專利名稱：：小麥耐鹽基因TaCHP及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程
技術領域：
，尤其涉及耐鹽基因——鋅指蛋白基因化6F尸及其應用。
背景技術：
：土壤鹽漬化嚴重影響農(nóng)作物產(chǎn)量。特別是隨著工業(yè)的發(fā)展，土壤鹽漬化愈來愈嚴重，已成為一個全球關注的社會問題。我國人口眾多，而土壤鹽漬化更為嚴重，已經(jīng)成為制約我國經(jīng)濟和社會發(fā)展的重要因素。因此，除了緩解土壤鹽漬化以外，培育耐鹽農(nóng)作物新品種已成為當前一個十分迫切的任務。利用轉基因改良植物技術將新的性狀轉入高生物量植物中，以此開發(fā)高效的轉基因植物新品種，用于在鹽堿地種植是一項具有廣闊應用前景的技術。利用基因工程技術開展植物耐鹽方面研究巳取得了較大的的進展，克隆了大量相關基因，并將這些基因轉入植物中，用于耐鹽機制研究。一些實驗表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽相關的基因轉入植物中，其異源轉錄和翻譯產(chǎn)物可以使轉基因植物的抗鹽能力提高。目前，已發(fā)現(xiàn)了一些能顯著提高植物耐鹽能力的基因，其中大部分為轉錄因子相關基因。它們可通過調(diào)節(jié)下游耐鹽相關基因的表達，來調(diào)控植物的耐鹽能力。研究表明，將這些基因轉化到植物中，可以明顯提高植物的耐鹽能力。鋅指蛋白是一類非常重要的蛋白質，根據(jù)序列特征，鋅指蛋白可分為多種類型，不同類型鋅指蛋白在細胞中的功能具有顯著差異。近年來已有試驗表明，部分鋅指蛋白在植物耐鹽過程中發(fā)揮重要作用。但有關CHP類鋅指蛋白基因在植物耐鹽過程中的作用尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽基因一一小麥CHP類鋅指蛋白基因7aC力P及其應用。本發(fā)明的技術方案在于從小麥中分離得到CHP類鋅指蛋白基因——小麥CHP類鋅指蛋白基因7aO/尸，然后將該基因轉到小麥等農(nóng)作物中以實現(xiàn)農(nóng)作物在鹽漬化土壤中種植，重復利用次質土壤。本發(fā)明提供的小麥耐鹽基因名稱為小麥CHP類鋅指蛋白基因raC7/A所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本發(fā)明還提供了含上述的小麥CHP類鋅指蛋白基因T^Gy尸的植物表達載體pBI121或pUN1301。本發(fā)明所述基因raC力P在培育耐鹽植物中的應用。所述植物優(yōu)選是普通小麥或擬南芥。將本發(fā)明所述基因導入植物細胞，植物就可以獲得富集重金屬的能力。為了便于對轉基因植物或細胞系進行篩選，可以對含有所述基因r"C/ff的植物表達載體(pBI121或pUN1301)進行加工，如可以加入選擇標記(GUS等)或者具有抗性的抗生素標記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)等。任何一種可以將外源基因導入植物中表達的載體都可以應用，本發(fā)明優(yōu)選的載體是pUN醒。本發(fā)明所述的基因可廣泛用于培育耐鹽農(nóng)作物物品種。本發(fā)明的有益效果利用現(xiàn)有的植物基因工程技術，本發(fā)明首次克隆得到了小麥CHP類鋅指蛋白基因7^6F尸,并通過根瘤農(nóng)桿菌介導的方法將該基因轉入小麥和擬南芥，經(jīng)過比較分析證明，轉基因植株的耐鹽能力明顯提高。圖lTaCHP基因全長cDNA序列的擴增結果A，3'race分別在山融3號和濟南177中獲得長約700bp的PCR產(chǎn)物。B，5'race分別在山融3號和濟南177中獲得長約600bp的PCR產(chǎn)物。C，山融3號和濟南177中TaCHP基因開放閱讀框的擴增獲得650bp的片段。D,山融3號和濟南177中TaCHPDNA序列擴增獲得約800bp片段。SR3,山融3號(ShanrongNo.3);JN177，濟南177(Jinan177);下同。M為人DNA/(^boRI+歷';dIII)Marker;下同。圖2山融3號和濟南177鹽脅迫根系中TaCHP的RT-PCR分析。圖3RT-PCR分析PEG處理后山融3號不同組織中TaCHP基因的表達量。圖4RT-PCR分析H202處理后山融3號不同組織中TaCHP基因的表達量。圖5鹽脅迫和ABA處理后TaCHP基因在山融3號和濟南177中的Real-time分析結果。圖6TaCHP基因mRNA在根部的組織原位雜交定位。a為JN177未經(jīng)鹽處理的對照根尖；b為a信號部位的放大，c為d信號部位的放大，d，SR3未經(jīng)鹽處理的對照根尖；e，JN177經(jīng)200mMNaCl處理后的根尖；f，SR3經(jīng)200mMNaCl處理后的根尖；g，JN177未經(jīng)鹽處理對照的根部成熟區(qū)；h，SR3未經(jīng)鹽處理對照的根部成熟區(qū)；i，JN177經(jīng)200mMNaCl處理后的根部成熟區(qū)；j,SR3經(jīng)200mMNaCl處理后的根部成熟區(qū)；k，為TaCHP基因正義RNA探針雜交的縱切。1:為h信號部位放大。一雜交信號。C:皮層細胞V:微管組織；RM:根尖。圖7pET24a/TaCHP在大腸桿菌DE3中的誘導表達。圖8Sacl和Kpnl雙酶切pUN1301質粒和中間載體pMD18-T/TaCHP。圖9pUN1301/TaCHP表達載體的驗證。圖10植物表達載體pBI121/TaCHP構建A:Sacl和Xbal雙酶切pBI121和pMD18-T/TaCHP。分別得到12kb大片段和650bpTaCHP片段；B:pBI121/TaCHP表達載體陽性克隆的PCR鑒定。擴增獲得350bp的片段。圖11轉基因擬南芥株系及對照在不同濃度NaCl處理下的生長左轉入pBI121空載體的對照株系；右轉入pBI121/TaCHP基因的株系；A:l/2MS+0mMNaCl;B:l/2MS+50mMNaCl;C:1/2MS+100mMNaCl;D:1/2MS+150mMNaCl。圖12鹽脅迫對轉基因擬南芥株系與對照根系的生長的影響。圖13轉基因小麥株系及對照在鹽水澆灌條件下的生長情況。兩張照片代表兩個轉基因株系，照片中右邊為pUN1301空載體、左邊為pUN1301/TaCHP株系。圖14pUN1301/TaCHP轉基因株系的PCR鑒定。其中l(wèi)，2，3,4，5，6，8為陽性株系，一為未轉基因植株對照；+:為質粒對照。具體實施例方式實施例l、7"aC^尸的克隆1.1提取小麥TotalRNA1.將組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；2.待液氮揮發(fā)干，立即轉移到2ml的離心管中，每100mg材料約加入lml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加樣槍反復吸吹，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；3.加入0.2ml氯仿(chloroform),劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；4.4°C，12000rpm離心15分鐘；5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5ml的離心管中，加入500y1的異丙醇(l:l體積)，充分混勻，-20。C，沉淀30min或過夜;6.4°C，12000rpm離心10min，小心棄去上清液；7.RNA沉淀用lml的75%乙醇洗滌。4'C，8000rpm離心10min收集沉淀；8.重復用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀；9.去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當體積(30-50y1)的RNase-free水充分溶解(可放于-8(TC長期保存)；10.紫外分光光度計及l(fā)°/。Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。注a)用紫外分光光度計檢測RNA的產(chǎn)量，在260nm處的吸光度，10D-40ug/ml。根據(jù)在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的0D26。/0D28。比值應接近2.0(比值最好在1.92.1之間)。b)用l%Agrose凝膠電泳檢側RNA的質量及大小。吸取lulRNA加入3ix1的RNase-free水，力B1u1上樣緩沖液65'C變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3y1的lkbDNAMarker作為對照。1.2第一鏈cDNA的合成(Affymetrixone-cyclecDNASynthesisKit)1.Poly-ARNAcontrols的制備(用Poly-Acontroldilutionbuffer稀釋Poly-Acontrolstock),按照下面的比例稀釋<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.反應體系反應試劑體積RNA樣品(lug/ul)8y1Dilutedpoly-ARNAcontrols2ulT7-oligo(dT)Primer,50uM2ulRNase-freewater0yl總體積12ul將上述試劑樣品輕輕混勻，7(TC溫浴10分鐘，置于冰上至少2分鐘，離心片刻；3.期間按照下表配制剩余組分反應試劑體積5XlstStrandReactionMix4ulDTT(0.1M)2u1d鮮(10mM)lul總體積7yl混勻，42°C,溫浴2分鐘；2uL(816ug起始)。4.將混合液加入已經(jīng)完成反應的12ulRNA/T7-oligo(dT)溶液中，輕彈管壁混勻,輕微離心50秒，加入1u1SuperscriptIIRT(200U/u1)，使總反應體積為20u1。混勻后立即放入42'C溫育1小時，4'C冷卻5分鐘。1.3第二鏈cDNA的合成(Affymetrixone-cyclecDNASynthesisKit)1.將lstcDNA合成產(chǎn)物置于冰上，加入下列試劑試劑組分體積RNase-Freewater91y15X2ndStrandBuffer30y1d,(lOmM)3u1E.coliDNALigase(10U/ul)1E.coliDNAPolymerase(lOU/ul)4ii1E.coliRNaseH(10U/ul)lu1總體積130u1混勻，16°C，反應2小時；2.加入2ylT4DNAPolymerase,混勻，16°C，5分鐘;3.加入10ulEDTA(0.5M)，混勻，終止反應。-2CTC保存。1.4快速擴增cDNA末端(RACE,RapidAmplificationofcDNAEnds,參照Clonetech,SMARTRACEcDNAAmplificationKit操作指南進行)BDSMARTIIAOligonucleotide引物序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'3'-RACECDSPrimerA(3'-CDS)引物序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3'(N=A'C,G'orT;V=A,G,orC)5'-RACECDSPrimer(5'-CDS)引物序列5'-(T)25VN-3'(N=A,C，G,orT;V=A,G,orC)10XUniversalPrimerAMix(UPM)引物序列5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'NestedUniversalPrimerA(NUP)弓l物序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'6設計合適的5'RACE基因特異引物設計合適的3'RACE基因特異引物。1.55'RACE的一鏈cDNA合成1.在0.5ml離心管中加入以下成分3ul(l-5ug)totalRNA;1p15'-CDSprimer;1u1SMARTIIA01igo,混勻，70。C變性10ndn，置于冰浴中至少2min，短暫離心。2.在上述管中加入以下成分2.0ul5Xfirst-strandbuffer;l.OulDTT(20mmol/L);1.0uldNTPmix(each10咖ol/L);l.OulPowerScriptReverseTranscriptase。3.輕輕混勻各成分，短暫離心，42。C空氣浴中反應l-1.5hr。4.加入100ulTricine-EDTAbuffer稀釋第一鏈反應產(chǎn)物。5.72。C加熱7min,樣品5，-RACE-ReadycDNAIC存于-2(rC冰箱中保存。1.65'-RACE根據(jù)已測序EST的信息，設計基因內(nèi)部引物GSP，利用BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit進行快速擴增cDNA末端(RACE,RapidAmplificationofcDNAEnds，參照Cl匿tech，SMARTRACEcDNAAmplificationKit操作指南進行)，得到全長cDNA，包括5'、3'非編碼區(qū)。1.在50ul反應體系中加入下列成分PCR-gradeWater34.5y110XAdvantage2PCRbuffer5ylDNTPMix(lOmmol/L)1u150XAdvantage2PolymeraseMixlulIOX觀5p1GSP(10umol/L)lul5，-RACE-Readyc薩2.5u1FinalVolume50y1輕輕混勻后，短暫離心，反應液上方滴加兩滴石蠟油。2.反應按以下TouchdownPCR條件進行94°C5min，94°C15-30sec，72°C2-5min，5cycles;94°C15-30sec，70°C15-30sec，72。C2-5min，5cycles;94°C15-30sec,65-68°C15-30sec，72°C2-5min，25-30cycles;10。C保存。最后循環(huán)的退火溫度，根據(jù)設計的基因特異引物GSP的Tm值進行調(diào)整。3.從反應液中取5ul電泳檢査，若擴增帶較弱可增加5個循環(huán)；若擴增帶為彌散的smear帶，可考慮進行巢式PCR。4.巢式PCR:用Tricine-EDTAbuffer稀釋5ul第一步PCR產(chǎn)物至250yl，取1作為巢式PCR的模板；反應體系中的引物為1y1NUPprimer和1u1NGSP;反應條件按上述TouchdownPCR的最后循環(huán)進行15-20cycles。結果見圖1B。1.73'RACE擴增3'RACE的一鏈cDNA合成基本步驟同1.5，用3'-CDSprimer替代5'-CDSprimer做反轉錄反應。3'RACE擴增基本步驟同1.6。擴增片段連接T-Vector后選取7陽性克隆測序。結果見圖1A。1.8開放閱讀框的克隆和序列測定1.2.引物序列根據(jù)測序結果，設計基因上下游引物，擴增基因的開放閱讀框。PCR反應體系(50uL):2XGCbufferI模板cDNAdNTPs(2.5mMeach)Primerl(10uM)Primer2(10yM)LATaq(TaKaRa)ddH20lOu1lul0.5ullu1lu10.5ul加至終體積50u13.PCR反應程序為94°C預變性5rain;94。C變性45sec，55。C復性45sec，72。C延伸lmin，循環(huán)35次；72'C延伸7min。4.擴增片段的回收、與T載體的連接轉化方法同上，測序由上海Irwirtron公司完成。結果見圖1C。1.9基因組序列的擴增a.CTAB法提取山融3號，濟南177以及長穗偃麥草的基因組DNA1.取100mg左右的新鮮葉片，放入1.5ml離心管中，液氮速凍，研磨器中磨碎，加入600ul預熱至65。C的2XCTAB提取緩沖液，混勻置于65。C水浴中放置90min;2.混合物冷至室溫后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，4°C，12000rpm離心lOmins3.取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4'C，12000rpm離心10min;4.取上清，加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.3)和0.7倍體積的異丙醇，仔細混勻，室溫放置15min，沉淀DNA;5.用一玻璃鉤將DNA鉤出，并轉移至一裝有800u170%乙醇的干凈Eppendorf管中，室溫放置數(shù)分鐘洗滌沉淀，6000g離心5min;6.盡量去盡上清，空氣干燥數(shù)分鐘，溶于適量TE緩沖液中。b.基因組序列的PCR擴增基因組序列的擴增以山融3號，濟南177和長穗偃麥草的基因組DNA為模板，PCR引物用基因特異引物，PCR體系同上。PCR反應程序為94°C預變性5min;94。C變性45sec，55。C復性45sec，72。C延伸lmin,循環(huán)35次；72。C延伸7min。產(chǎn)物電泳，擴增片段的回收，與T載體的連接轉化及鑒定方法同上，測序由上海Invirtron公司完成。退火溫度和延伸時間根據(jù)引物的性質調(diào)節(jié)。結果見圖1D。1.10基因表達分析(RT-PCR和real-timePCR)a.脅迫下RNA的提取山融3號和濟南177種子正常萌發(fā)，Hangload培養(yǎng)液培養(yǎng)至株高約10cm時(約3周時間)開始施加鹽脅迫(200mMNaCl)、干旱脅迫(15%PEG)、A1C13(200uM)、100uMH202。分別在處理后的0、1、3、6、24，48小時取幼嫩的葉片和根系，Trizol8法提取RNA，方法同上。b.逆轉錄(RT)產(chǎn)生cDNA逆轉錄產(chǎn)生cDNA，方法同上。c.PCR反應及電泳1.以cDNA為模板，進行PCR反應:引物如下TaAct-S:5'TaAct-A:5'2.PCR體系:-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3，GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3,ddH2013.5ul10XTaqbuffer(Mg2+free)2ulMgCl2(25mM)1.2y1Primerl(10uM)lu1Primer2(10uM)1ti1dNTP(10mMeach)0.2u1rTaqpolymerase(5U/y1)0.1u1逆轉錄cDNA模板1u1TotalVolume2013.PCR程序95°C5min,25''30cycles95°C20s'57。C60s,72°C60s;72。C7min.根據(jù)內(nèi)參Actin的擴增情況確定PCR的循環(huán)數(shù)，調(diào)整cDNA模板的加入量。4.1%瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖2，3，4。d.Real-TimePCR按組分配置PCR反應液(在冰上進行)試劑使用量10XPCRbuffer2u1Mg2+(25mM)2u1SYBRGREEN1u1dNTP(各10mM)0.5u1PCRForwardPrimer(lOuM)0.4tilPCRReversePrimer(10uM)0.4ulTaqDNApolymerase(5u/ul)0.2ulH2012.5u1Total20iU進行RealtimePCR反應PCR反應管用離心機輕輕離心后放入DNAEngineOpticon連續(xù)的熒光檢測系統(tǒng)中進行PCR反應。采用兩步法PCR反應程序。95°C2minRepeat45times95°C10s60°C20s72°CReadplat982°CReadplat72°ClOminMeltingcurve80°C95°C/0.5°C每個樣本均做3個平行管，內(nèi)標基因配材內(nèi)也相應的做3個平行管。在同一反應體系中，用腿和水做為對照。整個PCR反應在OpticonPTC200system(MJResearch,USA)中進行。反應結束后確認RealtimePCR的擴增曲線和溶解曲線，可以通過溶解曲線分析，確認PCR反應的特異性。進行PCR定量時制作標準曲線。計算CT值，根據(jù)CT的平均值，計算不同模板的C值。結果見圖5。實施例2、原核表達分析2.1原核表達載體的構建所用表達載體為pET24a，受體菌為DE3。選用HindIII和EcoRI分別對pET24a和含有目的基因的pMD18—T載體進行雙酶切，分別回收載體大片段和目的基因小片段，用T4DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，鑒定重組子后即得到帶有目的基因的原核表達載體，然后轉化受體菌DE3感受態(tài)用于蛋白表達。1.pET24a和pMD18—T的酶切堿裂解法提取pET24a和pMD18—T的質粒，各取10ul進行HindIII和EcoRI雙酶切。質粒提取方法如上，質粒雙酶切體系如下fc。RI1y1歷"dinlul10XKbuffer1y1質粒300ngddH20至2041于37'C恒溫水浴鍋酶切4小時以上。2.酶切質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測及回收方法同上。3.基因與酶切得到的pET24a大片段的連接連接反應組成10X連接酶緩沖液lulT4DNA連接酶1u1回收基因目的片斷6ul回收產(chǎn)物pET24a2u1加ddH20至終反應體積10ul，16-C連接過夜(回收目的基因與pET24a的摩爾比為4:1)。4.轉化大腸桿菌，方法同上。5.重組子的鑒定①質粒的酶切鑒定挑取單菌落分別接種于5ml含kan的LB液體培養(yǎng)基中37'C震蕩培養(yǎng)過夜，堿變性法提取質粒，選取合適的酶進行酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預期分子量大小的片段。②質粒的PCR驗證用基因特異引物進行PCR擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預期分子量大小的片段。6.轉化受體菌DE3構建好的原核表達載體熱擊法轉化大腸桿菌DE3感受態(tài)細胞，篩選與鑒定方法同上。2.2樣品的制備蛋白質提取液400mgSDS100mgDTT2.5ml。.5MTris-HC1(pH6.8)2mlglycerol3mg溴酚蘭混合后，加蒸餾水至10ml。1.將含有表達片段的陽性克隆接種于5ml含卡那霉素30ug/ral的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)3-5小時。到0D600約為1.0時，吸出lml菌液留作對照組。2.其余的培養(yǎng)液中加入1M的IPTG使終濃度分別為1.OmM。分別培養(yǎng)不同時間(0h，3h，5h)誘導誘導蛋白的表達。3.未誘導和誘導的菌液都加入1.5ml離心管中，10000rpm離心lmin收集菌體，棄上清，加入100ul蛋白提取液，旋渦振蕩混勻，沸水浴10min,13000rpm離心15min，上清備用。2.3SDS-PAGE電泳1.藥品配制(1)IOX電極緩沖液:取Tris30.3g,Glycine144g,SDS10g，加蒸餾水溶解后定容至1000ml;(2)40y。丙烯酰胺母液(Acr):取40gAcr，加蒸餾水溶解后定容到100ml:(3)2免甲叉雙丙烯酰胺(Bis);取2gBis-Acr,加蒸餾水溶解后定容到100ml;(4)3mol/LTris-HCl(pH8.8):取36.3gTris溶入蒸餾水，定容至100ml，用lmol/L的HC1調(diào)pH至8.8;(5)lmol/LTris-HCl(pH6.8):取12.lgTris溶入蒸餾水，定容至100ml，用ltnol/L的HC1調(diào)pH至6.8;(6)10%SDS:稱取SDS粉末10g加蒸餾水溶解定容至100ml;(7)10%AP:稱取過硫酸銨lg加蒸餾水溶解定容至10ml;(8)TEMED:購自Amersham公司；(9)固定染色液取20ml冰醋酸，80ml甲醇加蒸餾水定容至200ml，稱取200mg考馬斯亮藍R-250溶解于上述溶液中。2.SDS-PAGE凝膠的制備(1)玻璃板洗凈干燥之后，用1%瓊脂封板。玻璃板放到制膠架上(帶耳膠板在外)，用夾子固定，向下端封口的塑料槽中加入適量熔化的瓊脂，靜置，直至瓊脂凝固。(2)配膠按照下表中的比例配制12%分離膠和穩(wěn)濃縮膠。聚丙烯酰胺凝膠組成12%分離膠26ml7.62ml4%濃縮膠10ml0.986ml40%Acr2%Bis4.16ml0.54ml3MTris-HCl1MTris-HCl(pH8.8)(pH6.8)3.28ml1.25ml10%SDS蒸餾水TEMED0.26ml10.56ml7.14ml10%APS10.4u1(3)倒入分離膠后，在膠面上加一層正丁醇，靜置，直至分離膠凝固。(4)倒置膠板，流出正丁醇，用蒸餾水沖洗膠面，用濾紙吸盡多余的水，配制濃縮膠，混勻后倒入玻璃板之間，將梳子放置在玻璃板間，注意不要產(chǎn)生氣泡，靜置至膠凝。(5)將膠板從制膠架上取下，去凈膠板下部殘留的瓊脂；將膠板固定到電泳槽上(帶耳膠板在內(nèi))，直立電泳槽，夾子固定膠板。(6)拔出梳子，向電泳槽下槽加入電泳緩沖液，吹出進入玻璃板之間的氣泡。將8ixl樣品液點入點樣孔中。然后將電泳槽放入4'C層析柜中，注意要水平，10mA穩(wěn)流電泳至指示劑遷移至凝膠底部后繼續(xù)電泳30分鐘，再停止電泳。(7)電泳結束，取下膠板，揭開玻璃板，露出膠，用刀片切去濃縮膠，切掉分離膠一角作標記，進行染色。(8)染色與脫色。取下膠，置200ml染色液中搖蕩染色過夜，然后轉移到裝有蒸餾水的塑料盤中搖蕩脫色2-4小時，其間更換蒸餾水數(shù)次，直至到背景脫色干凈為止。(9)保存結果。脫色干凈的膠的電泳圖譜用凝膠成像儀照相保存并分析。3.融合蛋白純化及蛋白酶抑制活性檢測(1)含有重組質粒的大腸桿菌細胞在含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)。直至OD,約為0.6，加入IPTG,使終濃度為0.5mM，37度培養(yǎng)5-6小時。誘導蛋白表達。(2)收集細菌細胞，40mL初始緩沖液(20mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4,0.5mMNaCl)重懸。(3)加入5mg溶菌酶室溫30min裂解細胞。(4)冰浴20200W超聲波破碎細胞10s，每次間隔10s。12000rpm離心15min4度。(5)用0.lmM的NiS04平衡Hi-Trap(Amersham)柱子。蛋白純化方法參考chu等(chu，2003)。BSA法測定蛋白含量參考Bradford's(1976)。(6)得到的蛋白產(chǎn)物用15%SDS_PAGE電泳。烤馬斯亮藍R-250染色觀察。(7)取2ug胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich,St.Louis)與純化的融合蛋白3ml，25度孵育10min。同時以商業(yè)化的大豆BBI(Sigma-Aldrich)作為對照。(8)胰蛋白酶活性檢測，使用TAME(Sigma-Aldrich)247n檢測，參考Hummel's(1959)。胰凝乳蛋白酶活性用ATEE(Sigma-Aldrich)237nm檢測參考Schwert's(1955)。結果見圖7。實施例3、組織原位雜交組織原位雜交參照Roche公司Detectionofm腿intissuesectionsusingDIG-labeled脂A的方法進行。結果見圖6。實施例4、植物表達載體的構建(Ubi/35S啟動子)4.1Ubiquitin啟動子植物表達載體的構建利用植物表達載體pCAMBIA1301,在BamHI和HindIII之間插入了Ubiquitin啟動子，在EcoRI和KpnI之間插入了Nos終止子，構建了中間載體pUN1301。選用Sacl和KpnI分別對pUN1301和含有目的基因的pMD18-T載體進行雙酶切，分別回收載體大片段和目的基因小片段，用T4DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，鑒定重組子后即得到帶有目的基因的植物表達載體。不同基因的載體構建的酶切位點根據(jù)情況調(diào)整。(1)質粒pUN1301空載體和pMD18-T的Kpnl和Sacl雙酶切堿裂解法提取pUN1301空載體和pMD18-T質粒，各取10ug酶切，酶切體系如下于37。C恒溫水浴鍋酶切2小時以上。雙酶切后以1XTAE為電泳緩沖液，將酶切物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖8。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pUN1301中14kb的載體大片段和pMD18-T中大約0.6kb的目的基因條帶，回收該條帶。(2)pUN1301質粒酶切回收的載體大片段的脫磷。(3)經(jīng)酶切和脫磷的pUN1301載體片段(約14kb)和pMD18-T雙酶切回收片段(約0.6kb)以摩爾比1:4的比例進行16'C連接過夜。(4)連接產(chǎn)物熱激法轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，轉化菌在含Kan50ng/ml的LB固體平板上37'C培養(yǎng)16小時左右。(5)重組子的鑒定①質粒的PCR驗證挑取單菌落分別接種于5ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基中37"C振蕩培養(yǎng)過夜，堿變性法提取質粒，用基因特異引物進行PCR擴增，體系如下PCR反應條件如下預變性94。C3min，35個循環(huán)為94°C30sec，55°C30sec，72。Clmin，最后，72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果見圖9。②質粒酶切鑒定提質粒進行KpnI和BamHI雙酶切，酶切體系同上。0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否含有預期分子量大小的片段，驗證載體的正確構建。4.235S啟動子植物表達載體的構建KpnlSacllu112ullul20u1pUN1301載體/pUCm-T質粒10XBufferKddH20To植物表達載體pBI121是含有35S啟動子和NPTII基因的雙元載體，在其多克隆位點上含有限制性內(nèi)切酶KpnI和SacI位點。分別用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Sacl雙酶切載體pR0K2和目的基因片斷。完全酶切的載體在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經(jīng)膠回收、用CIAP脫磷酸,然后與雙酶切的cDNA片段相連，構建獲得植物表達載體。酶切體系，轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)，鑒定重組子。連接、回收、轉化及鑒定方法同上。結果見圖10。實施例5、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉化5.1農(nóng)桿菌AGL1/EHA105感受態(tài)的制備(1)從YEP平板(含50ug/ml利福平)上挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于含50ug/ml利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，200rpm/min，28。C培養(yǎng)過夜。(2)取2ml過夜培養(yǎng)液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中在相同條件下培養(yǎng)至ODe。。達O.5。(3)菌液冰浴30min,4°C，5000rpm離心10min，收集菌體。(4)將菌體重懸于冰浴的10ml0.15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。(5)再懸浮于lml20誦ol/L冰預冷的CaC12溶液中，以200u1/管將菌液分裝在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速凍lmin，-70'C保存?zhèn)溆谩?.2凍融法轉化根癌農(nóng)桿菌AGL1/EHA105(1)在室溫下融化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，加入lwg表達載體質粒DNA，混勻后冰浴30min。(2)置液氮速凍lmin,迅速移至37"C保溫3min。(3)加入無抗生素的YEP800ul，28。C震蕩培養(yǎng)3hr。(4)7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50ug/ml利福平、50ug/ralKan的YEP平板上，28'C倒置暗培養(yǎng)2-3天。5.3菌體PCR鑒定菌體PCR方法及程序同上。實施例6、轉基因功能驗證一擬南芥轉化及篩選6.1擬南芥種植將種子放入EP管中，70。/。乙醇中浸泡5min，然后清潔劑(20%漂水(白貓，上海)，0.1%Triton)洗滌10-15min，無菌水沖洗4次，4'C春化72h。向消毒好的種子中加入O.5%agarose(冷卻至40度以免把種子燙死，加agarose是為了有利于種子散開)，鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基上，超凈臺上吹干，(可多吹一會，以免種子萌發(fā)過程中培養(yǎng)皿蓋子上有水汽)。轉入人工氣候室中培養(yǎng)一周左右，可移栽。將人工土壤裝入合適大小的pot，70度烘干2小時以上(殺死蟲卵等，否則會長蟲)，然后將pot放在營養(yǎng)液中，使其充分吸水，將在1/2MS固體培養(yǎng)基上生長7-10天的幼苗移栽于飽含營養(yǎng)液的人工土壤中，蓋上保鮮膜，轉入人工氣候室中培養(yǎng)。1-2天后揭去保鮮膜。隔幾天澆一次水(澆在POT底下的鐵盤子里)。6.2擬南芥轉化(1)當擬南芥(哥倫比亞野生型)花序形成時，將花序頂端減掉以誘導測花序的生成。轉化前將材料澆透營養(yǎng)液。(2)轉化前一天，取2ml活化的農(nóng)桿菌AGL1加到含相應抗生素的200mlYEP培養(yǎng)基14中，過夜培養(yǎng)至0D柳產(chǎn)1.0-1.2。(3)離心收集菌體，并重懸于浸染液(5%蔗糖，0.04%SilwetL-77)中，使006。。=0.8。(4)將花序浸入浸染液30秒，其間前后擺動花序，使花序上形成一層膜。(5)用保鮮膜覆蓋花序，暗培養(yǎng)一天后揭去保鮮膜，至于19-22'C培養(yǎng)室培養(yǎng)。(6)隔5-7天再同法浸染一次。(7)大約一個月后收獲種子。6.3擬南芥轉化陽性株系篩選(1)收獲的TO代種子消毒后(75X乙醇5min，清潔劑洗滌10-15min，無菌水沖洗3—5次)，鋪于含50ug/mLKan或50"g/mLHygo的MS篩選培養(yǎng)基上(方法同上)。(2)4t:春化48h,移到人工氣候室生長7-10天。將抗性小苗移到土中繼續(xù)生長。(3)等植物絕大多數(shù)花苞已經(jīng)結果莢，用小繩將植物單株綁起，以便單株收種子T1代種子。(4)PCR擴增以轉化株系的基因組DNA為模板，使用基因特異引物。PCR反應體系和反應條件見前。(5)Tl種子處理同前，在T2代植物中挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系。結果見圖11,12。實施例7、生長點轉化小麥山融3號及轉基因植株分析7.1生長點轉化山融3號小麥采用本實驗建立生長點轉化的方法(國家發(fā)明專利ZL200410075773.2)，將構建的單子葉植物表達載體轉化小麥。具體步驟如下(1)濟南小麥177浸種后露白，4。C春化30-35天;(2)小苗長至3-5cm左右時準備農(nóng)桿菌菌液，開始侵染；(3)農(nóng)桿菌AGL1中攜帶質粒，其搖菌活化過程同上；(4)農(nóng)桿菌菌體5000rpm離心5min,菌體重懸于加As的浸染液中；(5)解剖鏡下無菌刀片小心縱切小苗下部，暴露出生長點；(6)用注射器將浸染液小心滴到生長點位置；(7)植株恢復生長7天左右，移栽到土中；(8)對植株外加抗生素壓力進行篩選。7.2轉基因陽性植株鑒定(1)CTAB法提取基因組DNA。(2)PCR鑒定陽性植株。PCR擴增以轉化株系的基因組DNA為模板，引物分別用基因特異引物。PCR反應體系和反應條件見前。結果見圖13，14。15序列表<110>山東大學〈120〉小麥耐鹽基因TaCHP及其應用<141〉2009-1-16<160>1〈210〉1〈211>645〈212〉c腿〈213>小麥〈221〉小麥耐鹽基因TaCHP基因〈222〉(1)…(645)〈400>1atggcccagcgccaggacatcgtcattagcaagcgccaccacactgggctgttccgctgcgcatacatctgccgtgccggctgcgacttccagacgttctcctcccccgagcaccatgtgcacgcaaccctctcatgcgatgtctgctttcgctgtccaccatgcgggttcgatatgcaccgcagcgtgcgagaccctacgcacgacctcgcgtgcgacactggcgcggggcacgcgtcgtaccacatctcgtgtgcagcgagcaccggcgcccttgacgctcagattgtacgatcaagggacctgtggagtcctggctatactgtacgccatttctcccatccagggcacgacctcgtg60gateLtgtgctggg鄉(xiāng)acctatccggcatg120tgcatccacgagtcttgcgccggccactca180cacccgctcacgctcgtccagacccgccgc240gggctstgcgcccctagctccttcctctac300ccaacctgtgtgctgctcccccaagtcgtg360acgctggtcgtCgCCgELCggctgctgtgcc420tactaccgctgcacggcatgcaacgtcgac480gcgctcatga3gCtC犯g3t540atcc犯gagcag8ct3ga^cgccatcttg600ag3gagtacttctag1權利要求1.一種小麥耐鹽基因TaCHP，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.—種含有權利要求1所述基因TflCZ/尸的植物表達載體pBI121。3.—種含有權利要求1所述基因％C//P的植物表達載體pUN1301。4.權利要求1所述基因7bCHP在培育抗鹽植物中的應用。5.權利要求2所述植物表達載體pBI121在培育抗鹽植物中的應用。6.權利要求3所述植物表達載體pllN1301在培育抗鹽植物中的應用。7.如權利要求4、5或6所述的應用，其特征在于所述植物是普通小麥。全文摘要本發(fā)明公開了一種小麥耐鹽基因即小麥CHP類鋅指蛋白基因TaCHP及含有所述基因TaCHP的植物表達載體，本發(fā)明還公開了所述基因TaCHP在培育抗鹽植物特別是小麥中的應用。實驗證明，本發(fā)明所述轉基因植株的抗鹽能力明顯提高。文檔編號C12N15/29GK101481693SQ20091001365公開日2009年7月15日申請日期2009年1月19日優(yōu)先權日2009年1月19日發(fā)明者夏光敏,李翠玲,欣趙申請人:山東大學