專利名稱：檢測水痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測水痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒，特別是涉及以熒光定量聚合酶鏈 反應技術檢測臨床樣品中水痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒。
背景技術：
水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)屬于皰疹病毒科α -皰疹病毒亞科人類皰疹病毒3型。 人是其唯一的自然宿主，并且對其普遍易感。同一種病毒可引起兩種不同的病癥，在兒童初 次感染引起水痘，而潛伏體內的病毒受到某些刺激后復發引起起帶狀皰疹，多見于成年人 和老年人。水痘是由VZV經呼吸道、口、咽、結膜、皮膚等處侵入人體。病毒先在局部淋巴結增 殖，進入血液后散布到各個內臟繼續大量增殖。經2 3周潛伏期后，全身皮膚廣泛發生丘 疹，水皰疹和膿皰疹，皮疹分布主要是向心性，以軀干較多。皮疹內含大量病毒，感染的棘細 胞(Prickle cell)內生成嗜酸性核內包涵體和多核巨細胞。皮疹消失后不遺留疤痕，病情 一般較輕，但偶有并發間質性肺炎和感染后腦炎(0.1%)。細胞免疫缺陷、白血病、腎臟病 或使用皮質激素、抗代謝藥物的兒童，病情較嚴重。帶狀皰疹是因是潛伏在體內的VZV復發感染。由于兒童時期患過水痘愈合，病毒 潛伏在脊髓后根神經節或腦感染神經節中，當機體受到某些刺激，如發熱、受冷、機械壓迫， 使用免疫抑制劑、X光照射，白血病及腫瘤等細胞免疫功能損害或低下時，導致潛伏病毒激 活，病毒沿感覺神經軸索下行到達該神經所支配的皮膚細胞內增殖，在皮膚上沿著感覺神 經的通路發生串聯的水皰疹，形似帶狀，故名。多發生于腰腹和面部。1 4周內局部痛覺 非常敏感，有劇痛。患水痘后機體產生特異性體液免疫和細胞免疫，終身不再感染。但對長期潛伏于 神經節中病毒不能被清除，故不能阻止病毒激活而發生帶狀皰疹。水痘的傳染性很強，可因直接碰觸(如水皰)或過于接近其它水痘患者(透過空 氣)而感染，也可能因接觸染有水皰膿液的衣服而被傳染；因此，住在一起的人特別容易互 相傳染，通常在皮疹出現前1、2天至皮疹出現后5、6天之間，是傳染性最強的時期。水痘散 布于全世界。根據我國的水痘流行病學調查結果，各地區人群均受到普遍感染，抗體平均陽 性率為70 %，且隨著年齡增長，抗體流行率迅速上升。近年來，無論兒童還是成人，水痘發病 均有上升趨勢。目前的VZV檢測方法為刮取皰疹基底部細胞涂片染色檢查嗜酸性核內包涵體和 多核巨細胞，或用膜抗原單克隆抗體進行免疫熒光或免疫酶染色檢查細胞內抗原。但這些 方法存在時間長、靈敏度低等缺陷。因此，非常有必要開發一種快速準確的檢測方法來進行水痘_帶狀皰疹臨床早期 感染病例的確認以及爆發疫情的應急診斷和監控。而使用實時熒光定量PCR檢測VZV則很 好地滿足了上述要求。實時熒光定量PCR技術是上世紀90年代中期基于傳統的PCR技術發展起來的。與傳統的(終點檢測)PCR技術相比，實時定量監測方法不僅實現了低拷貝數靶多核苷酸的定 量分析，而且還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及污染的可能性更小等優點。實時熒光PCR技術是在聚合酶鏈反應(PCR)體系中加入熒光標記探針，使用一種 帶有核電偶聯裝置(CCD)的PCR擴增儀，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每 個循環的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒 光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴增曲線。通過對擴增曲線以及循環閾值(Ct) 的分析，能夠對檢測樣品進行定性和定量分析。實時熒光PCR將DNA擴增與檢測過程融合 為一體，動態檢測DNA擴增的全過程，省掉了 PCR后處理過程，大大縮短了結果分析時間，使 得該方法更加快捷、方便。由于實時熒光PCR采取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠 污染和由此造成的假陽性。因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取 代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。TaqMan PCR 技術是實時熒光 PCR 的一種(Mackay IM et al. Real-time P CR in virology. . Nucleic Acids Res. 2002 5 ；30 (6) 1292-1305 ；Lie,Y. S. ,Petropoulos,C. J., Advances in quantitative PCR technology 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9，43-48.)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端 分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發出熒光的能 量轉移給淬滅基團，呈現淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分 子逐漸被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉移 效應，熒光報告基團發出熒光信號。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現 線性增強。美國食品與藥品管理局(FDA)已經批準了一些檢測病原體的定量PCR診斷試劑 盒，如用于HIV-1、結核分枝桿菌、沙眼衣原體等的實時熒光PCR檢測的試劑盒。同樣，中國 目前也已批準了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV-I和SARS等的實時熒光PCR檢測試劑 盒的生產和臨床應用。因此，開發一種能夠檢測VZV的實時熒光PCR試劑盒，對相關水痘、 皰疹的診斷，治療檢測以及爆發疫情的應急診斷和監控具有重要意義。眾所周知，在使用已知的實時熒光定量PCR技術檢測和定量分析臨床樣品中某特 定靶核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性， 一個關鍵性的基本技術環節是如何基于已知的靶多核苷酸序列設計并制備適當的引物和 寡核苷酸探針。本發明人在以往多年從事PCR技術特別是實時熒光定量PCR技術研究的基 礎上，開發相應的試劑盒應用于VZV多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了本發明。

發明內容
本發明的目的是提供一種使用實時熒光定量PCR技術定量檢測臨床樣品中水 痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒。為了實現本發明，我們采用了以下技術方案1)使用適當的核酸分析軟件對已知的VZV核苷酸序列進行同源性比較，在找出同 源區段的基礎上，進一步使用適當的引物設計軟件(例如Primer Express 2)選擇并設計 寡核苷酸引物和探針。由于所設計的引物和探針均具有互補于VZV的序列，而且與其他病 原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內切酶的酶切位點，所以避免了VZV檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準確度。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析 法(FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標記 作為熒光發生基團(報告基團)&6-FAM amidite，并在其3’端標記借助活性連接臂偶聯 上作為熒光淬滅或抑制基團的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標記的探針。然后，使用變 性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20% )電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)從來自受試者的血清或者皰疹液中提取DNA，然后用于繼后的PCR擴增。4)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c)2_脫氧核苷三磷酸(dNTPs) 的擴增反應體系，以及包括(d)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第一條互補鏈結合的正向引 物，(e)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第二條互補鏈結合的反向引物，以及(f)能夠與雙鏈 靶多核苷酸的任一條鏈結合并且兩末端分別標記有熒光發生基團和熒光淬滅基團的寡核 苷酸探針的熒光檢測體系。通過一次或多次聚合酶鏈反應擴增所說的靶多核苷酸；退火后 使所說的熒光發生基團通過探針與靶多核苷酸結合并產生熒光信號；檢測并確定熒光發生 基團所產生的熒光量；分析一次或多次擴增循環所發出的熒光量，以檢測靶多核苷酸的存 在。基于以上技術方案發明的試劑盒包括⑴分別裝有DNA提取液、PCR擴增反應液、 陰性對照樣品、陽性定量參考品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這 些試劑瓶或管的包裝盒。根據本發明的一個優選實施方案，其中PCR擴增反應液包括能夠與VZV雙鏈靶 多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引 物、能夠與靶多核苷酸結合并且兩末端分別結合的有熒光發生基團和熒光淬滅基團的寡核 苷酸探針、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液和水，特征在于所使用的引物序列分別為 5，-CCGTTTTGCATTGGATTCGTA-3，(SEQ ID NO 1),5' -TTTTCAAGAAGCGCCTTTGC-3‘ (SEQ ID NO :2)，寡核苷酸探針序列為5，-TCACGTCCGCCGCGGACA-3，(SEQ ID NO :3)。其中 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 匹配在一起可以檢測 VZV。根據本發明的一個優選實施方案，PCR擴增反應液中還可以使用的引物序列分別 為5，-ACGACCGGCGCTGAGATA-3，(SEQ ID N0:4)、5' -CAATGCCGTGACCACCAA-3‘ (SEQ IDNO 5),寡核苷酸探針序列為5，-CACCCGCCTTGGATTAGAGCCAGAAAA-3，(SEQ ID NO 6)。其中 SEQ ID NO 4, SEQ ID NO -.5, SEQ ID NO 6 匹配在一起可以檢測 VZV。根據本發明的一個優選實施方案，PCR擴增反應液中還可以使用的引物序列分別 為5，-GGGTCAACTGTCCCTGGTCTT-3，(SEQ ID NO :7)、5，-GTTCCCATGTTTTATGGGAATACC-3，(S EQ ID NO :8)，寡核苷酸探針序列為5，-AACGACCCCCCGAAGATGACGAACT-3，(SEQ ID NO :9)。 SEQ ID NO -J, SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO 9 匹配在一起可以檢測 VZV。根據本發明的一個優選實施方案，PCR擴增反應液中還可以使用的引物序列分別 為5，-TAGTCAGGCCATGAGTCATCGT-3，(SEQ ID NO 10)，5，-GGCAAGTCGCCAATTAACGT-3，(SEQ ID NO :11)，寡核苷酸探針序列為5，-CGACATGCAGTCAATTTCAACGTCGC-3，(SEQID N0:12)。 SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 12 匹配在一起可以檢測 VZV。根據本發明的一個優選實施方案，其中PCR擴增反應液，特征在于每人份的PCR緩 沖液中加入 1 單位 Taq 酶，緩沖液包含 IOmM Tris-HCl (pH8. 0)、150mM KCl、5mM MgCl20
根據本發明的一個優選實施方案，其中陰性對照樣品為去離子水，陽性定量參考 品為攜帶有VZV核酸序列的重組質粒，質粒由上下游引物擴增的PCR產物通過市售的載體 克隆構建而成，所使用的上下游引物的序列組合可以是SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2，或 SEQ ID NO :4 禾口 SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO :8，或 SEQ ID N0:10 禾口 SEQ ID NO :11，陽性定量參考品濃度分別為IX IO7拷貝/ml、IX IO6拷貝/ml、IX IO5拷貝/ml、 IX IO4 拷貝 /ml。根據本發明的一個優選實施方案，其中DNA提取液可以為常規自配的DNA提取試 劑或市售的DNA提取試劑盒。根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的待檢樣品可選自但不局限于水 痘、帶狀皰疹患者的臨床樣品。根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的靶多核苷酸來自VZV的核酸序 列。
根據本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的核酸擴增系統是采用聚合酶鏈反 應，并且所說的擴增反應循環是重復30-50次的聚合酶鏈反應循環。特別值得說明的是，為了確保本發明的VZV檢測方法的準確性，我們還使用攜帶 有VZV核酸序列的重組質粒作為DNA陽性定量參考品。借助這些額外標準品，使用本發明 的試劑盒在相同條件下進行平行檢測并制作所謂的外標定量標準曲線，以進一步驗證本發 明試劑盒的檢測精密度和準確性，并作為生產本發明試劑盒附加的質量控制標準。與基于擴增反應完成后進行單一終點檢測的傳統PCR試劑盒不同，實時定量聚合 酶鏈反應試劑盒可以在擴增反應的進程中隨時監測擴增產物的產生，從而大大提高了定量 檢測的準確性和精密度。眾所周知，實時熒光定量PCR是在PCR擴增體系中，同時加入引物 和5’、3’末端分別標記有熒光報告基團(例如6-FAM amidite羧基熒光素6)和熒光淬滅 基團(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補 結合，其序列保持完整，報告基團發射的熒光信號將被淬滅基團吸收，所以沒有熒光信號產 生；而當PCR擴增反應進行時，DNA聚合酶的5’ -3’外切酶活性將降解熒光探針，導致熒光 報告基團與熒光淬滅基團分離，因而熒光監測系統可接收并記錄到熒光信號。每擴增一條 DNA鏈即有一個熒光分子產生，從而實現熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，實時地 監測整個PCR反應進程，并可借助標準曲線對未知靶多核苷酸(模板)進行定量分析。利用已知起始拷貝數的標準品制作標準曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數的對 數為橫坐標，并以測得的Ct值為縱坐標。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從基于平 行實驗得到的數據制作的標準曲線上得知其起始拷貝數的對數，然后計算出該靶多核苷酸 的起始拷貝數(當擴增循環達到Ct值即初始進入指數擴增期時，Ct值的重現性極好，即同 一靶多核苷酸在不同時間擴增或同一時間在不同管內擴增所得到的Ct值總是恒定的)。也 就是說，基于上述的擴增反應結果推算出靶多核苷酸的量(起始拷貝數)。具體實現包括 (1)確定樣品中的靶多核苷酸經擴增后所產生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾 循環次數；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量靶多核苷 酸的閾循環次數相比較，從而計算出樣品中靶多核苷酸的量。


圖1顯示VZV核酸的實時熒光PCR線性梯度實驗結果。針對濃度為1 X IO3拷貝/ ml IX IO9拷貝/ml的重組質粒進行實時熒光PCR檢測分析，檢測結果顯示熒光擴增曲線 有明顯指數增長期，均可明確判為陽性。圖2顯示VZV核酸的實時熒光PCR靈敏度實驗結果。針對濃度為1 X IO3拷貝/ml 的重組質粒進行10次重復檢測，檢測結果顯示熒光擴增曲線有明顯指數增長期，均可明確 判為陽性。圖3顯示VZV的陽性定量參考品的標準曲線。針對濃度為1.0X IO4 1.0X107 拷貝/ml的陽性定量參考品進行實時熒光PCR檢測分析，繪制得到的標準曲線斜率(Slope) 為-3. 40，在Y軸截距(Intercept)為33. 31，相關系數的平方(R2) = 0.9994。圖4顯示VZV核酸的實時熒光PCR特異性實驗結果。針對8例包括單純皰疹病毒 I型、單純皰疹病毒II型患者樣品進行實時熒光PCR檢測分析，檢測結果顯示熒光擴增曲線 無明顯指數增長，均可明確判為陰性。圖5顯示3份水痘-帶狀皰疹患者的樣本的檢測結果。3個標本的Ct值分別是 12. 11,14. 23、20. 21，結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。實施例1 :VZV檢測試劑盒及其使用(1)制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液(IOml/管)1管、PCR反應液 (470 μ 1/管)1管、Taq酶(10 μ 1/管)1管、陽性定量參考品(50 μ 1/管)4管、陰性對照樣 品(50μ1/管)1管。(2)標本采集、運送和保存無菌操作取患者血清或者皰疹液，上述標本在2 8°C 條件下保存應不超過72小時；-20°C可保存1個月；要長期保存的，需分裝后儲存于-70°C。 如集中檢驗，標本需在0°C以下環境中運送并于24小時內送達實驗室。(3)檢測步驟和結果分析一、DNA 提取1.取50 μ 1血清或皰疹液，加入等量的DNA提取液，充分混勻。2. 100°C加熱 10 分鐘。3. 12000rpm 離心 10 分鐘4.取上清至另一滅菌干凈離心管備用。二、PCR 擴增
0050]ABI Prism 7300 (ΡΕ GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、DA7600、Line Gene、 iCycler等市售的熒光定量PCR儀可參照此操作，具體儀器操作見各儀器的使用說明書)1.試劑準備按比例(PCR反應液47 μ 1/人份+Taq酶1 μ 1/人份)取相應量的 PCR反應液及Taq酶，充分混勻后按48 μ 1/管分裝至0. 2ml離心管中，備用。2.加樣向準備好試劑的0. 2ml離心管中，加入DNA樣品(包括標本、陰性對照樣 品、陽性定量參考品)上清液2 μ 1，8，OOOrpm瞬時離心，放入儀器樣品槽。3.編輯
3. 1按對應順序設置陰性對照樣品、陽性定量參考品以及未知標本，并在Name 欄中設置樣品名稱。選中所有設置樣品孔，選擇探針模式設置，Importer Dye:FAM, QuencherDyeTAMRA, Passive Reference:NONE, Data Collection:55 °C 45seconcL (注 意使用 ABI Prism 7000 時探針模式設置，Importer Dye:FAM，Quencher Dye:TAMRA, PassiveReference:NONE)3. 2打開instrument窗口設置循環條件 93 °C 2 分鐘，93"C 45 秒一55°C 60 秒一10 個循環，93"C 30 秒—55°C 45 秒—30 個循環。保存文件，運行。4.結果分析4. 1反應結束后保存檢測數據文件。4. 2分析條件設置根據分析后圖像調節Baseline的start值、stop值以及 Threshold的Value值(用戶可根據實際情況自行調整，start值可以在1 10、stop值可 以在5 20、Value值可以在0. 01 0. 2范圍選擇)，使Std curve窗口下的標準曲線圖 達到最佳，即correlation數值介于-0. 97 -1. 0 (參見附圖3所示)。在Analysis菜單 下選擇Analyze自動分析結果。4. 3到Tray窗口，記錄未知標本數值(C)。“C”表示樣品的濃度或含量。4. 4ABI Prism 7300 (PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、DA7600、 Line Gene、 iCycler等參照此方法判定結果)1)如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值=30，則判樣品的VZV的DNA總含量小于 檢測極限。2)如果增長曲線呈S型曲線且Ct值< 30，則按以下方法判斷若樣品的C < 1. 00E+003，則判樣品VZV的DNA總含量< 1.0X103拷貝/ml ；若樣品的1. 00E+003彡C彡1. 00E+008,則判樣品VZV的DNA總含量=C拷貝/ml ；若樣品的C > 1. 00E+008,則樣品VZV的DNA總含量> 1. OX IO8拷貝/ml。如果 需要精確定量結果，可將提取后的樣品稀釋至線性范圍內再檢測。實施例2 =VZV檢測試劑盒的靈敏度和特異性實驗1)靈敏度實驗將濃度為IX IOltl拷貝/ml的攜帶有VZV核酸序列的重組質粒，10 倍梯度稀釋成IX IO9拷貝/ml、IX IO8拷貝/ml、IX IO7拷貝/ml、IX IO6拷貝/ml、IX IO5 拷貝/ml、lX104拷貝/ml、lX103拷貝/ml作為待檢樣本，使用本試劑盒進行檢測，結果如 附圖1所示。對濃度為IX IO3拷貝/ml的樣本進行10次重復檢測，結果均為陽性，如附圖 2所示。檢測結果表明，本試劑盒的靈敏度可以達到IXlO3拷貝/ml。2)特異性實驗選取8例包括單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型患者樣品作 為待檢樣本，使用本試劑盒進行檢測，結果如附圖4所示。檢測結果表明，本試劑盒對非水 痘_帶狀皰疹患者的樣本檢測均為陰性，試劑盒的特異性很好。實施例3 應用VZV檢測試劑盒定量檢測臨床樣品選取3份水痘_帶狀皰疹患者的樣本作為待檢樣本，并以陽性定量參考品作為定 量標準，使用本試劑盒進行檢測，PCR反應結束后，根據擴增曲線先調節分析參數，使標準曲線(Stdcurve)窗口下的標準曲線達到最佳(即相關性數值絕對值> 0. 97)，然后分析臨 床樣品。臨床樣品的檢測結果如附圖5所示3個臨床標本擴增曲線的Ct值分別是12. 11、 14. 23、20. 21，結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性；參照同一次試驗中陽 性定量參考品的標準曲線(如附圖3所示)可以判定3個臨床陽性標本的濃度分別為 5. 21 X IO6 拷貝 /ml,8. 12X IO5 拷貝 /ml、1. 05X IO4 拷貝 /ml。序列表
<110>中山大學達安基因股份有限公司<120>檢測水痘_帶狀皰疹病毒的試劑盒<140><141><160>12
<210>1
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>1ccgttttgcattggattcgta<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>2ttttcaagaagcgcctttgc<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。<400>3tcacgtccgccgcggaca<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>4acgaccggcgctgagata<210>5
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>5caatgccgtgaccaccaa<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。<400>6cacccgccttggattagagccagaaaa<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>7gggtcaactgtccctggtctt<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>8gttcccatgttttatgggaatacc<210>9<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。<400>9aacgaccccccgaagatgacgaact<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>10tagtcaggccatgagtcatcgt<210>11
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>11ggcaagtcgccaattaacgt<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。 <400>12cgacatgcagtcaatttcaacgtcgc
權利要求
一種檢測樣品中水痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒，(1)分別裝有DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性對照樣品、陽性定量參考品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，PCR擴增反應液包括正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液和水，其特征在于所使用的引物序列分別為5’-CCGTTTTGCATTGGATTCGTA-3’、5′-TTTTCAAGAAGCGCCTTTGC-3′，寡核苷酸探針序列為5’-TCACGTCCGCCGCGGACA-3’。
2.根據權利要求1的試劑盒，其特征在于PCR擴增反應液所使用的正反向引物的序列 還可以為5，-ACGACCGGCGCTGAGATA-3，、5 ‘ -CAATGCCGTGACCACCAA-3 ‘，寡核苷酸探針序 列還可以為5，-CACCCGCCTTGGATTAGAGCCAGAAAA-3，。
3.根據權利要求1的試劑盒，其特征在于PCR擴增反應液所使用的正反向引物的序列 還可以為5，-GGGTCAACTGTCCCTGGTCTT-3\5‘ -GTTCCCATGTTTTATGGGAATACC-3，，寡核苷酸 探針序列還可以為5，-AACGACCCCCCGAAGATGACGAACT-3，。
4.根據權利要求1的試劑盒，其特征在于PCR擴增反應液所使用的正反向引物的序列 還可以為5，-TAGTCAGGCCATGAGTCATCGT-3，，5，-GGCAAGTCGCCAATTAACGT-3，，寡核苷酸探針 序列為5’ -CGACATGCAGTCAATTTCAACGTCGC-3，。
5.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR緩沖液包含10mMTris-HCl (pH8. 0)、 150mMKCl、5mM MgCl2，每微升的PCR緩沖液中加入1單位Taq酶。
6.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于陽性定量參考品為攜帶有VZV核酸序列的 重組質粒，質粒由上下游引物擴增的PCR產物通過市售的載體克隆構建而成，所使用的上 下游引物的序列組合可以是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，或SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5，或 SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8，或 SEQ ID N0:10 禾口 SEQ ID N0:11。
7.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于試劑盒的核酸擴增系統是采用聚合酶鏈反 應，并且所說的擴增反應循環是重復30-50次的聚合酶鏈反應循環。
全文摘要
本發明涉及檢測水痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒，特別是涉及以熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測臨床樣品中水痘-帶狀皰疹病毒的試劑盒。由于本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，因此通過本發明的試劑盒檢測和定量分析水痘-帶狀皰疹病毒的多核苷酸，對早期感染病例的確認以及爆發疫情的應急診斷和監控具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK101871013SQ20091003886
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月22日 優先權日2009年4月22日
發明者李明, 陳華云, 陳嘉昌 申請人:中山大學達安基因股份有限公司