一種小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程育種技術領域，尤其涉及一種小麥花粉細胞電擊法轉化體系 的優化方法，及利用這一方法在獲得抗逆轉基因小麥上的應用。
【背景技術】
[0002] 小麥是主要的糧食作物之一，其總產量僅在玉米之下。到目前為止，我國培育小麥 新品種主要是通過常規雜交育種的方法。但這種方法周期較長、可選擇范圍比較窄，而且其 預見性比較差、性狀改良的效率也較低，因而延緩了小麥育種的發展進程。
[0003] 與常規育種相比，分子育種縮短了育種的年限，為不同物種之間的遺傳交流提供 了可能，彌補了常規育種的不足，得到了廣泛的利用和關注。隨著植物遺傳轉化技術的日益 完善，利用轉基因技術有目的、精確的改良植物遺傳性狀創制轉基因新材料新品系已成為 目前小麥育種的新方向。同時隨著小麥基因組測序工作的完成，大量基因將被克隆和進行 功能研究。轉基因小麥研發和小麥功能基因組學研究需要獲得大量轉基因植株，迫切需要 提高小麥轉化效率，擴大轉化規模，建立高效、安全、規模化轉基因技術體系，推進轉基因小 麥產業化和小麥功能基因組學研究進程(葉興國等2014)。
[0004] 普通小麥(Triticum aestivum L.)為六倍體植物基因組龐大，在主要農作物中， 小麥屬于遺傳轉化比較困難的作物，轉化效率較低，重復性較差，轉化規模較小，優良轉基 因材料較少，基因工程育種進程明顯落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物(葉興國等2014)。 目前，應用于小麥的轉基因技術主要包括基因槍介導法和農桿菌介導法，有些實驗室也采 用花粉管通道、離子介導、激光微束穿刺、PEG、花粉介導和農桿菌浸花等方法（葉興國等 2014)。其中基因槍轉化法是小麥遺傳轉化中采用的最主要的轉化方法，絕大多數的轉化事 件是由基因槍法轉化得到的。但基因槍轉化法依賴于組織培養再生途徑，組培程序復雜，材 料的無菌轉接操作繁瑣，轉化過程對操作人員的操作技術水平要求較嚴;許多優良基因型 再生困難;且基因槍法成本較高；轉化效率低而不穩，轉化效率一般在0~1 % (葉興國等 2011,2014);轉化的外源基因拷貝數較多，易引起基因表達沉默;經過組織培養易產生無性 系變異;而且再生植株有嵌合體現象;轉基因后代多為雜合狀態，純合時間較長，在自交純 合過程中外源基因易丟失。農桿菌轉化法也需要通過組織培養途徑，成本較低且在雙子葉 植物上已基本成熟，在單子葉植物小麥上隨著不斷地改進近年也有所進展，但在實際應用 中仍存在小麥愈傷組織對農桿菌不敏感、侵染后愈傷組織極易褐化死亡，往往導致轉化失 敗(葉興國等2011;張潔等2013)。花粉管通道法是利用植物自然授粉過程中花粉管伸入到 子房中形成的花粉管通道，外源基因借助此通道進入胚囊，整合入受體植物基因組中完成 轉基因過程。花粉管通道法不需要通過組織培養途徑，也是借助自然授粉受精過程進行基 因轉化，成本低、不受植物種類限制，但是重復性和穩定性較差，現有報道其轉化率為 0.135% (張立等2013)，轉化效率較低也不穩定。而其他的一些轉化方法如顯微操作、離子 束介導法在小麥上目前應用也較為困難，效率低下，在小麥未見有成功的報道。超聲波花粉 介導法是利用超聲波多次瞬時處理花粉導入外源基因，再通過授粉獲得轉基因植株，在油 菜、玉米、芥菜等作物上已有轉化成功的報道，但在小麥轉基因中未見報道。
[0005] 小麥的遺傳轉化難度大、效率低，已成為目前制約小麥轉基因研究發展的重要限 制因素。因此，研究探索一種不依賴組織培養途徑、操作簡單、成本低、高效穩定的小麥遺傳 轉化方法，對促進小麥轉基因研究具有重要的意義。
[0006] 電擊法是將細胞置于高電場、低電容的環境中，利用高圧直流電給予細胞瞬時脈 沖(微秒-毫秒），使細胞膜瞬間被擊穿，產生微小孔洞，細胞膜出現通透性，引起一些分子、 離子的運動與流動壓迫細胞膜，使其通透性增加，外源大分子或DNA的片段由這些孔洞進入 細胞中（張有明等2004)。在適當的電場強度下，電擊后細胞膜上形成的孔洞是可逆的（張小 娟等2011)，當外加電場消失后，被擊穿的細胞膜的脂質和蛋白質分子在維持極短時間后， 可以重新排列恢復到原來的結構，細胞仍保持活力，外源遺傳物質隨著細胞的生長分化整 合進受體細胞基因組。
[0007] 電擊法操作簡單、迅速，省時省事，在植物中一般常用于原生質體的轉化。但植物 原生質體分離培養復雜，再生困難，使其應用于轉化的瓶頸，也有利用幼胚、合子等為受體 進行的電擊轉化(王勝華等2001 ;Wang LP等2003)，但都需要經歷繁瑣的組織培養過程。小 孢子、花粉和合子細胞同時具有單倍體和單細胞的特點，理論上單倍體、單細胞是轉基因最 為理想的受體細胞，相對于二倍體細胞來說，單倍體細胞只有一套染色體，只要轉入外源基 因就可以通過染色體加倍的方式來得到純合體，轉基因植株在后代自交的過程中便可以避 免或者減少所轉化的目的基因的丟失，從而提高了轉化效率，后代植株的純合性和穩定性 也比較好，而且縮短了得到轉基因植株的年限;而以單細胞為受體轉化成功后，起源于單細 胞的轉化植株無嵌合體現象，后代穩定快，外源基因不易丟失。因此小孢子、花粉細胞和合 子細胞是轉基因最為理想的受體細胞，但小麥小孢子培養技術復雜、再生也較難，合子細胞 數量少，分離和培養困難，在轉化中難以應用。利用花粉為受體細胞結合雜交授粉過程進行 外用源基因的轉化，可以避免繁瑣復雜的組織培養過程，不會產生無性系變異和嵌合體，無 需進行轉化過程中的抗性篩選，載體構建簡單，可以獲得無篩選標記基因的安全轉基因植 株，是一種簡單高效非常有前景的轉化技術。自Matthews BF等（1990)利用電穿孔的方法將 外源基因轉入花粉之后，人們開始在不同植物上利用花粉電穿孔轉化法進行轉基因研究。 先后煙草（Saunders JA等1992)、苦瓜（張有明2004)、玉米(王清嵐2006)等植物上取得成 功，顯示了這一技術的有效性，為進行小麥的花粉電擊轉化提供了依據。
[0008] 花粉電擊轉化已有的報道均是在一花多實植物上取得的成功，小麥屬于單子房單 胚珠作物，與一花多實植物相比雜交授粉速度較慢，但與小麥其他的轉化方法相比，花粉電 穿孔轉化法操作簡單快速、成本低，不需要組織培養途徑，省時省力，轉基因后代純合穩定 快，可以獲得無篩選標記的轉基因植株，而剔除篩選標記基因可以提高轉基因作物的安全 性，減少對環境的潛在危險，并且加快轉基因作物的商業化(張新梅等2004)。因此，探索并 建立小麥花粉電擊轉化法具有非常重要的意義和應用前景。
[0009] 花粉電擊轉化中受到多種因素的影響，在我們前期實驗中，對小麥花粉電擊過程 中的電場強度、環境溫度、花粉細胞密度和狀態、授粉時間、DNA密度等關鍵影響因素進行了 比較試驗，表明電穿孔轉化時，電場強度為6kv/cm、DNA濃度為0.025ug/ul、電擊1次、花粉密 度為5 X106個/mL、選開花當天即將萌發的花粉電擊處理、冰上操作，以及去雄后第5天授粉 為最佳電擊轉化參數，通過對這些參數的優化，已經初步建立了小麥花粉電擊轉化技術體 系，并將⑶S基因轉入小麥中，經檢測鑒定⑶S基因穩定整合進小麥基因組并表達(張小紅等 2013)。說明我們初步建立的小麥花粉電擊轉化法是可行的，但在轉化過程中發現，由于電 擊緩沖液中含糖量較高，授粉后子房部位霉變腐爛嚴重，導致結實率較低，多個處理未獲能 結實，即使有結實但由于霉變導致籽粒無生活力。而小麥花粉生命力較短，一般情況下離體 后花粉活力弱，萌發困難(Karapanos 1C等2010)。花粉電擊轉化中，花粉從離體收集、清洗、 電擊到授粉，均在緩沖液種保存，電擊緩沖液及電擊后的花粉萌發液是影響花粉活力的重 要因素之一，也與結實率密切相關。因此優化電擊緩沖液和花粉萌發液，使電擊前和電擊后 的花粉盡可能保持活力和萌發力，是提高結實率和提高轉化效率的重要因素。因此通過優 化電擊緩沖液和花粉萌發液，優化小麥花粉電擊轉化法，提高結實率，進而提高轉化效率， 是建立穩定高效的小麥花粉電擊轉化技術的關鍵。
[0010]目前，在小麥生產中干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫已成影響小麥生產的重要限制因 素，利用轉基因途徑創制和培育抗旱抗逆轉基因小麥新材料新品系已成轉基因小麥研究的 重要方向。轉錄因子又被稱為反式作用因子，是一類DNA結合蛋白，在相關功能基因調控上 起著重要作用。目前已經發現了數百種編碼植物轉錄因子的基因，包括與生長發育、抗病、 抗旱、耐鹽、耐低溫等相關的基因（劉強等2000)。乙烯應答元件結合蛋白AP2/EREBP類轉錄 因子是植物特有的一類新的轉錄因子，參與植物病原反應、激素反應、植物發育以及低溫、 高鹽和干旱脅迫應答。轉錄因子可以調控下游多個與抗逆相關的功能基因一起表達，可以 提高作物的抗逆性。DREB4A和W17分別屬于AP2/EREBP中的DREB類和ERF類轉錄因子，DREB4A 和W17轉錄因子基因可以提高植物對干旱、低溫和高鹽的抗性（張瑞越等2005;徐兆師等 2005;毛彥芝等2014)。本研究在優化小麥花粉電擊轉化技術基礎上，通過小麥花粉電擊轉 化法將DREB4A和W17這兩個與干旱、高鹽和低溫等抗逆相關轉錄因子基因轉入小麥，提高小 麥的抗逆性，創造抗逆轉基因小麥新材料。
[0011]因此，優化完善小麥花粉電擊轉化技術，提高電擊轉化結實率，并利用電擊轉化法 創制抗逆轉基因小麥新材料，對建立穩定高效實用化的小麥電擊轉化技術體系、促進小麥 轉基因育種及小麥功能基因組研究具有重要意義。

【發明內容】

[0012] 本發明的目的在于提供一種小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法及其應用， 旨在解決依賴組織培養途徑轉化時的繁瑣、耗時長、要求高以及電擊轉化時結實率低的問 題。
[0013] 本發明是這樣實現的，一種小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法及其應用， 所述小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法及其應用以小麥成熟花粉細胞為轉化受體， 通過對電擊液、萌發液的篩選和優化，以提高小麥成熟花粉細胞的活力和體外萌發率，優化 其電擊轉化體系；利用電擊轉化法對與干旱、高鹽和低溫誘導表達相關的轉錄因子基因 DREB4A、W17進行轉化，以獲得抗逆轉基因植株；
[0014] 所述小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法及其應用具體包括：
[0015]從菌液中提取含目的基因的質粒或從菌液中分別提取含DREB4A和W17基因的質 粒；
[0016]小麥花粉最適電擊液的優化；
[0017]電擊后FDA染色和觀察、統計；
[0018]電擊后花粉萌發液的優化處理；
[0019]授粉及后處理；
[0020] 基因組DNA的提取；
[0021] PCR檢測轉基因植株。
[0022]進一步，所述從菌液中提取DREB4A和W17基因的質粒具體包括：
[0023] 搖菌，提供-20°C保存的帶有DREB4A和W17基因的大腸桿菌，在100mL的三角瓶中將 其按1:10加