專利名稱：生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程技術領域的蛋白編碼序列，具體是一種生菜生育酚 環化酶蛋白編碼序列。
背景技術：
維生素E是一種脂溶性維生素，其天然產物依結構的不同分為八種類型，分 別是a-生育酚、0-生育酚、Y-生育酚、S-生育酚(toc叩herol)和a、 p、 Y、 S-生育三烯酚(tocotrienol)，其中a -生育酚的生物活性最高，被認為 是維生素E的主要活性成分。維生素E對于提高機體免疫能力有著重要的影響， 具有抗衰老的功能，可以消除細胞色素沉淀，改善皮膚彈性，減弱性腺萎縮，因 而在大量保健品和美容用品中廣泛使用。維生素E可以預防和治療多種婦科疾 病，治療早產兒溶血性貧血和蠶豆病，治療營養不良兒童的巨幼紅細胞性貧血。 維生素E可以促進膽汁分泌、膽管形成和膽紅素分泌，對急慢性肝炎和肝硬化有 著治療作用。維生素E可以預防癌癥發生，對于癌癥患者的治療也有重要的輔助 作用。
維生素E合成途徑主要由以下五個步驟組成(1)4-羥苯丙酮酸(HPP)在 4-羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA) ; (2)尿黑酸在尿 黑酸植基轉移酶(HPT)催化下，與植基二磷酸(PDP)發生縮合，生成2-甲基 -6-植基-苯醌；(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基轉移酶(MPBQ MT) 的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌；(4)2,3-二甲基-6-植基-苯醌在生育 酚環化酶(TC)的催化下，生成Y-生育酚；(5) Y-生育酚在Y-生育酚甲基轉 移酶(Y-TMT)的催化下，生成a-生育酚。本發明中，我們從菊科的生菜(Lactuca sativa)中克隆到了生育酚環化酶(tocopherol cyclase, TC)基因，并將該基 因轉化擬南芥，證明它確實對植物中維生素E含量的提高有重要的作用。
經對現有技術的文獻檢索發現，尚未見與生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列有 關的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種生菜生育酚環化酶蛋白 編碼序列。本發明可提高蔬菜中維生素E的含量，改善食物的營養品質，可以使 含生育酚環化酶蛋白編碼序列的轉基因植物成為生物反應器，進而實現維生素E 的大規模生產。
本發明是通過以下技術方案實現的
本發明涉及一種生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列，該序列具有SEQ ID NO. 3 中第6-1526位所示的核苷酸序列及其簡并序列。
所述簡并序列具體指，SEQ ID NO. 3中第6-1526位核苷酸中有一個或多個 密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代而產生的序列。
根據所述生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列編碼的多肽具有SEQ ID NO. 4所示 的氨基酸序列、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
本發明還涉及一種利用生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列提高植物維生素E 含量的方法，包括如下步驟
步驟一，將生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列連于植物表達調控序列上，形成 含生菜生育酚環化酶基因的植物表達載體；
步驟二，將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，通過浸花法轉化擬南芥；
步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有生菜生育酚環化酶基因的轉化細胞并最 終再生轉基因植株及其后代。
本發明中，構建步驟一中含生菜生育酚環化酶基因的植物表達載體時可選用 本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的生 菜生育酚環化酶蛋白多肽時，可以將生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列可操作地連 于表達調控序列，從而形成步驟一中的生菜生育酚環化酶蛋白表達載體。
本發明中，步驟三含有生菜生育酚環化酶基因的轉化細胞為真核細胞。常用 的真核宿主細胞包括酵母細胞、擬南芥和其它植物的生殖細胞或愈傷組織細胞。
本發明具有如下的有益效果本發明可提高蔬菜中維生素E的含量，改善食 物的營養品質；同時本發明可使含生育酚環化酶蛋白編碼序列的轉基因植物成為 生物反應器，實現維生素E的大規模生產；利用本發明的生菜生育酚環化酶蛋白， 通過各種常規篩選方法，可篩選出與生育酚環化酶蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明中所涉及的農桿菌為根癌農桿菌菌株GV3101，該菌株己在《Csaba Koncz， Jeff Schell; The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector, Mol Gen Genet, 1986, 204: 383-396》文獻中公開。根癌農桿菌GV3101 可通過公開市售的商業渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號 為Gambar3。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
實施例
步驟一，生菜生育酚環化酶基因的克隆
(1) RNA的提取
取生菜葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf (EP) 離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA，用甲醛變性 膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
(2) 基因的全長克隆
根據擬南芥中相關基因所編碼的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原 理，采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法進行cDNA全長克隆， 克隆使用Clontech試劑盒，克隆分三個階段進行 ①首鏈cDNA的合成
利用Clontech試劑盒所提供的5' -CDS primer A和SMART II A oligo引物， 以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成5'-RACE -Ready cDNA;利用Clontech試劑盒所提供的3' -CDS primer A為引物，以所提 取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成3'-RACE-Ready cDNA;② 3' -RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的 基因特異引物2 (GSP2，見SEQ ID NO.l)進行3'-RACE PCR反應，用瓊脂糖凝 膠電泳進行檢測并對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體 上進行測序；
③ 5' -RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的 基因特異引物l (GSP1，見SEQ ID NO. 2)進行5'-RACE PCR反應。用瓊脂糖凝 膠電泳進行檢測并對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體 上進行測序。將測序結果的重疊區拼接，得到該基因的完整編碼區序列。BLAST 分析結果證明從生菜中得到的基因確為一個生育酚環化酶的相關基因；
通過上述步驟，獲得了生菜中參與維生素E合成的生育酚環化酶蛋白的全長 編碼序列(SEQ ID NO. 3)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。 步驟二，生菜生育酚環化酶相關基因的序列信息與同源性分析 步驟一中得到的生菜TC(生育酚環化酶)的全長cDNA長度為1675bp (SEQ ID NO. 3)，其中開放閱讀框位于第6-1526位核苷酸，根據所獲得的cDNA推導出生 菜生育酚環化酶的氨基酸序列(見SEQ ID NO. 4)，共506個氨基酸殘基，分子 量為56758. 03，等電點為6. 49。
利用vectorNTI 9. 0軟件對來源于各種植物的生育酚環化酶的相關氨基酸 序列進行同源比對，結果發現，克隆到的生菜生育酚環化酶基因與擬南芥 (Arabidopsis thaliana)，棉花(Gossypiura hirsutum)，小麥(Triticum aestivum) 馬鈴薯(SoIa誦 tuberosum)， 桉樹(Eucalyptus g飄ii)以及向日葵 (Helianthusannuus)中同源基因所編碼的氨基酸序列相似性分別為61%， 57%， 56%， 62%， 64%， 76%。由此可見，生菜TC基因與其他高等植物中的TC相關基因 在所編碼的氨基酸水平上存在較高的同源性，可以認為它們的產物在功能上也有 較高的相似性。
步驟三，生菜生育酚環化酶相關蛋白或多肽在擬南芥細胞中進行真核細胞表 達及轉基因植株的維生素E含量鑒定
(1)含目的基因(生菜TC)的表達載體的構建
6根據生菜TC的全長編碼序列(SEQ ID NO. 3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的 引物，并在正反引物上分別引入BamHI和SacI限制性內切酶位點，以便構建表 達載體。以實施例1中獲得的5'-RACE-Ready cDNA為模板，經PCR擴增后，將 生菜TC的編碼區序列連接至中間載體pMD18-T中進行測序，再將測序正確的TC 的編碼區序列進一步克隆到表達載體pHB中，接著將其轉入根癌農桿菌，并進行 PCR驗證。結果表明，含生菜TC基因的植物表達載體已成功構建到根癌農桿菌 菌株中。
(2) 采用浸花法轉化擬南芥
① 取生長一個月左右、生長狀況良好的植株，轉化前可以提前一個星期將植 物去頂，使植物產生較多的花苞，提高轉化效率，轉化前一天澆水；
② 將含有轉基因載體的農桿菌于28。C培養過夜，至0De。。&2.0， 4， 500 rpm 離心10 min;
③ 菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉化液中，至終濃度OD,"O. 8;
④ 轉化時小盆倒置，確保擬南芥地上部分全部花苞都被浸沒入事先用轉化 Buffer懸浮好的菌液中約5 sec;
⑤ 用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放于一個密封的小盒內以保持濕度， 避光過夜；
⑥ 第二天將植物取出，豎直，轉移到正常條件下生長。待植物長至一定程度 后，將其依附竹簽綁好，以便更好地結實；
⑦ T。代種子成熟后將其整株剪下，過篩。種子鋪于含50 pg/mL潮霉素的篩 選培養基上，4'C春化48 h，移到人工氣候室24 h連續光照條件下生長一周；
⑧ 「待長出綠色的轉基因抗性幼苗后移栽入土繼續生長，轉化子為綠色的幼 苗且根較長；非轉化子基本為黃化苗，或綠色無根幼苗；
⑨ 單株收獲轉基因植株(因轉基因的插入位點不同，每個都是不同的)標成不 同的株系；
⑩ 單株收獲的T2代種子已經出現性狀分離。將種子均勻地鋪到9 cm平板上， 因要確定是否是單位點插入，所以不加抗生素。待長至6-7片真葉后，噴除草劑， 篩選3: l單位點插入的株系，單株收獲。繼續篩選直至獲得純合的轉基因植株。
(3) 轉基因擬南芥植株的PCR檢測
7根據CaMV 35S的序列設計正向引物，根據TC的序列設計反向引物對目的 基因進行檢測。結果表明，用CaMV35S正向引物和TC反向引物能擴增出目的基 因大小的特異DNA片段。而以非轉化擬南芥基因組DNA為模板時，沒有擴增出任 何片段。
步驟四，利用HPLC-UVD測定轉基因擬南芥中維生素E含量
(1) HPLC-UVD條件及系統適用性以及標準溶液的配制
HPLC:采用Waters 2695 s印arations module系統，色譜柱為C-18反相硅 膠柱(Calesil 0DS-100 C18)，具體規格為4.6面內徑X250mm長度，流動 相為甲醇與水，其中，甲醇水的體積比為98: 2，此時，生育酚的出峰時間為 26. 3min,峰型良好，柱溫為30°C，流速1. 0 mL/min，進樣量30叱。
UVD:采用Waters 2996 photodiode array detector系統，紫外光檢測器 檢測波長292nm。精確稱取Sigma公司的生育酚標準品2. 0 mg用1 mL甲醇完全 溶解，得到2 mg/mL生育酚標準品溶液，保存于-2(TC備用。
(2) 標準曲線的制作
將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣5pl、 10|al、 15 pl、 20^1、 30 |al記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X， pg)進行回歸分 析。通過研究，本發明中生育酚在10pg-60 pg范圍內呈現良好的log-log線性 關系。生育酚對照品的log-log線性回歸方程為Y=7.26e+002X+1.09e+004; R=0.999740。
(3) 樣品的制備和生育酚含量的測定
生育酚的提取過程如下取少量新鮮的擬南芥葉片lg-2g (鮮重)，液氮研 磨，用4mL正己烷提取，超聲30分鐘。離心，收集上清液，用氮吹儀吹干，用 適量甲醇溶解提取物，用于HPLC檢測。
采用HPLC-UVD測定生育酚含量，樣品進樣體積為30 pl，根據峰面積代入線 形回歸方程計算出樣品中的生育酚含量(mg)，折合成物質的量(pmol)，再除以 樣品的擬南芥葉片鮮重(mg)，從而計算出擬南芥植株中生育酚的含量。
本實施例顯著提高了擬南芥葉片中維生素E含量，使轉基因植株中維生素E 的含量超過對照的50%以上。由此可見，本發明可作為一種提高植物營養價值的 候選基因，用于利用轉基因技術提高作物維生素E含量的產業化生產中。序列表
<110〉上海交通大學
<120>生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列
<160〉 4
<210> 1
<211〉 25
<212〉 DNA
<213> 生菜(Lactuca sativa) 〈400> 1
gccggttggc ttgctgcttt tcctg 25
<110〉上海交通大學
<120〉生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列
<160〉 4
〈210〉 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 生菜(Lactuca sativa)
<400> 2
acaggaaaag cagcaagcca accgg 25
〈110〉上海交通大學 <120>生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列 <160> 4 <210> 3 <211> 1675 〈212〉 腿
<213> 生菜(Xactuca sativa) <400〉 3
cttcaatgga ctcaaatctg tatacattgc tgcaaagttc cccttactgt ccttcatcgt 60 tactcggttc attt犯acct aatgtgcaaa ccatgcaatc gccgatgaat cgagcgtatt 120 ctggtgatca attgagtatt ccgaggctca aa/ttcgaggg taaacgtcgg ttatctgttg 180<formula>formula see original document page 10</formula>Asp Ser Asn Leu Tyr Thr Leu Leu Gin Ser Ser Pro Tyr Cys Pro
10 15 Asn Val Gin Thr Met Gin Ser
Met 1
Ser Ser Leu
Leu 5
Gly Ser Phe Lys
Leu 20
Pro Met Asn Arg Ala Tyr Ser 35
Lys Phe Glu Gly Lys Arg
Pro 25
Asp Gin Leu Ser
Phe 50
Ala Glu lie Asn Asp 65
Val Lys Glu lie
Gly 40
Leu Ser Val Val
Arg 55
Ser Ser Thr Val Glu 70
Asn Pro Val Tyr
Val 85
Pro His Ser Gly
Lys 60
Val Lys Ala Thr 75
Pro Thr Pro Ser
Met 30
lie Pro Arg Leu 45
Ser lie Pro Lys
Pro Leu Arg Thr 100
Glu Gly Trp Tyr
Val 90
His Phe Asp Gly
Lys Phe Phe 115 Phe
Gin
Asn 130
Pro Leu Asn Gly Leu Glu 145 150 Val Gly Ala Gin lie Leu
Cys Phe Met Gly
Tyr 105
Phe Lys Val Ser lie 120
Ser Val Glu Asn
Tyr 135
Gin Leu Gin Tyr
Glu Asp 80
Asn Arg 95
Thr Thr Arg 110
Pro Glu Arg Lys 125
Ala Phe Lys Lys
Pro 140
Gin Arg Phe
lie 165
His Asn Phe Trp
Gly 155
Gly Ala Asn Asp Glu Tyr lie Cys 170
Ser Arg His Glu
Thr Glu Glu Ser His Asn Phe Trp Gly 180 185 Phe Thr Leu Gin Asn Gly Lys Lys
Thr Gly 160 Gin Tyr 175
Lys Leu
Gly Asn Ser 195
Val Ser Pro Gin Val Phe 210
Thr Pro Leu Trp Asn 225
Tyr Ala Lys Thr Val 245
Val Tyr Gly Trp Gly 260
Asn 200
Asn Gin Ser Val Val 215
Gly Phe
Leu 190
Pro Pro Asn Asn Glu 205
Glu Gly Phe Gin Val 220
Asp Glu Lys
Gin Gly Phe lie Arg Asp Asp Glu Lys Thr Pro 230 235 240
Lys Thr Ala Arg Trp Glu Tyr Ser Thr Arg Pro
250 255 Asn Val Gly Ser Thr Gin Lys Ser Thr Ala Gly 265 270
11Trp Leu Ala 275 Gly
Ala Gly 290 Glu Phe 305
Phe Pro
Gin
Arg
Ser Gly Glu
Gly Leu Ser 355
Gly Gly lie
370 Glu Val 385
His Lys
Ala Phe Pro Val Phe Glu 280
I>eu Ser Thr Gly Trp lie 295
Asn Ala Pro Ser Tyr Ser 310
Lys Trp Phe Trp Val Gin 325
Val Gly Leu Thr 340
Glu Thr Phe Glu
Arg Ala
Cys Thr
Leu lie 450 Gly Pro 465
Val Ser
Pro His Trp Gin lie Cys Met 285
Glu Trp Gly Glu Glu Arg Tyr 300
Glu Lys Asn Trp Gly Gly Gly 315 320 Cys Asn Val Phe Lys Gly Ala 330 335 Gly Gly Leu Arg Gin Leu Pro
Thr
lie
Pro
Ala 435 Leu
Trp
Arg
Ser Phe Pro
Phe Tyr Glu Phe 375
Gin Trp Gly Tyr 390
Glu Leu Glu Ala 405
Thr Thr Glu Ala 420
Asp Leu Thr Leu
Asp Val Thr Ser 455
Phe Asn Thr Trp 470
Ala lie Asn Leu 485
Leu Leu Lys Pro 500
Cys Ala 345
Asn Ala Ala Leu lie 360
Val Pro Trp Asn
Leu Arg Gin 350
Val His Tyr
Gly 365
Val Val Glu Trp
Trp His Val Thr 395
Ser Thr Lys Asp 410
Gly Phe Ala Ala 425
Lys lie Trp Glu 440
Asp Met Ala Ala
Lys Gly Arg Thr 475
Pro lie Asp Val 490
Pro Gly Leu 505
Gly 380
Ala Tyr Asn Glu Thr 400
Pro Gly Thr Thr Leu 415
Ala Cys Lys Asp Thr 430 Asn
Lys
Ala 445
Glu Val
Val 460
Tyr Thr Pro
Gly Lys Gly Gly
Glu lie 480
Glu Gly lie Leu Gly 495
1權利要求
1、一種生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列，其特征在于，具有SEQ ID NO.3中第6-1526位所示的核苷酸序列及其簡并序列。
2、 根據權利要求1所述的生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列，其特征是，所 述簡并序列具體指，SEQ ID NO. 3中第6-1526位核苷酸中有一個或多個密碼子 被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代而產生的序列。
3、 根據權利要求1所述的生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列編碼的多肽，其 特征是，具有SEQIDN0.4所示的氨基酸序列、或其保守性變異多肽、或其活性 片段，或其活性衍生物。
4、 一種利用如權利要求1所述的生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列提高植物 維生素E含量的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列連于植物表達調控序列上，形成含生菜生育酚環化酶基因的植物表達載體；步驟二，將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，通過浸花法轉化擬南芥； 步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有生菜生育酚環化酶基因的轉化細胞并最終再生轉基因植株及其后代。
全文摘要
一種基因工程技術領域的生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列，具有SEQ ID NO.3中第6-1526位所示的核苷酸序列及其簡并序列，該編碼序列編碼具有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；利用該編碼序列提高植物維生素E含量的方法包括如下步驟將生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列連接于植物表達調控序列上，得到含生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列的植物表達載體；將表達載體轉入農桿菌，利用該農桿菌轉化擬南芥；通過抗生素篩選，獲得含有生菜生育酚環化酶蛋白編碼序列的轉化細胞，最終再生轉基因植株及其后代。本發明可提高蔬菜中維生素E的含量，實現維生素E的大規模生產。
文檔編號C12N15/60GK101503696SQ20091004778
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月19日 優先權日2009年3月19日
發明者任薇薇, 唐克軒, 唐岳立, 王玥月 申請人:上海交通大學