專利名稱：一種無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中21號(hào)染色體數(shù)目異常的試劑盒，特別是涉及以多重 雜交特異擴(kuò)增技術(shù)通過檢測(cè)母血漿中胎兒游離核酸多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三 體綜合征的試劑盒。
背景技術(shù)：
21-三體綜合征是胎兒最常見的染色體病，在新生兒中的發(fā)病率約為1/800，占小 兒染色體病的70-80%，發(fā)病率隨著母親年齡的增高而增高。目前我國(guó)大約有100萬以上的 患者，平均20分鐘就有一例21-三體綜合征患兒出生，全國(guó)每年出生的21-三體綜合征患 兒可多達(dá)27萬例左右。21-三體綜合征患者由于多了 1條第21號(hào)染色體，主要表現(xiàn)為智力 低下，發(fā)育遲緩和特殊面容。由于21-三體綜合征給父母、家庭和社會(huì)帶來了無可挽回的痛 苦和沉重的精神負(fù)擔(dān)，因此對(duì)高齡孕婦等高危人群進(jìn)行產(chǎn)前診斷尤為重要和必要。當(dāng)前在 進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)，必須采取創(chuàng)傷性的手段獲取胎兒細(xì)胞樣本如羊水或者絨毛組織，盡管這 些創(chuàng)傷性的手段相對(duì)比較安全，但是對(duì)胎兒和母親仍然存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床上只對(duì) 可能懷有遺傳異常胎兒的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。為了避免潛在的風(fēng)險(xiǎn)，在過去幾十年 中，人們一直廣泛應(yīng)用的方法是從母血中分離胎兒有核紅細(xì)胞，但是由于胎兒有核紅細(xì)胞 在母血中含量稀少，需要進(jìn)行細(xì)胞富集等種種操作程序限制了該方法的發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用。2000年，Poon等發(fā)現(xiàn)了母血漿中存在胎兒游離核糖核酸(RNA)。目前研究發(fā)現(xiàn)母 血漿胎兒RNA的穩(wěn)定存在可能是由于合體滋養(yǎng)層微顆粒的保護(hù)而避免了血漿中RNA酶的 消化作用，同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)胎盤是游離胎兒RNA主要的來源，并且來源于胎盤的RNA容易 被檢測(cè)到。母血漿中一些胎兒游離RNA同性別無關(guān)，且母親自身無表達(dá)，如位于21號(hào)染色 體上胎盤特異表達(dá)的PLAC4基因。由于在一個(gè)正常胎兒，人類染色體的二倍體性使得雜合 性SNP (單核苷酸多態(tài)性)其等位基因劑量比例將會(huì)出現(xiàn)1 1，而對(duì)于一個(gè)21-三體的患 兒，其等位基因的劑量比例將會(huì)為1 2或者2 1。對(duì)于基因編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)而言，每 條染色體上特定基因攜帶的這些SNP位點(diǎn)必將隨著轉(zhuǎn)錄而傳遞到mRNA (信使RNA)上，成為 “RNA-SNP”，雜合性的RNA-SNP位點(diǎn)的基因劑量比例也必定符合基因組DNA雜合性SNP劑量 的比例情況，因此可以用母血漿中胎盤表達(dá)的mRNA來無創(chuàng)性的評(píng)估胎盤細(xì)胞染色體數(shù)目 異常與否，也就可以評(píng)估胎兒染色體數(shù)目異常與否。多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex Hybri dization-specific Amplification, MHSA)，是一種靈敏度極高的相對(duì)定量技術(shù)，它利用核酸雜交、連接反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可 以在同一反應(yīng)體系內(nèi)檢測(cè)多達(dá)40個(gè)不同核酸序列拷貝數(shù)變化，最低只需要20ng核酸樣本 并且可以檢測(cè)到序列內(nèi)單個(gè)核苷酸的變化，可用瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺電泳或毛細(xì)管電 泳等方法進(jìn)行檢測(cè)。MHSA的原理是將制備的長(zhǎng)型探針和短型探針同目的基因序列雜交，雜交后短探針 的5’ -端和長(zhǎng)探針的3’ -端彼此能夠通過連接酶連接成一條DNA片段。不匹配的探針雜 交后不能被連接酶連接。所有被連接的DNA序列都有共同的5’和3’末端，因此可以僅僅用一對(duì)引物在一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增不同的目的基因序列。由于長(zhǎng)型探針有片段大小可變的中 間序列，因此每對(duì)MHSA探針組可以擴(kuò)增出特定片段大小的一段序列。通過電泳的方法即可 以分辨出不同的目的基因序列。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于染色體疾病、SNP位點(diǎn)檢測(cè)和mRNA 表達(dá)研究。本發(fā)明人應(yīng)用多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)并結(jié)合電泳，通過精確定量母血漿中胎兒21 號(hào)染色體上胎盤特異表達(dá)的PLAC4的SNP劑量比例，建立一種可以快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)性篩查 21-三體的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒，該試劑盒以 多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)(MHSA)檢測(cè)母血漿中胎兒游離核酸，通過擴(kuò)增21號(hào)染色體特異性 的SNP位點(diǎn)，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物劑量的差異分析染色體數(shù)目異常。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案(1)設(shè)計(jì)一個(gè)五重復(fù)合雜交_連接-擴(kuò)增體系，以擴(kuò)增染色體特異性的SNP位點(diǎn)；(2)針對(duì)一組特異性染色體的的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和分析；(3)以電泳法確定擴(kuò)增片段的大小和基因劑量?；谝陨霞夹g(shù)方案發(fā)明的試劑盒，包括(1)提供包括(a)逆轉(zhuǎn)錄酶系及逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)液、(b)雜交反應(yīng)液、(c)耐熱的連接酶和連接反應(yīng)液、(d)可熱啟動(dòng)的耐熱DNA聚合酶和 PCR反應(yīng)體系、(e)質(zhì)控品；(2)通過多重?cái)U(kuò)增體系一次擴(kuò)增所說的多個(gè)SNP位點(diǎn)；(3)擴(kuò)增 后應(yīng)用電泳的方法，檢測(cè)各位點(diǎn)不同的等位基因片段大小和數(shù)目，分析累計(jì)產(chǎn)物發(fā)出的熒 光量來檢測(cè)靶多核苷酸的存在和相對(duì)量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，雜交反應(yīng)液包括1. 5M KC1和20mM Tris-Cl及 探針混合物，特征在于其中使用的探針混合物的序列分別為，針對(duì)rs8130833位點(diǎn)的是5， -GTGCCACAATCTAGAGGGAGAAAGCCTGTGTCCACTGTGGA-3， (SEQ ID N0:1)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCA-3， (SEQID NO: 2)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTAAGCAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCT-3’ (SEQ IDNO 3)；針對(duì)rs7844位點(diǎn)的是5’ -GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATATTGTCATCCGCTTGCTGTGCTGTGGGG-3， (SEQID NO:
4)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAG-3， (SEQID NO:
5)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCCAGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAT-3’ (SEQ IDNO 6)；針對(duì)rs9015位點(diǎn)的是5，-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATCACTGCGCCTACTATACGCAAAAGGGCCCCTGG-3’ (SEQ ID NO :7)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAA-3， (SEQID NO:
58)、5，-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAACTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAT-3， (SEQ ID NO 9)；針對(duì)rsl3643位點(diǎn)的是 5，-GTGCCACAATCTAGAGGGAGACCCAGTTCTGTAAATAACTTGAATCCAGTTGTCTTGTATA-3， (S EQ ID NO 10)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTA-3’ (SEQ IDNO 11)、5，-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGGGTCATTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTG-3’ (SEQ ID NO 12)；針對(duì)rs9305729位點(diǎn)的是5 ’ -GTGCCACAATCTAGAGGGAGATTTAAAATGGTTAAAATGGCTTTAAATGGTGACCAGCTTTGCATG -3，(SEQ IDNO 13)、5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTA-3， (SEQID NO: 14)、5，-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTGGTACCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTG-3， (SEQ ID NO 15)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，PCR反應(yīng)體系包括20mM Tris-Cl, 20mM KCl, 2mMMgCl2，熒光染料標(biāo)記的上游、下游寡核苷酸引物，其中上游和下游寡核苷酸引物的序列 分別是5，-GTGCCACAATCTAGAGGGAGA-3，(SEQ IDNO 16)、5，-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTG-3，(SEQ ID NO: 17)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，雜交反應(yīng)液中探針混合物濃度范圍為 0.01fM-100fM，優(yōu)選范圍為0. lfM-10fM。PCR反應(yīng)體系中上游、下游引物濃度范圍為 0. 05 μ Μ-10. 0 μ Μ，優(yōu)選范圍為 0. 1 μ Μ-1. 8 μ Μ。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以使用合成的特異性探針與染色體特異性 SNP位點(diǎn)雜交，這些探針同SNP位點(diǎn)兩側(cè)毗鄰的特異性區(qū)域進(jìn)行雜交，雜交后短探針的 5’_端和長(zhǎng)探針的3’-端彼此能夠通過連接酶連接成一條DNA片段。不匹配的探針雜交后 不能被連接酶連接?？梢允褂肈NA合成裝置合成所需的寡核苷酸探針，并可用分子篩和快 速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化，然后進(jìn)行氨解處理。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以應(yīng)用熒光染料、生物素、放射性同位素、稀 土金屬元素等標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，用于擴(kuò)增后產(chǎn)物的分離，優(yōu)選應(yīng)用熒光染料標(biāo)記?？梢允?用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，并可用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC) 純化，然后進(jìn)行氨解處理。氨解處理后分別在引物5’端標(biāo)記熒光發(fā)生基團(tuán)，包括6-FAM或 者HEX但不限于這些熒光染料發(fā)光基團(tuán)。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的引物，然后可以使 用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，每人份PCR反應(yīng)體系中加入2單位耐熱DNA聚 合酶，其中耐熱DNA聚合酶優(yōu)選可熱啟動(dòng)的耐熱DNA聚合酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括50mM Tris-HCl, 50mM KCl,4mMMgCl2, IOmM DTT及20pM市售的隨機(jī)引物，每人份逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中加入100單位逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，連接反應(yīng)液包括20mM Tris-HCl, 24mM NaAC, 15mMMgCl2，每人份連接反應(yīng)液中加入1單位連接酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒可使用的待檢樣品是可疑染色體數(shù) 目異常的臨床樣品。本試劑盒旨在檢測(cè)所說可疑臨床樣本的染色體數(shù)目異常是指21號(hào)染 色體數(shù)目異常，包括但不只限于21號(hào)染色體數(shù)目異常等疾病。臨床樣本可以來源于人體各 種組織和體液。用來檢測(cè)染色體數(shù)目異常的RNA來自母血漿中胎兒游離RNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中的質(zhì)控品包括21三體陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性 對(duì)照，其中陰性對(duì)照為正常人DNA，21三體陽性標(biāo)準(zhǔn)品為21三體患者的DNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的多重?cái)U(kuò)增體系包括一個(gè)混合多種 成分在單個(gè)印pendorf管內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；一個(gè)混合多種成分在單個(gè)印pendorf管內(nèi) 的雜交反應(yīng)體系；制備一個(gè)混合多種成分在單個(gè)eppendorf管內(nèi)的連接反應(yīng)體系；一個(gè)混 合多種成分在單個(gè)印pendorf管內(nèi)的擴(kuò)增反應(yīng)體系；來源于母血漿中胎兒游離RNA作為模 板。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的多重?cái)U(kuò)增體系是雜交_連接-擴(kuò)增 體系，雜交_連接-擴(kuò)增體系可以同時(shí)擴(kuò)增至少兩個(gè)染色體特異性SNP位點(diǎn)，優(yōu)選五個(gè)SNP 位點(diǎn)，包括rs8130833、rs7844、rs9015、rsl3643、rs9305729進(jìn)行五重復(fù)合雜交-連接-擴(kuò) 增。五重復(fù)合雜交-連接-擴(kuò)增體系的擴(kuò)增產(chǎn)物由兩個(gè)或者兩個(gè)以上的DNA擴(kuò)增片段構(gòu)成， 擴(kuò)增產(chǎn)物的量同各自位點(diǎn)的起始濃度成正比例。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，雜交-連接-擴(kuò)增體系可以同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或者 兩個(gè)以上的染色體特異性核酸位點(diǎn)，包括以上SNP位點(diǎn)但不限于SNP位點(diǎn)，也可以對(duì)其他核 酸片段進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由兩個(gè)或者兩個(gè)以上的核酸片段構(gòu)成，產(chǎn)物的量同各自位 點(diǎn)的起始濃度成正比例。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的雜交_連接-擴(kuò)增體系擴(kuò)增反應(yīng)的 循環(huán)數(shù)是15-35循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以用熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增引物。標(biāo)記引物進(jìn)行 擴(kuò)增后，可以用擴(kuò)增產(chǎn)物的累計(jì)熒光值定量分析染色體特異性SNP位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的基因劑量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以根據(jù)SNP位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物等位基因的數(shù)目和 等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)濃度來分析所選染色體的數(shù)目是否存在異常。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，針對(duì)染色體遺傳標(biāo)記SNP位點(diǎn)進(jìn)行多重復(fù)合雜 交-連接-擴(kuò)增。選用的SNP位點(diǎn)是存在于胚胎或者胎兒細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，在人群中存在 多態(tài)性，所擴(kuò)增的產(chǎn)物片段在50-1000bp之間，優(yōu)選在90-500bp之間。應(yīng)用復(fù)合雜交-連 接-擴(kuò)增體系對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，檢測(cè)SNP位點(diǎn)等位基因數(shù)目的差別和基因劑量的 差別，為染色體數(shù)目異常性疾病的分析提供依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小來分析樣本中SNP數(shù)目 和劑量變化。任何可以分離核酸片段大小的方法例如過濾，高效液相色譜，電泳，親和收集 等方法均可用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行分離并定量，優(yōu)選使用毛細(xì)管電泳法分離染色體特異性SNP位點(diǎn)并相對(duì)定量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以至少用一個(gè)SNP位點(diǎn)rs8130833或rs7844 或rs9015位點(diǎn)來分析21號(hào)染色體三體綜合征，優(yōu)選rs8130833、rs7844和rs9015位點(diǎn)兩 個(gè)或者兩個(gè)以上進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以根據(jù)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的累計(jì)熒光值定量檢測(cè) 染色體特異性SNP位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)量，并通過計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)目和每 個(gè)SNP位點(diǎn)擴(kuò)增相對(duì)劑量來分析所選染色體的是否存在染色體數(shù)目異常。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的染色體數(shù)目異常是指人體21號(hào)染 色體數(shù)目異常。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的21號(hào)染色體數(shù)目異常是指21號(hào)染 色體三體和單體，選用21號(hào)染色體特異性的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，其中在21號(hào)染色體上的位點(diǎn) rs8130833、rs7844、rs9015、rsl3643、rs9305729。簡(jiǎn)單地說，本發(fā)明的試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄體系、雜交體系、連接體系、PCR反應(yīng)體系； 選擇來源于母血漿的胎兒RNA作為模板；將胎兒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；在相互配對(duì)的雜交探 針中，至少有1對(duì)以上的雜交探針。探針由長(zhǎng)短兩條構(gòu)成，將制備的長(zhǎng)型探針和短型探針同 目的基因序列雜交，雜交后短探針的5’-端和長(zhǎng)探針的3’-端彼此能夠通過連接酶連接成 一條DNA片段。不匹配的探針雜交后不能被連接酶連接；長(zhǎng)型探針有片段大小可變的中間 序列，因此每對(duì)探針組可以擴(kuò)增出特定片段大小的序列；所有被連接而成DNA序列都有共 同的5’和3’術(shù)端，因此可以僅僅用一對(duì)引物在一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增不同的目的基因序列； 而且PCR緩沖液和擴(kuò)增反應(yīng)需要的Taq酶必須能夠進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。值得特別說明的是，本試劑盒采用一個(gè)五重的雜交_連接-擴(kuò)增體系，可以同時(shí)包 括21號(hào)染色體的五個(gè)SNP位點(diǎn)。通過體系優(yōu)化，可以對(duì)正常樣本中所選的五個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行均 衡擴(kuò)增，也可以對(duì)異常樣本中可能存在的21-三體異常同時(shí)進(jìn)行分析和篩查。為了確保本 發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確性，我們還應(yīng)用21三體患者的DNA作為陽性參考品。借助這些額外標(biāo)準(zhǔn) 品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行平行檢測(cè)，以進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測(cè) 精確度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒的附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。


圖1顯示兩個(gè)正常樣本多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖1A顯示一個(gè)正常男性樣本擴(kuò) 增電泳圖。圖1B顯示一個(gè)正常女性樣本擴(kuò)增電泳圖。圖2顯示兩個(gè)21-三體異常樣本多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。其中圖2A顯示一個(gè)女 性21-三體樣本擴(kuò)增電泳圖。圖2B顯示一個(gè)男性21-三體樣本擴(kuò)增電泳圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 檢測(cè)試劑盒及其使用(1)制備包括下列組成成分的試劑盒逆轉(zhuǎn)錄酶系1管(100 iil/管)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 液1管(650 yl/管)、雜交反應(yīng)液1管(250 yl/管)、連接反應(yīng)液1管(1950 yl/管)、連 接酶1管(50 ill/管)、PCR反應(yīng)液1管(1950 ill/管)、Taq酶1管(50 ill/管)、21三體
8、五重的雜交_連接-擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)置陰陽性對(duì)照,
陽性標(biāo)準(zhǔn)品1管(25 μ 1/管)、陰性對(duì)照1管(25 μ 1/管)。(2)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存1.標(biāo)本采集標(biāo)本為母體血液。血液為常規(guī)取靜脈血5ml，EDTA抗凝處理。2.保存可立即檢測(cè)，4°C保存一周。3.運(yùn)輸標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0°C冰壺。(3)檢測(cè)步驟和結(jié)果分析一、母血漿的收集和處理收集的血樣先用EDTA抗凝，4°C，1600g離心IOmin ；仔 細(xì)轉(zhuǎn)移血漿到平底聚丙烯管中再次4°C，16000g離心lOmin。收集上清到新聚丙烯管中同 TRIzol LS試劑混合。所有樣本-80°C保存直到提取RNA。二、RNA提取及純化RNA提取建議使用Invitrogen的TRIzol LS及Qiagen的 RNeasy MicroKit提取試劑盒。具體步驟如下1. 6ml血漿混合2ml TRIzol LS(Invitrogen) 和0. 4mi氯仿，4°C 12000g離心15min，上清轉(zhuǎn)移到新的聚丙烯管中，用70%的乙醇溶液等 體積混合上清溶液，混合后應(yīng)用RNeasy minicolumn (Qiagen)按照說明書進(jìn)行處理?？俁NA 溶解后用RNase-Free DNase Set(Qiagen)處理去除基因組DNA的污染。組 分反應(yīng)體積PCR 反應(yīng)液39 μ 1Taq 酶1 μ 1連接產(chǎn)物10 μ 1_反應(yīng)體系總量 50 μ 1PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性15分鐘，然后94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共26 個(gè)循環(huán)；最后72°C 10分鐘。四、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳對(duì)于每一個(gè)分析，1μ 1 PCR產(chǎn)物和 13. 5 μ 1 Hi_Di formamide.O. 5 μ 1 GeneScan R0X-500Size standard混合。95°C加熱變性混合物5分鐘，放置冰上至少1分鐘，瞬時(shí)離 心混合物。上樣ABI310/ABI3100遺傳分析儀，然后應(yīng)用軟件進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果圖譜如圖 1A，圖1B，圖2A，圖2B，所示。其中圖1A，圖IB為正常男性和正常女性的結(jié)果分析圖譜。實(shí)施例2 通過MHSA擴(kuò)增21號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)21-三體綜合征選取2份母體血漿，其胎兒疑似21-三體綜合征，應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒按照上述 標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行RNA提取純化。每個(gè)樣本RNA使用DEPC水溶解，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并上樣分析。 最后的PCR體系同時(shí)擴(kuò)增rs8130833，rs7844, rs9015, rsl3643, rs9305729等五個(gè)位點(diǎn)，上 樣結(jié)果的分析圖譜如圖2A，圖2B。如圖所示，21號(hào)染色體上的兩個(gè)位點(diǎn)rs8130833，rs7844， 擴(kuò)增分析位點(diǎn)的基因型，由于形成2 1的峰(面積)或者1 2的熒光峰(面積)，因此 可判斷為為21-三體綜合征，本試劑盒可實(shí)現(xiàn)快速無創(chuàng)檢測(cè)21-三體綜合征。序列表<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司<120> 一種無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒<140><141><160>17<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>1gtgccacaatctagagggagaaagcctgtgtccactgtgga
<210>2<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>2gggttccctaagcaatcgttgaagtagttgatggaaatgagggaacactca
<210>3<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>3gggttccctaagcaatcgttgtaagcaagtagttgatggaaatgagggaacactct-<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>4gtgccacaatctagagggagaatattgtcatccgcttgctgtgctgtgggg<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>5gggttccctaagcaatcgttgaaaaagtagaggaaaaagtgtgtggttaag<210>6<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>6gggttccctaagcaatcgttgcccagaaaaagtagaggaaaaagtgtgtggttaat<210>7<211>56<212>DNA<213>人工序列
<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>7gtgccacaatctagagggagaatcactgcgcctactatacgcaaaagggcccctgg<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>8gggttccctaagcaatcgttgctctggtgagagagaacaataacaacaaaa<210>9<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>9gggttccctaagcaatcgttgaactgctctggtgagagagaacaataacaacaaat<210>10<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>10gtgccacaatctagagggagacccagttctgtaaataacttgaatccagttgtcttgtata<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>11gggttccctaagcaatcgttgttttatttaatatgtttttgggtatatgta<210>12<211>56<212>DNA
12
<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>12gggttccctaagcaatcgttgggtcattttatttaatatgtttttgggtatatgtg<210>13<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>13gtgccacaatctagagggagatttaaaatggttaaaatggctttaaatggtgaccagctttgcatg<210>14<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>14gggttccctaagcaatcgttgccttggttctcggtgatctagataaagtta<210>15<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交的探針。<400>15gggttccctaagcaatcgttgtggtaccttggttctcggtgatctagataaagttg<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>16gtgccacaatctagagggaga<210>17<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>17gggttccctaagcaatcgttg
權(quán)利要求
一種無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒，試劑盒包括(a)逆轉(zhuǎn)錄酶系及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、(b)雜交反應(yīng)液、(c)耐熱的連接酶和連接反應(yīng)液、(d)可熱啟動(dòng)的耐熱DNA聚合酶和PCR反應(yīng)體系、(e)質(zhì)控品，其特征在于雜交反應(yīng)液包括1.5M KCl和20mM Tris-Cl及探針混合物，其中使用的探針混合物的序列分別為，針對(duì)rs8130833位點(diǎn)的是5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAAAGCCTGTGTCCACTGTGGA-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCA-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTAAGCAAGTAGTTGATGGAAATGAGGGAACACTCT-3’；針對(duì)rs7844位點(diǎn)的是5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATATTGTCATCCGCTTGCTGTGCTGTGGGG-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAG-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCCAGAAAAAGTAGAGGAAAAAGTGTGTGGTTAAT-3’；針對(duì)rs9015位點(diǎn)的是5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGAATCACTGCGCCTACTATACGCAAAAGGGCCCCTGG-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAA-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGAACTGCTCTGGTGAGAGAGAACAATAACAACAAAT-3’；針對(duì)rs13643位點(diǎn)的是5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGACCCAGTTCTGTAAATAACTTGAATCCAGTTGTCTTGTATA-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTA-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGGGTCATTTTATTTAATATGTTTTTGGGTATATGTG-3’；針對(duì)rs9305729位點(diǎn)的是5’-GTGCCACAATCTAGAGGGAGATTTAAAATGGTTAAAATGGCTTTAAATGGTGACCAGCTTTGCATG-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGCCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTA-3’、5’-GGGTTCCCTAAGCAATCGTTGTGGTACCTTGGTTCTCGGTGATCTAGATAAAGTTG-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)體系包括20mMTris-Cl, 20mM KCl，2mMMgCl2，熒光染料標(biāo)記的上游、下游寡核苷酸引物，其中上游和下游寡核苷酸引物的 序列分別是5’ -GTGCCACAATCTAGAGGGAGA-3’、 5’ -GGGTTCCCTAAGCAATCGTTG-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于雜交反應(yīng)液中探針混合物濃度范圍 0.OlfM-lOOfM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)體系中上游、下游引物濃度范圍為 0. 05μΜ-10· ΟμΜ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于每人份PCR反應(yīng)體系中加入2單位耐熱DNA聚合酶’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括50mMTris-HCl, 50mMKCl,4mM MgCl2, IOmM DTT及20pM市售的隨機(jī)引物，每人份逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中加入100單位逆轉(zhuǎn)錄酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于連接反應(yīng)液包括20mMTris-HCl, 24mMNaAC, 15mM MgCl2，每人份連接反應(yīng)液中加入1單位連接酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，特征還在于試劑盒通過多重?cái)U(kuò)增體系一次擴(kuò)增所說的多 個(gè)SNP位點(diǎn)；擴(kuò)增后應(yīng)用電泳的方法，檢測(cè)各位點(diǎn)不同的等位基因片段大小和數(shù)目，分析累 計(jì)產(chǎn)物發(fā)出的熒光量來檢測(cè)靶多核苷酸的存在和相對(duì)量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于多重?cái)U(kuò)增體系是雜交-連接-擴(kuò)增體系，雜 交-連接-擴(kuò)增體系可以同時(shí)擴(kuò)增至少兩個(gè)染色體特異性SNP位點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于雜交-連接-擴(kuò)增體系擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)數(shù) 是15-35循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中21號(hào)染色體數(shù)目異常的試劑盒，特別是涉及以多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)通過檢測(cè)母血漿中胎兒游離核酸多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒。本試劑盒可以快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)性地進(jìn)行21-三體篩查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101871002SQ20091003886
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者李明, 陳華云, 陳嘉昌 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司