(qū)分純合體與雜合體。經(jīng)過F3家系表現(xiàn)型對F2可育株單株基因型的推斷發(fā)現(xiàn)，上述比例與F2代育性基因型的分離比例相同，在觀察的122個Fs株系中，113個株系的育性表現(xiàn)與其F2單株的特異標記相一致，準確性達92.62%(如表l)，即這三種帶型分別代表了3種育性基因型1(RfRf):2(Rfrf):1(rfrf)的分離比例，366bp帶與可育基因連鎖，372bp帶與不育基因連鎖。為了確定特異片段與育性基因之間的遺傳距離，用引物me3em3擴增了由06J45X01S325-1建成的F2分離群體的258個單株，結(jié)果186個雄性可育株中183株有366bp特異帶，72個雄性不育株中65株無366bp特異帶，重組型植株IO株，占總植株數(shù)的3.876%，S卩366bp標記帶與可育基因之間的交換值為3.876%。對186株可育株自交后代觀察得到了122株的育性分離結(jié)果，占65.6%,其中40個純合雄性可育株中38株有372bp特異帶，82雜合雄性可育株中77株有372bp特異帶，考慮到可育株家系群體縮小，對不育株按相同比例縮小為47個雄性不育株都有372bp特異帶，重組型植株7株，占總植株數(shù)的4.142%，(如表l)。表1me3ern3特異標記與育性基因的遺傳連鎖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>5.SRAP共顯性標記的選擇效果為了驗證SRAP標記me3em3-366在胞質(zhì)雄性不育基因轉(zhuǎn)育過程中輔助雄性不育選擇的效果，選取與SRAP標記篩選所用試材不同的不育系06J37(隨機選取三個單株)；恢復(fù)系01S275-3、01S279-3(每個隨機選取三個單株)；2個不育系與3個恢復(fù)系的后代群體Fi代群體17個(每個群體隨機選取三個單株)，進行SRAP標記分析(如附圖5)。結(jié)果不育系、恢復(fù)系和Fi完全再現(xiàn)了上述3種帶型，說明以上這些材料和篩選標記所用的材料具有相同的遺傳背景，并且這些材料利用該標記進行選擇時預(yù)測的準確性達到100%，即該SRAP標記輔助選擇的準確性達到100%。這一結(jié)果表明該SRAP標記在大白菜胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)育中可用于雄性不育基因的輔助選擇。6.SRAP共顯性標記序列分析從具有父本帶型及母本帶型單株的聚丙烯酰胺凝膠上分別切下特異條帶Rf24-5-3和msl6-23-3進行克隆測序，結(jié)果表明，特異條帶Rf24-5-3包含引物序列的特異片段長度為366bp，特異條帶msl6-23-3包含引物序列的特異片段長度為372bp。特異片段msl6-23-3僅比特異片段Rf24-5-3多了6個堿基。特異條帶Rf24-5-3全長366bp,序列如下7Y^GTCC4^4(X(ya^7UCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTAGAGAGTAGACAGCGTCTCTCGAATCTGCTTAATCTTCCTCTCCTCACCTTTAATCAATCATCTCCTCCATCCAACTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAAGTCAACCCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATAGCTTTGACTGTCGCAATACCTTAAGATTGATCACTACTCCGACTTTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTAG7rA47TCG7MCCyC4GrC特異條帶msl6-23-3全長372bp,序列如下TO4CT7C4^0:GGA47UCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACAGCGTCTCTGGAATCTGCTTAATCTTCCTCCTCACCTTTAATCATCTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAGTCAACTCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTAGrC^7TCC^CGOGTC兩端為SRAP引物序列Me3:5,TGAGTCCAAACCGGAAT3'17bpEm3:5，GTCTGCGTACGAATTGAC3'18bp16將這兩段核苷酸序列分別輸入GenBank，用Blast程序?qū)怂嵝蛄袔爝M行同源性搜索和序列比較，結(jié)果都未找到同源序列，說明該序列為大白菜中的新序列。因此將這兩條特異帶命名為特異片斷Rf24-5-3和特異片斷ms16-23-3。SRAP標記的特異片斷Rf24-5-3和特異片斷msl6-23-3的核酸序列特異片斷Rf24-5-3全長366bp,序列如下rG/4GrCC^L40:GG^471GCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTAGAGAGTAGACAGCGTCTCTCGAATCTGCTTAATCTTCCTCTCCTCACCTTTAATCAATCATCTCCTCCATCCAACTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAAGTCAACCCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATAGCTTTGACTGTCGCAATACCTTAAGATTGATCACTACTCCGACTTTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTAGrC447TCG7MgyC4G7r特異片斷msl6-23-3全長372bp,序列如下rC7v4GTCG^C:a7G^KK:TAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACAGCGTCTCTGGAATCTGCTTAATCTTCCTCCTCACCTTTAATCATCTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAGTCAACTCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTAG7r^L47TC(y7^CGC4grC兩端為SRAP引物序列Me3:5，TGAGTCCAAACCGGAAT3，17bpEm3:5，GTCTGCGTACGAATTGAC3，18bp權(quán)利要求1.一種大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記，其特征在于，該SRAP標記的特異片斷Rf24-5-3核酸序列為<u>TGAGTCCAAACCGGAAT</u>GCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACTGTAGTTGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATATTTGCTATGTAACTTTGAAAAAAGCCATTGTAGAGAGTAGACAGCGTCTCTCGAATCTGCTTAATCTTCCTCTCCTCACCTTTAATCAATCATCTCCTCCATCCAACTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAAGTCAACCCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATAGCTTTGACTGTCGCAATACCTTAAGATTGATCACTACTCCGACTTTCCTATTTGGAAACATCTTCAAGGTAGTCAATTCGTACGCAGTC。2.—種大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記，其特征在于，該SRAP標記的特異片斷msl6-23-3核酸序列為ra4GrCCM^4CCGG^7UCTAACCTAACCGACTATTAACTAATTTACACCAATCAAATTCACCGCGAACTCTTGTCTGGGCTTATTAACCGACTTATTTGGGCTTAGATGGGCTTGTTTGGGCTTAGTTGGACTCTTGTCTCTTTCATTTTTGCTATGTAACTTTGAAAAACTCCATTGTAGAGTGTGGACAGCGTCTCTGGAATCTGCTTAATCTTCCTCCTCACCTTTAATCATCTTCTTTTATCTCCTTCTCGCATTTATCTTCTTTACAAAAAGTCAACTCTTTCCTTATCAGAATCTCCCTCCCATCGCTTTAACTATCGCAATACACCGACTTCACATCTTCAAGGTA(7rC^7TCCGOGrC。3.權(quán)利要求1或2所述的大白菜核質(zhì)互作雄性不育的SRAP標記用于大白菜核質(zhì)互作雄性不育性狀的輔助選擇育種應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的特異片斷Rf24-5-3及特異片斷msl6-23-3的兩端為SRAP引物，其序列為Me3:5，TGAGTCCAAACCGGAAT3'Em3:5,GTCTGCGTACGAATTGAC3，。5.如權(quán)利要求3的所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的輔助選擇育種是，首先進行大白菜核質(zhì)互作雄性不育系與優(yōu)良恢復(fù)系雜交、然后單株自交得到F2代育性分離群體材料，接著進行單株DNA提取，SRAP引物的擴增，SRAP標記在分離群體中分離規(guī)律分析，帶有陽性SRAP標記單株的選擇。6.如權(quán)利要求5的所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的輔助選擇育種的具體步驟是1)基因重組群體材料的準備-以大白菜核質(zhì)互作雄性不育系和恢復(fù)系雜交，單株自交，選取100粒200粒飽滿的F2代種子和親本種子催芽春化后播種于大田，在幼苗期，給R單株編號，于苗期取幼苗嫩葉片提取DNA備用，開花期鑒定植株育性；2)DNA提取A.取0.2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，塞入1.5mL的離心管中，放入液氮中速凍，用75%酒精浸泡過的塑料研磨棒迅速研磨至粉末；B.向離心管中加700"L經(jīng)65'C預(yù)熱的1XCTAB提取液，提取液的配方是CTAB:2%，Tris-HC1100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L，再加入8uLe-巰基乙醇，迅速混勻；C.隨后將離心管放入65'C水浴中，每間隔5min分鐘搖一次，水浴30min;D.取出離心管，加入與離心管內(nèi)的液體等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物，其中，酚氯仿異戊醇=25:24:1，搖勻15min后，常溫下畫0r/min離心10min;E.將適量上層液相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，并加入等體積的氯仿和異戊醇的混合液，其中，氯仿異戊醇=24:1，輕輕搖勻10min，常溫下12000r/min離心10min;F.取適量上清，加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，使DNA抱團，-2(TC條件下沉淀30min，4"C條件下12000r/min離心10min;G.棄上清，加入500ul的75%乙醇洗滌沉淀2次，沉淀物室溫晾干；H.加入500uL的TE緩沖液溶解DNA，并加入0.3"L的RNaseA，混勻，離心后37'C保溫30min;I.待DNA完全溶解后，加入3mol/L的NaAC溶液50uL和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，使DNA抱團，-2(TC條件下沉淀30min;J.在4。C、12000r/m條件下離心10min，棄上清，加入75%乙醇清洗沉淀12次，后加入75Q/^乙醇-2(TC保存?zhèn)溆茫惶崛〉腄NA，經(jīng)純度檢測后，用滅菌的400iiL500nL的ddH20稀釋，存于4'C中備用；3)SRAP—PCR擴增SRAP-PCR擴增在25uLPCR反應(yīng)體系中進行，反應(yīng)體系中有10XPCR緩沖液2.5ixL，7邵DNA聚合酶1Unit,MgCl2濃度為3.0mmol/L，上、下游特異性引物濃度分別為0.2"mol/L，4種dNTP濃度各為0.2畫1/L，模板DNA40ng;PCR反應(yīng)程序為:預(yù)變性94。C/5min、94°C/60s、35。C/60s、72°C/60s，4個循環(huán)后，94°C/60s、50°C/60s、72°C/60s，從第六步開始35個循環(huán)，72。C延伸10min;電泳將擴增產(chǎn)物與L的6XLoadingbuffer混勻，取4ixL點入6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中，在250V下電泳2.5h，經(jīng)0.2y。AgN03染色后用數(shù)碼相機照相，以DL2000marker為標準分子量；4)SRAP標記與細胞質(zhì)雄性不育性狀的連鎖關(guān)系針對目標基因的重組F2及F3群體，統(tǒng)計純合型雄性可育的單株、純合型雄性不育的單株和雜和型雄性可育單株中SRAP標記的數(shù)量，me3em3-366與可育核基因之間的交換值為3.876%,me3em3-372與不育核基因之間的交換值為4.142%，表明366bp帶與可育基因連鎖，372bp帶與不育基因連鎖；5)SRAP標記的特征及其選擇策略該SRAP標記為共顯性標記，在純合可育單株中能夠擴增me3em3-366特異帶，不育單株中能夠擴增me3em3-372特異帶，雜合可育單株同時具有兩條帶；對于重組分離群體，只要后代單株中檢測存在特異條帶me3em3-36，就一定攜帶可育核基因，存在特異條帶me3em3-372，就一定攜帶不育核基因，而無需等到開花時期選擇，通過SRAP標記間接選擇育性性狀，能夠早期準確選擇分子育種。全文摘要本發(fā)明公開了一種大白菜核質(zhì)互作雄性不育SRAP標記及其輔助選擇育種的方法，該方法以核質(zhì)互作雄性不育系和其對應(yīng)的恢復(fù)系及其雜交二代分離群體的基因組DNA為模板，通過SRAP分析，多次重復(fù)試驗，篩選到了與核質(zhì)互作雄性不育基因連鎖的共顯性SRAP標記，該SRAP標記是特異片斷Rf24-5-3和特異片斷ms16-23-3，純合可育株具有me3em3-366特異帶、不育株具有me3em3-372特異帶、雜合可育株同時具有兩條帶；me3em3-366與可育核基因之間的交換值為3.876％，me3em3-372與不育核基因之間的交換值為4.142％。該SRAP標記對F2可育株基因型的鑒定結(jié)果與F3家系育性分離的鑒定結(jié)果的一致性為92.62％，對另外幾份材料可育基因檢測的準確率為100％。應(yīng)用這個SRAP標記，可以進行大白菜核質(zhì)互作雄性不育性狀的早期分子輔助選擇，加快育種進度。文檔編號C12Q1/68GK101440408SQ200810236450公開日2009年5月27日申請日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者萬恩梅,卓祖闖,玉張,張明科,張魯剛,惠麥俠申請人:西北農(nóng)林科技大學