專利名稱：一株防治菌核病的生防菌盾殼霉zs-1sb及制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物農藥技術領域，具體涉及一株具有菌核病生防潛能的盾殼霉菌株及半敞開式固體發 酵的培養方法與應用。
背景技術：
核盤菌[5Wero""/asc7er"/or咖(Lib.) de Bary]可以侵染64科540多種植物，包括油菜、大豆、 向曰葵等主要的油料作物和萵苣、大白菜、芹菜、胡蘿卜等重要的蔬菜作物，在世界范圍內引起多種植物 的菌核病。由于迄今為止沒有發現對其具有明顯抗病性的種植資源，沒有抗病品種可以利用，由其引致的 菌核病仍然是農業生產中世界性的難題。目前多采用化學農藥進行控制，如于油菜開花盛期噴施化學農藥 "菌核凈"或"多菌靈"可在一定程度上緩解該病的危害，獲得較為理想的效果。由于菌核病多發生、流 行于油菜生長的中后期，需要有特定的農藥劑量和勞動強度才能使農藥抵達受害部位(油菜的莖部和枝 條)；并且另一個不容忽視的問題是核盤菌的抗藥性，長期大面積使用單一性質的農藥存在極高的風險。 早在1997年，就有學者發現江蘇省通州地區某些田塊的抗"多菌靈"菌株出現頻率高達100%。同時需要 關注的是食品安全和環境污染問題，食品安全問題往往是國際農產品貿易壁壘中的籌碼，要參與國際競爭， 也必需貫徹綠色植保。因此，農藥防治應十分慎重，生產上急切需要建立安全持久的防控技術體系。利用 有益真菌防治植物真菌病害是安全持久的防控技術體系的重要組成部分。
盾殼霉(Cb/^o^m'Mz 則V Ws/7S)無性階段屬于腔孢綱，是植物病原真菌核盤菌的重寄生真菌，也 是菌核病的重要生防真菌，可以寄生和破壞核盤菌的菌絲和菌核。盾殼霉首次由美國學者Campbell (1947) 描述和命名，Whi卯s和Gerlagh (1992)對它的生物學特性及防病潛能給予了論述。盾殼霉的分生孢子可 以添加到土壤或噴施于作物地上部分用來控制多種作物的菌核病(Jones et al, 2003; Li et al, 2006)。 申請人:在前期研究中發現盾殼霉一些菌株可以形成分生孢子器，產生大量的分生孢子(Cheng et al, 2003)， 多年的大田試驗示范表明具有良好的防病效果，并且盾殼霉對植物沒有致病能力，對人畜沒有毒害作用。
與其它生防真菌類似，盾殼霉的開發和應用受到規模化生產的限制，目前高效生產盾殼霉的分生孢子 是商業化應用的關鍵。
發明內容
本發明的目的篩選一株選擇對核盤菌(5b/ero"/7ia sc7ero"Vjia)引起的菌核病具有顯著生物防治 效果的真菌菌株，并通過簡便、易行的半敞開式固體發酵培養方法進行規模化生產，將其開發為多種作物 菌核病的生物防治的微生物菌劑。
本發明自湖北省竹山縣蔬菜種植菜園土壤中分離、篩選得到一株對核盤菌菌核具有極強寄生作用的盾 殼霉菌株ZS-1SB，申請人將其命名為盾殼霉(Co/7iot/u^/u/z/;s/77/^"s) ZS-1SB，該菌株已于2009年5月 31日送交用于專利程序的位于湖北省武漢市武漢大學內的國際生物材料樣品保藏機構--中國典型培養物 保藏中心(英文簡稱CCTCC)，其保藏編號為CCTCC N0: M209U4。
實施例的研究表明，本發明篩選的盾殼霉ZS-1SB菌株對植物病原真菌核盤菌和植物病原細菌水稻白 葉枯病菌(Ja""OTO/ as oirzae pv. wyzae)具有較強的拮抗作用，可作為對菌核病具有生防功能的微生 物菌劑。
盾殼霉ZS-1SB的菌學特征
分生孢子黑褐色、橢球形、表面不平，大小為3.5-4.7umX5.3-8.8ym (平均3.9X6.4um),取幼 嫩(白色小點)的分生孢子器壓片可見成排排列的基部寬闊的產孢細胞。在PDA平板上，菌絲初期無色，
3氣生菌絲不發達，菌絲一邊擴展，菌落表面一邊形成白色分生孢子器，隨培養時間的延長，菌落逐漸變褐， 孢子器吐出黑色水滴即溢出分生孢子。盾殼霉的菌絲在10-28'C范圍內均能生長，最適生長溫度為20'C， 最高溫度為30'C，盾殼霉在pH2-11的環境中均能生長，pH3-4最適宜于其生長。在pH4的PDA平板上菌 落日擴展0.7 cm。
本發明還涉及提供了生產所述的盾殼霉ZS-1SB菌劑的半敞開式固體發酵的規模化培養方法。該方法 采用干燕麥片和米糠為材料，以蒸籠為發酵容器，實現了盾殼霉的規模化生產，其工藝簡便易行。 本發明具有下列特點
1、 本發明篩選的盾殼霉菌株ZS-1SB可以明顯拮抗水稻白葉枯病菌、寄生核盤菌菌核，具有廣泛的潛 在開發價值；
2、 采用上述盾殼霉菌株可以有效的防治油菜菌核病。油菜始花期施用一次(10'°孢子/畝)、始花期施 用一次(10"孢子/畝)，防治效果遠遠高于多菌靈；
3、 采用上述盾殼霉半敞開式固體發酵的培養方法，培養料配方中，燕麥片和米糠材料廉價、易得，固 體培養料疏松，通透性好，可以使產孢量達到1.5X10"孢子/g干培養料；
4、 采用上述盾殼霉半敞開式固體發酵的培養方法，設備簡單，只需蒸籠、火爐和能控溫的培養室即可 滿足生產的需要，無需其他固體發酵方法所需的高壓滅菌設備和固態反應器等專用設備。因此大大降低了 生產成本，適宜于盾殼霉的規模化生產。
5、 采用上述盾殼霉半敞開式固體發酵的培養方法，通過2(TC和16'C變溫發酵的措施，可以很好的控 制常見雜菌如根霉菌(ittizo/ws sp.)、曲霉菌Cispei^iL ws sp.)等的污染。
圖l:顯示本發明篩選的盾殼霉ZS-1SB菌株對水稻白葉枯病菌的拮抗作用。
圖2:是本發明實施例的盾殼霉ZS-1SB菌劑半敞開式固體發酵情況。圖2A是本發明設計的半敞開式 固體培養方式示意；圖2B和圖2C是培養終期形成的含有盾殼霉ZS-1SB菌劑的培養物。 圖3:是盾殼霉ZS-1SB菌株寄生和致腐核盤菌菌核情況。
具體實施例方式
在下面的實施例中，申請人在室內驗證了盾殼霉菌株ZS-1SB對水稻白葉枯病菌的拮抗作用，對該菌 株進行發酵培養、培養物寄生、致腐核盤菌菌核的活性等進行系統驗證試驗，同時將制備的微生物菌劑進 行油菜菌核病的田間防治試驗，以確定其對菌核病的控制作用；
實施例l
1、 盾殼霉ZS-1SB菌株的分離篩選
分離與鑒定從中國湖北省竹山縣蔬菜種植園土壤中分離、篩選得到一株對核盤菌菌核具有極強寄
生作用的盾殼霉菌株，申請人將其命名為盾殼霉(Ow/o^K/7'咖肌V 2'te/ s) ZS-1SB，試驗表明本發明分 離的ZS-1SB菌株對核盤菌(i: sc化ro"咖)的菌絲生長和水稻主要病原細菌a朋t力OTO朋s wyzae pv. oiTzae)具有較強的拮抗作用，可以作為油菜菌核病的防治的微生物菌劑的候選菌株。
本發明的盾殼霉ZS-lSB分離和篩選采用核盤菌菌核誘捕法(Ad細es等，1980)和稀釋平板方法，菌種 鑒定工作參照魏景超，《真菌鑒定手冊》上海科學技術出版社，1979版介紹的方法。
2、 菌株保藏本發明的盾殼霉菌株ZS-1SB菌株的保藏，按周德慶主編，《微生物學實驗技術手冊》， 上海科學技術出版社，1986版介紹的方法操作。
3、 試驗和對照菌株的制備
本實施例以本申請人篩選的盾殼霉ZS-1SB菌株為試驗菌株，將報道的水稻白葉枯病菌086(成國英等，水稻白葉枯病菌單細胞系毒力分化研究.植物病理學報，2002， 32: 227-234)作為對照。供試的盾殼霉 ZS-1SB的活化條件是20。C PDA培養基(配方馬鈴薯200g,葡萄糖20g，瓊脂10g,補充蒸餾水至1000ml， 調pH至7. 0，在121'C高壓蒸汽滅菌30min)平板上活化培養2d。
水稻白葉枯病菌菌株086的活化條件是28'C下將水稻白葉枯病菌086接種至馬鈴薯固體培養基(配 方馬鈴薯300g， Ca(N0a)2 4H20 0. 5g, Na臭 12H20 2. 0g,蛋白胨5. 0g,蔗糖15. 0g, 17%的瓊脂， 加水至1000ml，調pH至6.8-7.0,在121'C高壓蒸汽滅菌30min，下同)劃線培養2d,挑取水稻白葉枯病 菌086單菌落，接種至水稻白葉枯病菌液體培養基(配方馬鈴薯300g，Ca(N03)2 4H20 0. 5g，Na2HP04 12H20 2.0g,蛋白胨5.0g，蔗糖15.0g，加水至1000ml,調pH至6.8-7.0,在121'C高壓蒸汽滅菌30min)中， 于28。C, 200r/min振蕩培養36h，使測定OD6oo值至2. 0。 4、實驗方法
取上述水稻白葉枯病菌086菌液1. 3ml (使0D6。。=2. 0)和水稻白葉枯病菌固體培養基60ml (成分同前) 混勻，迅速倒入直徑150 mm的培養皿中，取盾殼霉ZS-1SB菌絲塊(直徑5mm)置于培養皿中央，于28°C 下培養3d后觀察盾殼霉ZS-1SB對水稻白葉枯病菌的拮抗活性。
實驗結果表明，表明本發明的盾殼霉ZS-1SB對水稻白葉枯病菌086 (見圖l)具有明顯的拮抗作用。
實施例2:盾殼霉ZS-1SB菌劑的半敞開式固體發酵培養
1、 盾殼霉ZS-1SB孢子懸浮液制備將盾殼霉ZS-1SB菌株置于PDA培養基(配方參同)斜面上，于 2(TC條件下培養7 d。用無菌水沖洗斜面，調至分生孢子懸浮液為1(f孢子/ml。
2、 盾殼霉ZS-1SB的擴繁培養將步驟l的盾殼霉ZS-1SB的分生孢子懸浮液以質量比為1: 100接種 于PDB培養基(配方馬鈴薯200g，葡萄糖20g,補充蒸餾水至1000ml，調pH至7.0)，將所述的PDB培 養基分裝入三角瓶(每瓶裝100ml/250ml)中，在150 r/min， 20。C條件下振蕩培養24 h，得到盾殼霉ZS-1 SB菌液，備用。
3、 盾殼霉ZS-1SB菌劑半敞開式固體發酵培養將干培養料(含水量一般不超過8%)燕麥片(商購) 和米糠(商購)以體積比為3: l混勻加入適量水浸漲后，裝入內徑為49mm、高度為20. 5 irnn的家用蒸籠， 加蓋后，旺火常壓蒸汽滅菌2 h。冷卻后，加入滅菌蒸餾水調節所述的干培養料最終含水量至70%。在培 養室內，將步驟2所述的盾殼霉ZS-1SB菌液以每公斤干培養料添加100 ml的比例接種于培養料，平鋪 于蒸籠，使培養料的厚度為5 mm，加蓋，置于2CTC培養室培養48 h，然后半敞開蒸籠蓋(見圖2A)，于 16'C條件下繼續培養7 d。經檢測本實施例的盾殼霉ZS-1SB菌劑含孢子數可達1. 5X 1(T孢子/g干培養 料(見圖2B和圖2)。
實施例3:盾殼霉ZS-1SB菌株寄生、致腐核盤菌菌核的活性試驗
1、 核盤菌菌核及制備將報道的核盤菌菌株(5Wero"V^a sc/aro"咖)Ep-1PNA367 (Huiquan Liu， Yanping Fu， Daohong Ji肌g， Guoqing Li， Jun Xie, Youliang Peng, Xianhong Yi, and Said A- Ghabrial. A Novel Mycovirus That Is Related to the Human Pathogen Hepatitis E Virus and Rubi-Like Viruses. JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2009, 1981 - 1991)作為對照，將核盤菌菌株Ep_lPNA367接種于胡蘿卜培 養基(將胡蘿卜切成條狀，12rC滅菌30min)的三角瓶中，20。C培養60 d獲得成熟的菌核。
2、 盾殼霉ZS-1SB的制備取實施例2中ZS-1SB的發酵培養終期含菌劑的培養物適量，加自來水后反 復搓洗，洗出盾殼霉的分生孢子液，在3000r/min離心5min,棄上清，以自來水重懸分生孢子沉淀，并 調整至盾殼霉ZS-1SB的分生孢子濃度為107ml。
3、 試驗方法取過篩河沙，自來水清洗后，裝入三角瓶中于121'C下高壓蒸汽下滅菌2h,倒入滅菌的
5培養皿中，加適量無菌水至沙潮濕，然后分別取大小均勻一致的純培養核盤菌菌核，用70%乙醇消毒后， 無菌水沖洗3次，在盾殼霉ZS-1SB的分生孢子液(107ml)中浸泡30 min,然后將該菌核取出半浸入裝 有滅菌細沙的培養皿中，每皿沙盤中放菌核20粒，設5個重復，在20"C下培養。記錄盾殼霉ZS-1SB對該 核盤菌菌核的寄生致腐程度。核盤菌菌核腐爛程度分級如下0級，菌核表面無盾殼霉菌絲；1級，菌核 表面有盾殼霉菌絲，但無白色的分生孢子器原基；2級，菌核表面有分生孢子器原基，但表層不腐爛；3 級，菌核表層腐爛、內部變色變軟；4級，整個菌核糜爛。
4、試驗結果經檢測100粒核盤菌菌核均發生腐爛，腐爛程度評定為4級，在腐爛的核盤菌菌核上可 明顯見到盾殼霉ZS-1SB的黑色分生孢子器(見圖3)。
實施例4:利用盾殼霉ZS-1SB菌劑防治油菜菌核病的田間試驗
為了驗證本發明生產的盾殼霉ZS-1SB菌劑的防病效果，申請人選擇湖北省宜昌市、江西省都昌縣和 江西省彭澤縣的部分油菜大田進行了油菜菌核病的田間防治試驗。
1、 試驗藥劑
盾殼霉ZS-1SB菌劑取實施例2中發酵終期的含盾殼霉ZS-1SB菌劑的培養物適量，加自來水后反復 搓洗，洗出的分生孢子液，在3000r/min離心5min，棄上清。為了生產上使用方便，將盾殼霉ZS-1SB菌 劑制成孢子沉淀物(107g),每10g為一個包裝袋，真空封口保存。
對照藥劑為40%多菌靈懸浮劑(購自天津市漢邦植物保護有限責任公司的商品)。
2、 試驗設計試驗共設3個大區處理，處理不設重復；示范面積共51畝(每畝為666平方米，下同)。 試驗設計如下
處理1: 40%多菌靈懸浮劑于油菜初花期施藥1次，每畝用40%多菌靈懸浮劑200g兌清水30kg噴霧， 處理面積1畝。
處理2:盾殼霉ZS-1SB菌劑于油菜始花期施藥1次，每畝用盾殼霉ZS-1SB菌劑1袋(109孢子/8, 共10g)兌清水30kg噴霧，試驗面積為20畝。
處理3:盾殼霉ZS-1SB菌劑于油菜始花期施藥1次,油菜初花期再施藥1次，每次每畝用盾殼霉ZS-1SB 制劑l袋(10 g)，兌清水30kg噴霧，試驗面積為20畝。
對照只噴清水，每畝施用清水30kg，噴霧，試驗面積為10畝。
3、 試驗地點的條件
(1) 試驗地點選湖北省宜昌市夷陵區鴉鵲嶺鎮白合村，前巷作物為中稻，土質為沙壤土，肥力中等；
(2) 江西省彭澤縣芙蓉墩鎮五聯村，棉油輪作區，田間油菜菌核病常年發生較重，肥力較高，油菜系 冬前育苗移栽，灌溉條件較好；
(3) 江西省都昌縣汪墩鄉，棉油輪作區，田間油菜菌核病常年發生較重，肥力較高，油菜系冬前育苗 移栽，灌溉條件較好。
4、 試驗的油菜品種供試油菜品種為當地主要推廣的優質高產(雙低型)甘藍型雜交油菜新品種"華 油雜6號"(該品種由華中農業大學育成，已通過湖北省農作物品種審定委員會審定， 一個公開推廣的油 菜新品種)，按照常規方法育苗和移栽。
5、 調査取樣方法菌核病病情調査在油菜收獲1周前進行，每塊田采用棋盤式5點取樣方法，每點調 査20株油菜，記載每處理的主莖發病病情指數和相對防效。
病情指數=E [病級數X該級病株數]/ (調査總數X最高病級數)X100
相對防效(％)=(對照菌核病病情指數-處理防菌核病病情指數)/對照菌核病病情指數
6、 結果分析表1本發明盾殼霉ZS-1SB菌劑對油菜菌核病的防治效果
相對防效a)
處 理
_宜昌市彭澤縣都昌縣
盾殼霉ZS-1SB菌劑施藥1次31.4 67.0 79.6 盾殼霉ZS-1SB菌劑施藥2次58.3 83.0 85.0 40%多菌靈懸浮劑施藥1次 29.0 60.2 74.0 說明兩省防治效果出現的差異是各地田間油菜菌核病的自然發生程度的差異 本發明的盾殼霉ZS-1SB菌劑在湖北省和江西省3地各50畝防治試驗結果表明，盾殼霉ZS-1SB菌劑 可以有效控制田間油菜菌核病的危害。在油菜始花期施藥一次(1(T孢子/畝))，防治效果與化學農藥"40% 多菌靈懸浮劑"相當，在油菜始花期施藥一次(101(1孢子/畝)、始花期再施藥一次(10""孢子/畝)，其防治 效果顯著高于40%多菌靈懸浮劑。 上述油菜始花期是指約5_10%的油菜主莖開花；油菜初花期是指油菜始花期后6天。 田間試驗結果表明本發明制備盾殼霉ZS-1SB菌劑是一株具有良好的生防價值的真菌菌株(菌劑)，該菌 劑對油菜菌核病或其他作物的菌核病具有較好的防治作用，顯示其具有良好的開發應用前景。
主要參考文獻
1. Campbell W A. A new species of tb"yo^r/咖yffi/ it3/751 parasitic on sclerotia. Mycologia， 1947， 39: 190- 195
2. Cheng J S， Jiang D H， Yi X H， Fu Y P， Li G Q， Whipps J M. production, survival and efficacy of Cb/7/o^r"' /z /ff// _^/7Sconidia produced in shaken liquid culture. FEMS Microbiology Letters. 2003， 127- 131
3. Li， G.Q. ， Huang, H. C. ， Miao， H. J. ， Erickson， R. S. ， Jiang, D. H. ， Xiao, Y. N. ， 2006. Biological control of sclerotinia diseases of r即eseed by aerial applications of the mycoparasite Cb/ yo^r/咖/z i/ ^朋s. Eur. J. Plant Pathol. 114， 345 - 355.
4. Jones, E. E. ， Stewart, A. ， Whipps， J.M， 2003. Use of C》t力yW鵬transformed with the hygromycin B resistance gene to study survival and infection of 6WerW"/a sc7ero"or咖 sclerotia in soil. Mycol. Res. 107， 267 -276.
5. Whipps J M， Gerlagh M. Biology of C"A_Kr/ 恵'/^朋s and its potential use in disease biocontrol. Mycol Res， 1992， 11: 897- 907
6 Ad雄s P B. Ayers W A. 5^ar他，'咖sc7ero"Vor咖its distribution and function in natural biological control of sclerotial fungi. Phytopathology. 1980. 71: 90-9權利要求
1、一株油菜菌核病的生防菌盾殼霉(Coniothyrium minitans)ZS-1SB，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM209114。
2、 一株由保藏號為CCTCC NO: M209114的盾殼霉(Com'o/m'"/toraJ ZS-1SB 制備的微生物菌劑。
3、 一種盾殼霉菌劑的制備方法，其特征是，包括采用半敞開式固體發酵培養所述的盾殼 霉菌劑，它還包括如下步驟(1) 盾殼霉ZS-ISB孢子懸浮液的制備將保藏號為CCTCCNO: M209114的盾殼霉ZS-1 SB菌株置于PDA培養基斜面上，于20。C條件下培養7 d;用無菌水沖洗斜面，調整分生孢子 懸浮液至1()6孢子/ml;(2) 盾殼霉ZS-1SB的擴繁培養將步驟(1)的盾殼霉ZS-1SB的分生孢子懸浮液以質量 比為l: 100接種于PDB培養基的三角瓶中，于150r/min， 2(TC條件下振蕩培養24 h，得到 盾殼霉ZS-1SB菌液，備用。(3) 盾殼霉半敞開式固體發酵培養將干培養料燕麥片和米糠按體積比為3: 1混勻，加 入適量水浸漲后，裝入蒸籠加蓋后于旺火常壓蒸汽滅菌2 h，冷卻后，加入滅菌蒸餾水調節 所述培養料的最終含水量為70%，在培養室內，將步驟(2)所述的盾殼霉ZS-1SB菌液以每 公斤干培養料添加100ral的比例接種于該培養料中，平鋪于蒸籠，使所述培養料的厚度為5 mm，加蓋，置于20。C培養室培養48 h，然后將蒸籠蓋半敞開，于16。C條件下繼續培養7 d， 得到所述的盾殼霉菌劑；其中步驟(1)所述的PDA培養基組分及配比為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂10g，補充蒸 餾水至1000ml，調pH至7.0，在12rC高壓蒸汽滅菌30min;步驟(2)所述的PDB培養基組分及配比為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，補充蒸餾水至1000ml， 調pH至7.0，在12rC高壓蒸汽滅菌30min。
4、 權利要求1所述的盾殼霉(Com'oA;^'"m脂'"/to"^ ZS-1SB在制備防治油菜菌核病微 生物制劑中的應用。
全文摘要
本發明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及一株對核盤菌菌核具有強寄生、致腐活性的盾殼霉菌株的分篩選、鑒定及在微生物菌劑中的應用。所述的盾殼霉(Coniothyrium minitans)ZS-1SB菌株，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM209114。本發明還公開了所述微生物菌劑的半敞開式固體發酵培養方法及盾殼霉(Coniothyriumminitans)ZS-1SB菌劑在防治油菜菌核病中的應用。本發明的微生物菌劑對油菜菌核病等植物真菌病害具有良好的生防效果。
文檔編號C12R1/645GK101603009SQ20091006240
公開日2009年12月16日 申請日期2009年6月5日 優先權日2009年6月5日
發明者付艷蘋, 姜道宏, 李國慶, 程家森, 謝甲濤 申請人:華中農業大學