專利名稱：一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白e的方法及其應(yīng)用的制作方法
一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于蛋白的重組表達(dá)方法及其應(yīng)用，特別是涉及一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其在抗水痘-帶狀皰疹病毒特異性免疫球蛋白的ELISA 檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)屬于皰疹病毒科，α病毒屬，人是其唯一宿主，因此又稱人皰疹病毒3型，感染后可引起兩種不同的臨床病理癥狀。 VZV初次感染多發(fā)于青少年時(shí)期，表現(xiàn)為全身性的水皰瘡(水痘)，此后，病毒潛伏在感覺神經(jīng)節(jié)，當(dāng)攜帶者由于免疫力低下等原因，病毒可再次激活而引發(fā)帶狀皰疹(病毒通過神經(jīng)傳播，到達(dá)表皮細(xì)胞，沿肋間神經(jīng)區(qū)域形成水皰疹癥狀)。VZV的初次和再次感染均會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理癥狀，多表現(xiàn)為腦膜炎、腦炎、面癱等，但往往不伴隨皰疹體征，因而不利于該病毒感染的臨床診斷和早期抗病毒治療。
目前，臨床多采用提取病人腦脊髓液中的核酸，進(jìn)行探針法定量PCR確定患者是否為 VZV 感染。但 Steiner 等(Steiner I, Budka H, Chaudhuri A, et al. Viral meningoencephalitis -.a review of diagnostic methods and guidelines for management. Eur J Neurol. 2010，17 :e957_e999.)證明 PCR 鑒定受限于采樣的窗口期，因此，雖然該方法具有很好的靈敏性，但易造成假陰性，并且VZV基因組與其它人α -皰疹病毒基因組，特別是單純皰疹病毒，具有很高的同源性，因而不排除有假陽性的檢測結(jié)果。 基于上述原因，研究者將VZV感染的診斷轉(zhuǎn)向血清學(xué)的檢測方法，Breuer等(Breuer J， Schmid DS, Gershon AA. Use and limitations of varicella-zoster virus-specific serological testing to evaluate breakthrough disease in vaccines and to screen for susceptibility to varicella. J Infect Dis. 2008，197 (S2) :S147_S151.)使用 VZV 感染的細(xì)胞膜蛋白裂解物作為捕獲抗原，建立間接ELISA方法檢測血漿中VZV特異性免疫球蛋白的含量，雖然與金標(biāo)準(zhǔn)膜抗原免疫熒光法(fluorescent antibody to membrane antigen, FAMA)相比具有很好的一致性，但仍存在與其它人皰疹病毒特免交叉反應(yīng)的可能性。因此，建立可靠的血清學(xué)檢測方法，提高檢測體系的特異性，避免交叉反應(yīng)，對(duì)于臨床 VZV感染的診斷及高通量抗VZV特異性免疫球蛋白的篩選具有重要意義。
由于間接ELISA反應(yīng)體系的靈敏性與捕獲蛋白的包被濃度有關(guān)，而特異性與包被蛋白的抗原決定簇有關(guān)，因此，選擇病毒特異性的抗原決定簇是提高抗VZV特異性免疫球蛋白檢測特異性的關(guān)鍵。
已知VZV為雙鏈DNA病毒，包括125000個(gè)堿基對(duì)，全部堿基序列已由Davison 等人確定，并公開發(fā)表(Davison AJ, Scott JE. The complete DNA sequence of Varicella-Zoster Virus. J gen Virol. 1986，67 :1759-1816.)。該基因組中至少存在著 72個(gè)0RF，編碼33種VZV特有蛋白和13種糖蛋白，其中已發(fā)現(xiàn)gE (gp I )、gB(gpII)、gH(gp III)、gl (gp IV )、gC(gp V )和gL(gp VI)等6種糖蛋白共同存在于病毒囊膜表面和感染細(xì)胞的膜表面。
糖蛋白E對(duì)于病毒復(fù)制是必不可少的，同時(shí)也是感染細(xì)胞膜表面以及成熟病毒囊膜表面存在的最豐富的糖蛋白，高度保守，其作為候選亞單位疫苗的研究表現(xiàn)出良好的抗原特異性和抗體結(jié)合性。由于野生型VZV gpE的蛋白分子包括有四個(gè)區(qū)域，即信號(hào)肽(aal-24)、胞外區(qū)(aa25_539)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(aaM0_624)，而E蛋白的3個(gè)抗原決定族均分布在胞夕卜區(qū)(Grose C. Glycoproteins encoded by varicella-zoster virus :biosynthesis, phosphorylation, and intracellular trafficking. Annu Rev Microbil. 1990,44 :59-80.)。
由于采用單抗親和層析法，從VZV感染細(xì)胞的裂解物中提取足量的gpE需要大量的人力、物力資源并且代價(jià)較為昂貴，如果能利用基因重組技術(shù)對(duì)相應(yīng)的抗原進(jìn)行重組表達(dá)則可避免上述方法的缺點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法。
本發(fā)明所提供的重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法，是將去除跨膜區(qū)(疏水區(qū))和胞內(nèi)區(qū)并添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白EfelycoproteinE，gpE)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，經(jīng)表達(dá)得到重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。
所述His標(biāo)簽位于水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的羧基(C)端。
所述添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因可通過位點(diǎn)特異性整合系統(tǒng)Flp/FRT導(dǎo)入宿主細(xì)胞，具體方法可為將添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因插入載體pcDNA5/FRT/TO的多克隆位點(diǎn)中，再將該攜帶添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因的中間載體與攜帶FLP酶基因的pOG44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞FLP-In-CHO，經(jīng)篩選得到整合有添加His標(biāo)簽的重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的宿主細(xì)胞。
在上述通過位點(diǎn)特異性整合系統(tǒng)Flp/FRT導(dǎo)入宿主細(xì)胞的中間載體中，所述添加 His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因的上游為Pa 啟動(dòng)子，下游為FRT位點(diǎn)和篩選標(biāo)記，所述篩選標(biāo)記可為潮霉素B抗性基因、新霉素抗性基因或殺稻瘟素抗性基因等任一可用的篩選標(biāo)記基因。其中，以pcDNA5/FRT/TO為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因的重組載體為pcDNA5/FRT/T0-gpE-His。
所述篩選條件可為用濃度為200-400 μ g/mL(優(yōu)選為300 μ g/mL)的潮霉素篩選 1-3周(優(yōu)選為2周)。
用上述重組表達(dá)方法得到的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明還提供一種抗水痘-帶狀皰疹病毒免疫球蛋白的ELISA檢測試劑盒，其中包括了上述重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。具體還可包括包被緩沖液，使蛋白濃度 1 μ g/mL ；50 X 漂洗緩沖液 20ml ；anti-VZV IgG 國際標(biāo)準(zhǔn)品 NIBSC (50IU/ml) 200 μ 1 ； HRP標(biāo)記羊抗人IgG (H+L)抗體20 μ 1 ；可溶性TMB顯色底物20ml ；反應(yīng)終止液20ml。
本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法。該方法是將去除跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)并添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白EfelycoproteinE，gpE)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，經(jīng)表達(dá)得到重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。該表達(dá)方法在保留水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)蛋白分子的抗原決定簇的同時(shí)去除其跨膜區(qū)(疏水區(qū))和胞內(nèi)區(qū)，且在重組蛋白的C末端引入His標(biāo)簽，該方法既有助于提高目的蛋白的表達(dá)量，又簡化了下游的純化工作，可較容易地實(shí)現(xiàn)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的規(guī)模化生產(chǎn)，且批間質(zhì)量穩(wěn)定。可以本發(fā)明的重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E作為捕獲抗原，建立水痘-帶狀皰疹病毒的間接ELISA檢測方法，用于血漿樣本中抗水痘-帶狀皰疹病毒特異性免疫球蛋白的檢測，因此，本發(fā)明對(duì)于提高臨床診斷VZV感染的準(zhǔn)確性，以及其它需要VZV特異性免疫球蛋白進(jìn)行高通量檢測的領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為野生型全長VZV gE和本發(fā)明重組截短型VZV gE的分子模式圖
圖2為PCR擴(kuò)增的截短型VZV gpE基因的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果
圖3為重組表達(dá)載體pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的BamH I和EcoR V雙酶切鑒定結(jié)果
圖4為重組表達(dá)載體pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的PCR鑒定結(jié)果
圖5為重組表達(dá)載體pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的結(jié)構(gòu)示意圖
圖 6 為轉(zhuǎn)染后 0、5、10、15 天的轉(zhuǎn)染 pcDNA5/FRT/T0-gpE-His 的 FLPHn-CHO 細(xì)胞和未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的FLP-In-CHO陰性對(duì)照細(xì)胞(作為篩選終止對(duì)照細(xì)胞)的LEICADMI 3000B 顯微鏡觀察結(jié)果(10X40)
圖7A為用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行的重組截短型VZV gpE的flfestern Blot鑒定結(jié)果
圖7B為用抗VZV gpE多抗進(jìn)行的重組截短型VZV gpE的^festern Blot鑒定結(jié)果
圖8為純化重組截短型VZV gpE的AKTA explore 100譜圖
圖9為經(jīng)純化的重組截短型VZV gpE的10% SDS-PAGE檢測結(jié)果
圖10為經(jīng)純化的重組截短型VZV gpE抗原性的flfestern Blot檢測結(jié)果
圖11為用本發(fā)明重組截短型VZV gpE蛋白進(jìn)行水痘-帶狀皰疹病毒的ELISA檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式
本發(fā)明是利用基因重組技術(shù)對(duì)相應(yīng)的抗原進(jìn)行重組表達(dá)而得到重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。該方法將截短的gpE基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞基因組中進(jìn)行表達(dá)，再通過純化方法獲得成分較為單一的rgpE。
已知成熟gpE蛋白分子的N端和C端磷酸化修飾和糖基化修飾占蛋白總重的 25%，因此選用能夠?qū)χ亟M蛋白進(jìn)行較完整的磷酸化和糖基化修飾，是保證重組蛋白具有與天然蛋白相一致的抗原性的關(guān)鍵。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行較為完整的糖基化修飾的工程細(xì)胞主要包括CHO、HEK293和BHK，這些細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白與天然蛋白相比具有十分接近的構(gòu)象，而 CHO細(xì)胞又最為常用，已成功表達(dá)出多種重組人藥用蛋白，且這些蛋白的生理功能均依賴蛋白分子的糖基化修飾。
基因工程常采用通過隨機(jī)整合的方式將外源攜帶有目的基因的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組中，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，基因組存在大約15000個(gè)以上的整合位點(diǎn)， 其中位于轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的僅15個(gè)左右，這就造成利用隨機(jī)整合的方法進(jìn)行外源基因的整合時(shí)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的整合機(jī)率僅有千分之一，目的蛋白的表達(dá)差異量可達(dá)95%以上。因此，用此類方法進(jìn)行高表達(dá)細(xì)胞株的篩選時(shí)，需耗費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間。
位點(diǎn)特異性整合表達(dá)技術(shù)可以快速而準(zhǔn)確地將外源目的基因整合到細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，從而快速獲得表達(dá)量較高的細(xì)胞株，而且基因拷貝數(shù)確定、無差異，外源基因在各細(xì)胞克隆之間的表達(dá)水平十分接近(Cone RD, Mulligan RC. High-efficiency gene transfer into mammalian cells !generation of helper-free recombinant retrovirus with broad mammalian host range. Proc Natl Acad Sci. 1984, USA 81: 6349-6535)。Flp/FRT的表達(dá)系統(tǒng)即是其中之一，其基本原理是在工程細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)引入Flp重組酶特異識(shí)別位點(diǎn)FRT序列，當(dāng)用同樣具有FRT序列的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，在Flp的介導(dǎo)下可將外源基因定點(diǎn)整合在細(xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)(Broach JR, Guarascion VR, Jayaram Μ. Recombination within the yeast plasmid 2micro circle is site-specific. Cell. 1982,29 :227-234.)。Flp-In-CHO 細(xì)胞即是在轉(zhuǎn)錄活性區(qū)具有整合位點(diǎn)FRT的細(xì)胞系之一。
基于以上研究和分析，本發(fā)明提出了重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白 E的技術(shù)方案，并以下述實(shí)施例給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E (gpE)的重組表達(dá)
本發(fā)明水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)(簡稱截短型VZV-gpE) 的重組表達(dá)方法，包括以下步驟
一、截短型VZV gpE基因的獲得
(1)擴(kuò)增VZV gpE基因的引物設(shè)計(jì)和合成
圖1示出野生型全長VZV gpE和本發(fā)明重組截短型VZV gpE的分子模式圖，與野生型全長VZV gpE相比，本發(fā)明重組截短型VZV gpE去除了跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，并在C端添加 7 His標(biāo)簽。依據(jù)NCBI公布的VZV基因組gpE序列(登錄號(hào)=GenBank AY253715. 1)，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成兩條引物，并在下游引物(gpE/R)中引入編碼His標(biāo)簽的DNA序列，引物序列為
gpE/F 5' -CGC AGG ACA GTT AAT AAA CCT GTG-3‘禾口
gpE/R 5' -CGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGC MG CCC TCC GGT CCA-3'。
(2) VZV基因組DNA的獲取
人胚肺二倍體細(xì)胞MRC 5 (第19代，購自ATCC)，使用DMEM(高糖，購自Hyclone) 培養(yǎng)基，10%胎牛血清(購自GIBC0)培養(yǎng)條件，于37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 1 2傳代4 后，即細(xì)胞80%布滿單層，按照0. 01M0I接種密度接種VZV Oka疫苗，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，將血清降至培養(yǎng)約4-5d，75%細(xì)胞以上發(fā)生病變時(shí)收毒，病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，取200 μ 1上清液提取基因組DNA (High Pure Viral Nucleic Acid Kit，購自 Roche)0
(3)截短型VZV gpE DNA片段的擴(kuò)增
以VZV基因組DNA為模板，使用上述引物gpE/F和gpE/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為(總體積 50 μ 1)基因組模板 1 μ 1，KOD Plus(購自 Τ0Υ0Β0)1μ l，10XBuffer5y 1， 25mM MgSO4 2μ l,2mM dNTPs 5 μ 1，gpE/R 各 1μ l(20pmols), ddH20 34 μ 1 ；PCR 擴(kuò)增條件為95°C 預(yù)變性 5min，95°C 30s ^ 58°C 30s ^ 72°C 2min (30 個(gè)循環(huán))，72°C 5min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(M :DL2000 DNA Marker ；a 以VZV基因組DNA為模板，使用引物gpE/F和gpE/R擴(kuò)增出的截短型VZV gpE基因；b =MRC 5細(xì)胞基因組作為模板的陰性對(duì)照)，顯示獲得了長度約1620bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小相符，使用DNA凝膠回收試劑盒回收該目的片段。
(4)截短型VZV gpE克隆載體的構(gòu)建
將回收并純化的VZV gpE DNA片段使用普通Taq酶在3，末端引入dATP，將其連接至克隆載體PMD-18T(購自TaKaRa)的多克隆位點(diǎn)中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP 10，將 BamH I/EcoR V雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，選取序列正確且BamH I位點(diǎn)在目的片段上游的陽性克隆，命名為pMD-18T-gpE-His，用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。
二、重組表達(dá)載體 pcDNA5/FRT/T0-gpE-His 的構(gòu)建
將質(zhì)粒pMD-18T-gpE-His 和載體 pcDNA5/FRT/T0 (購自 invitrogen)分別用BamHI/EcoR V雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳分離后，回收質(zhì)粒 pMD-18T-gpE-Hisl620bp (目的基因-截短型 VZV gpE 基因)和載體 pcDNA5/FRT/T0 5100bp 的DNA片段，再將回收的目的基因與載體pcDNA5/FRT/TO的大片段用T4DNA連接酶(購自 NEB)進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP 10，擴(kuò)大培養(yǎng)單個(gè)菌落后提取質(zhì)粒，用BamH I 和EcoR V進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示(M:DL5000DNA Marker ；質(zhì)粒為使用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR V消化后獲得的DNA片段，泳道a_l與預(yù)期一致，其中2700bp為載體pMD-18T片段，1600bp為截短型VZV gpE基因片段)，結(jié)果經(jīng)雙酶切獲得了 2700bp的載體PMD-18T片段和1600bp的截短型VZV gpE基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再對(duì)質(zhì)粒用引物gpE/F和gpE/R進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定結(jié)果如圖4所示(M :DL2000 DNA Marker ；質(zhì)粒使用引物gpE/F和gpE/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，泳道a_l均出現(xiàn)與預(yù)期大小1600bp —致的DNA片段(其中b、k為陰性克隆而未擴(kuò)增出該目的片段)，最后對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了插入序列及位置均正確的攜帶有截短型VZV gpE基因的重組表達(dá)載體及其菌株，將該重組表達(dá)載體命名為pCDNA5/FRT/T0-gpE-His (其物理圖譜如圖5所示)。
三、FLP-In-CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、篩選及克隆化
(I)FLP-In-CHO 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(購自Invitrogen)將步驟二構(gòu)建的重組表達(dá)載體pcDNA5/ FRT/T0-gpE-His 轉(zhuǎn)染 FLP-In-CHO 細(xì)胞(購自 hvitrogen)，同時(shí)設(shè)立 pcDNA5/FRT/T0 轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照，未轉(zhuǎn)染任一質(zhì)粒的細(xì)胞作為篩選的陰性對(duì)照。具體方法包括以下步驟
①細(xì)胞的準(zhǔn)備=FLP-In-CHO細(xì)胞傳入6孔板，使用D/F12培養(yǎng)液(購自HyClone)、5%新生牛血清(購自GIBC0)、37°C、5% CO2、飽和濕度中培養(yǎng)Mh，待細(xì)胞長成70%單層時(shí)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清D/F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，每孔加入無血清培養(yǎng)基2mL，即為備用細(xì)胞。
②脂質(zhì)體/DNA的準(zhǔn)備將20 μ 1脂質(zhì)體Lipofectine溶入200 μ 1無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫放置40min，取2 μ g經(jīng)除菌的重組質(zhì)粒DNA pcDNA5/FRT/T0-gpE-His和 1 μ g pOG44質(zhì)粒(購自！Iomega)溶入200 μ 1無血清培養(yǎng)基中，混勻后，置于室溫備用，將制備好的DNA與脂質(zhì)體輕輕混合均勻，室溫放置10-15min，即得到包裹好的脂質(zhì)體/DNA。空白載體對(duì)照采用同樣的方法。
③細(xì)胞轉(zhuǎn)染將制備好的脂質(zhì)體-DNA混合物小心滴加至備用細(xì)胞培養(yǎng)基表面，于 37°C,5% CO2飽和濕度中孵育6h，棄去混合液，加入含10%小牛血清的D/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-7池，視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代。
(2)抗性細(xì)胞的篩選及克隆化
將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行傳代，生長24h后，更換為選擇性培養(yǎng)基(含5% 新生牛血清和300 μ g/mL的潮霉素B)D/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，間隔2d換液一次，待陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡時(shí)，得到具有潮霉素B抗性的CHO細(xì)胞(轉(zhuǎn)染表達(dá)載體中攜帶抗性基因，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可在選擇培養(yǎng)基中生長)。
利用有限稀釋法對(duì)獲得的潮霉素B抗性的CHO細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，具體方法如下
①待抗性細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用適量的0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞收縮變圓，用吸管充分吹打細(xì)胞，將細(xì)胞分散為單個(gè)細(xì)胞懸液；
②取少量細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞；
③細(xì)胞懸液進(jìn)行連續(xù)倍數(shù)稀釋后，將制備好的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，使細(xì)胞濃度在每孔有1-2個(gè)細(xì)胞的水平，每孔加入0. ImL含10%新生牛血清的D/F12培養(yǎng)基，于 37°C>5% CO2飽和濕度培養(yǎng)；
⑤每日觀察培養(yǎng)板各孔細(xì)胞情況，孵育4-5d，挑選含單個(gè)細(xì)胞的孔；
⑥待克隆長至孔底面積的約2/3時(shí)，用適量的0. 25%胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)種至M孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)；
⑦按照同樣的方法，待細(xì)胞長滿孔底面積的約2/3時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)種至6孔板，繼而擴(kuò)大培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，即可按常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代及凍存細(xì)胞。
使用LEICA DMI 3000B 顯微鏡觀察 pcDNA5/FRT/T0-gpE_His 轉(zhuǎn)染的 FLP-In-CHO 細(xì)胞和FLP-In-CHO陰性對(duì)照細(xì)胞，第0、5、10、15天篩選結(jié)果如圖6所示，篩選的初始和篩選后第5天兩孔細(xì)胞密度較一致，在篩選的第10天對(duì)照細(xì)胞較轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/T0-gpE-Hi 的CHO細(xì)胞死亡較多，而在篩選第15天(篩選結(jié)束)時(shí)，轉(zhuǎn)染pCDNA5/FRT/T0-gpE-His的細(xì)胞已有明顯的細(xì)胞簇生長，而陰性對(duì)照細(xì)胞幾乎全部死亡。
四、重組截短型VZV gpE的鑒定
將步驟三中獲得具有抗性的細(xì)胞克隆在M孔板中長至約80%時(shí)，收集上清，采用 EPS 601(購自GE Healthcare)60V-120V電泳系統(tǒng)、5% -10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，待蛋白分子量最小的條帶移動(dòng)至膠的底層時(shí)，結(jié)束電泳，使用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。
上述SDS-PAGE電泳結(jié)束以后，使用EPS 6020mA穩(wěn)定電流，將凝膠上的蛋白分子轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(0.45 μ m，購自BioRad)，轉(zhuǎn)膜后用含2% BSA、0. 5% Tween 80的 PBS緩沖液封閉池，重組糖蛋白E分別使用羊抗VZV gpE多抗(購自SANTA CRUZ)、小鼠抗 His標(biāo)簽單抗(購自TIANGEN)作為一抗，HRP標(biāo)記兔抗羊IgG(H+L)抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(均購自中衫金橋公司)作為二抗進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后， 以Super ECL Plus顯色系統(tǒng)(購自普力萊公司)顯色并使用IQuant Capture 350成像儀 (購自GE Healthcare)拍照觀察。
結(jié)果如圖7A和圖7B所示(泳道a-d 轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的不同細(xì)胞克隆表達(dá)上清；泳道e 轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/T0載體的FLP-In-CHO陰性對(duì)照細(xì)胞表達(dá)上清)， 可以看出，轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的不同細(xì)胞克隆在70kDa處均有蛋白印記，與預(yù)期蛋白分子量相一致，表明經(jīng)重組表達(dá)獲得了目的蛋白。
五、重組截短型VZV gpE蛋白的純化和鑒定
收集步驟三中擴(kuò)大培養(yǎng)的克隆化CHO細(xì)胞(pcDNA5/FRT/T0-gpE-Hi s轉(zhuǎn)染的 FLP-In-CHO細(xì)胞)表達(dá)上清，采用Ni-NTA親和層析樹脂(購自Qiagen公司)進(jìn)行純化，具體步驟如下
(1)純化所需緩沖液
①柱平衡液(CB):20mM Na2HPO4,0. 5M NaCl, pH 7. 4。
②洗脫緩沖液(EB):20mM Na2HPO4,0. 5M NaCl,200mM 咪唑，pH 7. 4。
以上緩沖液均使用0. 22 μ m濾膜除菌過濾，備用。
(2)細(xì)胞上清的預(yù)處理
細(xì)胞表達(dá)上清4000g離心30min后取上清，使用0. 22 μ m濾膜除菌過濾后，5倍體積CB置于4°C透析Mh，期間更換透析液2-3次。
(3)介質(zhì)準(zhǔn)備
20mL Ni-NTA介質(zhì)裝入XK1520層析柱(購自GE Healthcare)，過夜至完全沉降， 排除氣泡，連入AKTA explore 100層析儀(購自GE Healthcare)，使用5倍柱床體積CB對(duì)介質(zhì)進(jìn)行洗滌和平衡，流速為2mL/min。
(4)目的蛋白的純化
將O)中處理的CHO細(xì)胞表達(dá)上清連接至層析柱的進(jìn)樣口，設(shè)定上樣流速為2mL/ min ；使用CB平衡5倍柱床體積，至基線接近AU28tlnm零值；再以2_5個(gè)柱床體積的EB洗脫結(jié)合在配基上的目的蛋白，并根據(jù)洗脫峰收集洗脫樣本。AKTA explorelOO譜圖如圖8所示， 表明經(jīng)純化獲得了純度較高的重組截短型VZV gpE蛋白。
(5)重組截短型VZV gpE蛋白純化后的純度和抗原性鑒定
使用步驟四的方法對(duì)上述(4)純化后蛋白的純度和抗原性進(jìn)行鑒定，經(jīng)純化的重組截短型VZV gpE的10% SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖9所示(M 蛋白分子量Marker ；泳道a_c 不同AU28tlnm吸光值的洗脫峰樣品；泳道d 純化前表達(dá)上清)，經(jīng)過親和層析純化后，去除了 CHO細(xì)胞表達(dá)上清中的大部分雜質(zhì)蛋白，獲得了較單一的條帶；純化前后重組截短型VZV gpE抗原性的Wfestern Blot檢測結(jié)果如圖10所示(泳道a_c 不同AU28tlnm吸光值的洗脫峰樣品；泳道d 純化前表達(dá)上清)，結(jié)果顯示，純化后的重組蛋白(泳道a c)可被VZV-gpE 抗體識(shí)別，說明保留了目的蛋白抗原決定簇的活性。
實(shí)施例2、重組截短型VZV gpE蛋白在水痘-帶狀皰疹病毒的ELISA檢測中的應(yīng)用
用本發(fā)明重組截短型VZV gpE蛋白進(jìn)行水痘-帶狀皰疹病毒的ELISA檢測，具體方法包括以下步驟
一、rgpE間接ELISA方法的建立
(I)ELISA檢測體系的緩沖液及試劑
①包被緩沖液50mM碳酸鹽緩沖液，取1. 76g Na2CO3, 2. 86g NaHCO3加入到900mL 去離子水中，調(diào)至pH 9. 6，用IL容量瓶定容。0. 22 μ m濾膜過濾保存。
②漂洗緩沖液=NaCl8. 76g,Tris 堿 2. 42g，0. 05% Tween (V/V)，加入到 800mL 去離子水中，用HCl調(diào)pH 7. 4，用IL容量瓶定容。0. 22 μ m濾膜過濾保存。
③樣品稀釋液②中漂洗緩沖液加入BSA(w/v)即可。
④標(biāo)準(zhǔn)品anti_VZV IgG國際標(biāo)準(zhǔn)品，50IU/mL，購于英國NIBSC。
⑤酶標(biāo)抗體HRP標(biāo)記羊抗人IgG (H+L)抗體，購自中衫金橋公司。
⑥TMB顯色底物可溶性TMB顯色底物，購自TIANGEN。
⑦終止液2MH2SO4。
(2)抗原包被
使用BCA法對(duì)純化后的蛋白(本發(fā)明重組截短型VZV gpE蛋白)進(jìn)行濃度測定， 為612yg/mL，使用包被緩沖液按照1 600倍稀釋包被聚丙烯微量滴定板，即包被蛋白濃度為lyg/mL，每孔150μ 1，置于4°C 24h，再以含有2% BSA的漂洗緩沖液(每孔200 μ 1) 于4°C封閉Mh。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，拍干孔中殘留的液體，置于4°C密封待用。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及血漿樣本中抗VZV-gpE抗體的測定方法
①標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至10IU/mL、5IU/mL、2IU/mL、lIU/mL、0. 5IU/mL，待測血漿樣品以稀釋液按照1 100倍進(jìn)行稀釋，依次加入( 中包被好的微量滴定板中，置于37°C濕盒中作用Ih后，棄去各孔中的標(biāo)準(zhǔn)品/血漿樣品，于吸水紙上拍干。
②每孔加入300 μ 1漂洗液，于振蕩器作用^lin，棄去漂洗液，拍干；重復(fù)3次。
③每孔加入1 5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG (H+L)抗體，置于37°C濕盒中作用Ih后，棄去2抗。
④重復(fù)②的操作。
⑤每孔加入TMB顯色底物液100 μ 1，避光作用30min，使用2M H2SO4終止。
⑥紫外分光光度計(jì)450nm光波處讀取吸光值。
⑦以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的一元二次方程。
標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖11所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0. 68+0. 32x-0. 02x2。
⑧將測得的血漿樣品OD值代入⑦中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線或方程中，計(jì)算抗VZV gpEIgG的濃度。
二、rgpE間接ELISA法特異性和靈敏度的分析
(1)血漿樣本
①VZV IgG (FAMA法測定)陰性且HSV IgG陰性(IFAT法測定)血漿樣本30份。
②VZV IgG (FAMA法測定)陰性且HSV IgG陽性(IFAT法測定)血漿樣本22份。
③VZV IgG(FAMA法測定)弱陽性(1 2 1 16，來自接種疫苗4周人群的血漿樣本)且HSV IgG陰性(IFAT法測定)血漿樣本47份。
④VZV IgG(FAMA法測定)強(qiáng)陽性(彡1 32)，多為帶狀皰疹恢復(fù)期患者血漿樣本)且HSV IgG陰性(IFAT法測定)血漿樣本83份。
以上樣本用于驗(yàn)證本水痘-帶狀皰疹病毒間接ELISA法的特異性。
(2)參考商品anti-VZV IgG間接ELISA試劑盒
以使用純化VZV糖蛋白(VZV whole-gp)包被的Virion(ELISA Classic VZV IgG, 購自德國 Serion 公司)和 VaccZyme (anti-VZV glycoprotein IgG，購自英國的 Binding Site公司)作為對(duì)照，驗(yàn)證本發(fā)明水痘-帶狀皰疹病毒的間接ELISA法的靈敏度。
(3)測定及結(jié)果
同一份血漿樣品分別使用三種檢測體系(Virion、VaccZyme和本發(fā)明重組截短型 VZV gpE)進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示，用本發(fā)明重組截短型VZV gpE蛋白進(jìn)行水痘-帶狀皰疫病毒的間接ELISA法(參見步驟一的操作)的特異性為100%，靈敏度與Virion的相關(guān)性為88%，與VaccZyme的相關(guān)性為81 %，說明其作為血漿中VZV特異性免疫球蛋白的檢測方法具有可行性，并且使用工程細(xì)胞株表達(dá)的抗原穩(wěn)定性好，易于批量生產(chǎn)，適用于高通量的樣本檢測。
表1 VZV gpE間接ELISA法的的特異性和靈敏度
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法，是將去除跨膜區(qū)(疏水區(qū))和胞內(nèi)區(qū)并添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白E (glycoproteinE, gpE)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，經(jīng)表達(dá)得到重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述His標(biāo)簽位于水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的羧基(C)端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因可通過位點(diǎn)特異性整合系統(tǒng)Flp/FRT導(dǎo)入宿主細(xì)胞，具體方法為 將添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因插入載體pcDNA5/FRT/T0的多克隆位點(diǎn)中，再將該攜帶添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因的中間載體與攜帶FLP酶基因的pOG44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞FLP-In-CHO，經(jīng)篩選得到整合有添加His標(biāo)簽的重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的宿主細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在所述通過位點(diǎn)特異性整合系統(tǒng)Flp/FRT 導(dǎo)入宿主細(xì)胞的中間載體中，所述添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因的上游為Paw啟動(dòng)子，下游為FRT位點(diǎn)和篩選標(biāo)記，所述篩選標(biāo)記可為潮霉素B抗性基因、新霉素抗性基因或殺稻瘟素抗性基因等任一可用的篩選標(biāo)記基因；以pcDNA5/FRT/T0 為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的基因的重組載體為 pcDNA5/FRT/T0-gpE-His。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述篩選條件為用濃度為 200-400 μ g/mL的潮霉素篩選1_3周。
6.用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述重組表達(dá)方法得到的重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。
7.權(quán)利要求6所述的重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E在抗水痘-帶狀皰疹病毒免疫球蛋白的ELISA檢測方法中的應(yīng)用。
8.一種抗水痘-帶狀皰疹病毒免疫球蛋白的ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求6所述的重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還包括包被緩沖液，包被蛋白濃度1 μ g/mL ；50 X漂洗緩沖液20ml ；anti-VZV IgG國際標(biāo)準(zhǔn)品NIBSC (50IU/ ml) 200 μ 1 ；HRP標(biāo)記羊抗人IgG (H+L)抗體20 μ 1 ；可溶性TMB顯色底物20ml ；反應(yīng)終止液 20ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其應(yīng)用。該方法是將去除跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)并添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，經(jīng)表達(dá)得到重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。該表達(dá)方法有助于提高目的蛋白的表達(dá)量，簡化了下游的純化工作，可較容易地實(shí)現(xiàn)蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，且批間質(zhì)量穩(wěn)定。以本發(fā)明重組蛋白作為捕獲抗原可用于血漿樣本中抗水痘-帶狀皰疹病毒特異性免疫球蛋白的間接ELISA檢測，可提高臨床診斷VZV感染的準(zhǔn)確性，并用于其它需要VZV特異性免疫球蛋白進(jìn)行高通量檢測的領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/38GK102517302SQ20111044806
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者馮晶晶, 呂茂民, 唐倩, 王卓, 王建國, 章金剛, 馬玉媛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所