專利名稱：：控制水稻纖維素合成的基因bc1l4作為水稻遺傳改良的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于植物植物基因工程領域。具體涉及一個控制水稻纖維素合成和產量的基因5C7丄4的克隆、功能驗證和應用。本發明利用T-DNA標簽技術，利用正向遺傳學的方法，從水稻T-DNA插入突變體庫中得到了一個控制水稻纖維素合成和結實率的基因5C"4，并通過轉基因互補實驗驗證了5C7Z4基因的功能。本發明還涉及利用該基因或其功能類似物改變細胞壁組分如纖維素、木質素、半纖維素及成分，從而促進秸桿資源的有效利用。
背景技術：
：水稻是世界上最重要的糧食作物之一，它養育了全球近半數的人口，如何提高水稻的產量是關系到國計民生的重要問題。除生產稻谷外，水稻的秸桿還可以作為一種可再生的生物能源加以利用。隨著石油資源的日趨衰竭，世界能源危機正威脅著人類社會的進步。發展可再生能源，尤其是利用生物質能，引起了全球的廣泛關注。纖維素是水稻秸桿的主要成分之一，它是世界上最豐富的天然有機物，蘊藏著植物界碳含量的50%以上，植物光合作用的大部分能量以纖維素的形式儲存下來。人類一旦掌握了釋放出存儲在纖維素中能量的技術，能源危機便可迎刃而解。利用纖維素資源生產生物乙醇被認為是解決能源危機的最為理想的辦法。纖維素通過酶法或者化學轉化,可降解成葡萄糖、木糖等物質，進一步通過工業發酵，形成生物乙醇替代石油，這是人類利用植物源能源的最初設想。但是由于纖維素結構復雜，纖維素大分子的降解一直是生產環節中的難點，目前圍繞著提高纖維素的轉化率開展了多方面研究，如重整天然纖維素的結構，降低結晶度，脫木質素等等，一旦解決了纖維素轉化的難題，人類在利用植物源能源方面將取得突破性進展(張衛明等，生物質能的利用和能源植物的開發。2007，南京師大學報，30:68-74)。天然纖維素以微纖絲的形式存在。纖維素微纖絲由一種不分支的e-i,4-D-葡萄糖鏈組成，每條鏈含有幾千到上萬個葡萄糖分子。每條纖維素微纖絲約3納米厚，由36條平行的葡萄糖鏈包裝而成。葡萄糖鏈之間通過氫鍵結合，形成致密的結晶結構(Taylor等，Cellulosebiosynthesisanddepositioninhigherplants.2008,Newphytologist,178:239-252)。由于纖維素微纖絲結構致密，使得纖維素難以降解。近年來，人們通過對不同細胞壁合成突變體的研究，發現一些纖維素合成突變體具有非結晶態的纖維素組成，這種非結晶態的纖維素很容易被降解。所以通過對纖維素合成相關基因進行適當的基因工程改造，可以人為地改造天然纖維素的結構，降低纖維素結晶度，從而效利用纖維素生物能源。利用突變體資源，人們已經克隆了幾個纖維素合成相關的基因。例如，CEXW基因是最早克隆的纖維素合成酶基因，它的突變能引起細胞壁纖維素含量的減少，并引起大量非結晶態纖維素的積累(Arioli等，MolecularanalysisofcellulosebiosynthesisinArabidopsis.1998,Science,279:717-720);KOiWUG乂雄因編碼一種e-l，4葡萄糖酶，它突變后導致植物纖維素含量的減少及結晶度的降低(Nicol等，Aplasmamembrane-boundputativeendo-l，4-beta-D-glucanaseisrequiredfornormalwallassemblyandcellelongationinArabidopsis.1998，EMBOJ，17:5563-5576);《(95/70/基因突變后能導致纖維素合成受阻及纖維素沉積方向的雜舌L(Pagant等'K05/7DJencodesanovelplasmamembraneproteinnecessaryfornormalsynthesisofcelluloseduringcellexpansioninArabidopsis.2002，PlantCell,14:2001-2013);擬南芥中的CO別"基因突變能引起植株纖維素含量的下降及其排列方向的雜亂(Schindelman等，COBRAencodesaputativeGPI-anchoredprotein,whichispolarlylocalizedandnecessaryfororientedcellexpansioninArabidopsis.2001,GenesDev，15:1115-1127)。這些基因突變體的一個共同特征就是纖維素含量和結晶度的下降，利用這一特點人們可以通過基因工程手段改變天然纖維素的結構，使其易于降解，生產生物能源。COiWi4編碼一種糖磷脂酰肌醇錨定蛋白，屬于一個植物特有的蛋白質超家族。CO說"家族在擬南芥中有12個成員，在水稻中有ll個成員，在玉米中有9個成員(Roudier等，TheCOBRAfamilyofputativeGPI-anchoredproteinsinArabidopsis.Anewfellowshipinexpansion.2002，PlantPhysiol,130:538-548;Li等，S^/TTZECf/iM7，whichencodesaCOBRA-ikeprotein,affectsthemechanicalpropertiesofriceplants.2003，PlantCell,15:2020-2031;Brady等，CombiningExpressionandComparativeEvolutionaryAnalysis.TheCO￡;t4GeneFamily.2007，PlantPhysiol,143:172-187)。除CO^L4外，該家族的多個成員參與植物細胞壁及纖維素生物合成，如AC(9Si^、Oy5C7和Zm5^2,這些基因突變后分別引起擬南芥、水稻和玉米植株莖桿機械力的降低禾卩纖維素含量的減少(Persson等,Identificationofgenesrequiredforcellulosesynthesisbyregressionanalysisofpublicmicroarraydatasets.2005，ProcNatlAcadSciUSA,102:8633-8638;Li等，丑/f/T7XfiCC/丄A//,whichencodesaCOBRA-likeprotein,affectsthemechanicalpropertiesofriceplants.2003，PlantCell,15:2020-2031;Ching等，Brittlestalk2encodesaputativeglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycell.2006，Plants224:1174-84)。本發明通過T-DNA標簽技術首次從水稻突變體庫中分離克隆5C7丄4基因，該基因編碼一個COBRA-like蛋白，突變體表型分析及互補分析表明5C/i^基因在控制水稻產量和纖維素合成過程中起重要作用。對該基因的研究有助于人們了解水稻生長發育的分子機制，利用現代基因工程方法，改造纖維素含量和結構，提高谷物的產量，培育優質高產的能源型新品種，對于減緩能源危機和食品危機具有雙重意義。
發明內容本發明的目的是提供一個利用突變體克隆的調控水稻纖維素合成和產量的基因萬C7i^的應用，通過遺傳轉化方法將所述的基因轉化到水稻植物體內，以調控植物的纖維素結構或/和水稻產量。本發明通過以下技術方案實現申請人克隆得到一個控制水稻纖維素合成基因BC1L4,該基因BC1L4是下列核苷酸序列之一O序列表SEQNO:1中所示的DNA序列；或2)編碼與1〉編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列。本發明克隆的水稻5C"4基因的T-DNA插入失活突變體表現為分蘗少、矮化、纖維素含量降低和結實率下降，正常功能的5C7i4基因轉化該突變體后植株恢復植株纖維素含量，植株結實率正常(見實施例1-3)。此外，50￡#基因與幾個纖雄素合成相關基因共表達，它們之間存在一種負反饋的調節模式，為基因工程操作纖維素合成提供了研究機理(見實施例4)。本發明還提供了一種利用SC化4基因進行高效植物遺傳轉化的方法。具體地說，本發明提供了一種含有SEQIDNO:1所示序列的基因或該基因的部分類似功能片段的載體，如圖3A所示的互補載體pCg001(見實施例3所示)。本發明還有一種含有以上表達載體的宿主細胞。宿主細胞包括大腸桿菌、農桿菌和植物細胞。本發明克隆的5C/W基因可用于與其它調控元件，如組成型啟動子(如CaMV35S啟動子)或器官特異性啟動子融合構建基因表達載體'通過轉基因技術、反義RNA或RNAi等技術人為調控水稻結實率及調節纖維素合成和降解，從而達到有效增強水稻產量和提高秸桿的利用率的目的。實現本發明的具體技術步驟如下1.利用已有的水稻T-DNA插入突變體庫(突變體庫的創建方法已經公開發表論文，見Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome,PlantJ(2003):418-427;Zhang等,Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary,PlantJ(2007):947-959)篩選得到一個分蘗少、矮化、結實率低的突變體6c/，突變體的篩選鑒定方法見實施例1第1部分中詳細描述。2.通過測定纖維素含量測定和纖維素染色，發現在6c7W突變體中纖維素含量明顯下降，表明該基因能夠調控水稻纖維素的合成(見實施例2)。3.采用Tail-PCR方法(Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T陽DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary,PlantJ(2007):947-959)分離突變體的側翼序列，通過序列分析顯示T-DNA插入SC7丄4基因(LOC—Os05g32110,www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/index.shtml)的編碼序列中(實施例1第2部分)。4.通過T-DNA插入與突變性狀的共分離驗證(按實施例1的第3部分T-DNA插入與突變表型的共分離檢測執行)及功能互補實驗(見實施例3)證明本發明獲得的候選基因5C7^/的失活是引起k^/4突變表型的原因。5.利用本室的CREP數據庫(http:〃crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pD搜索￡C"4基因的表達模式，發現SC"4基因與幾個纖維素合成相關基因共表達；利用定量RT-PCR技術分析6c/突變體和野生型植株中幾個纖維素合成相關基因的表達，發現^C7i^基因的突變能引起一系列纖維素合成基因表達量的上升(見實施例4)。更詳細的技術發明細節將由下述實施例給出。本發明的優點1.本發明利標簽發克隆基因快速、高效。2.本發明提供了一個調控水稻纖維素合成、影響水稻產量的基因￡C^>/及其編碼蛋白。該基因對于水稻纖維素合成分子機理的研究具有重要的理論價值。3.將含有SEQIDNO:1所示序列的基因或該基因的部分類似功能的DNA片段進行改造，導入植物體，可以人工提高水稻的產量及改變細胞壁纖維素的含量和結構，從而為有效利用纖維素資源提供了一條經濟、快速、有效的途徑，具有重要的實際應用價值。下面結合附圖對理解本發明作進一步的詳細描述，但并非對本發明作限定。圖l.水稻&"/4突變體的表型。(A)野生型植株(WT)與6"W突變體成熟期的表型，6"W突變體與野生型相比分蘗較少、矮化。(B)野生型植株(WT)與^/W突變體穗部的表型差異，6"W突變體穗變小、結實率降低。圖2.野生型植株(WT)和6c/W突變體的纖維素含量。(A)6c/W突變體纖維素含量較對照明顯降低，減少約24%。標準誤取自5次生物學重復。(B-E)對野生型(B、D)與6c/W突變體(C、E)的第二節間進行Calcofluor(fluorescentbrightener28;Sigma)纖維素染色，可見6c/"突變體顏色較淺，即纖維素含量較少。圖3.5C1W基因與突變表型的共分離驗證。(A)SC/L4基因的結構和T-DNA插入位點分析。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)已經標出，方框表示5C/Z^基因的外顯子，方框之間的線條表示內含子，T-DNA插入在第四個外顯內。LB和RB分別代表T-DNA的左邊界和右邊界。PI，P2表示跨T-DNA的兩條基因組引物，P3表示位于T-DNA上的邊界引物。(B)T1代共分離實驗膠圖。植株基因型的確定純合T-DNA插入植株當P2和P3配對時可以擴增出目標產物，由于T-DNA插入片段太大，PI與P2配對無擴增產物；野生型植株由于無T-DNA插入，故P2和P3配對無擴增產物，但PI與P2配對擴增能得到目標產物；而SC/Z>/雜合T-DNA插入轉基因植株用PI和P2配對以及P2和P3配對時都可以得到目的產物。W代表野生基因型的植株，H代表雜合基因型的植株。M代表純合基因型的植株。植株表型20個Tl代單株中第4、5、6、14株為突變表型。由圖可知突變植株的基因型均為SC/W純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生或雜合型，這一結果表明突變表型與5CLL4基因內的T-DNA插入共分離。圖4.功能互補實驗。(A)互補載體pCg001結構示意圖，該載體的構建說明見實施例3中的第1部分，即將基因5C7W的啟動子和全長基因通過Hindffl酶切后克隆到載體pCAMBIA2300(購自CA朋IA公司，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新質粒。pC2301空載體作為陰性對照。(B)功能互補實驗中轉空載體的植株仍為突變表型，而轉5CIW基因的植株恢復野生型表型，即丑C化4基因能互補突變體的突變表型。左邊是野生型，中間是空載體轉化株，右邊為恢復正常表型的互補載體轉化株。圖5.幾個纖維素合成相關基因在野生型和fcJ"突變體中的表達差異?？梢娝袡z測的纖維素合成相關基因的表達水平在6c似突變體中都呈現上升的趨勢，這反映了纖維素合成過程中的一種反饋調節機制。具體實施例方式實施例1:丑C7厶4基因的分離克隆1.6c7W突變體的獲得所用的水稻T-DNA插入突變體庫由本申請人所在作物遺傳改良國家重點實驗室利用載體pFX-E24.2-15R構建而成的(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.2003,35:418-427;Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.2007，_P/awf,49:947-959)。該突變體庫已向全世界公開(http:y7rmd.ncpgr.cn/),可以通過常規手續索取。2005年，從TO代突變體庫(見http:Wrmd.ncpgr.cn/,Zhang等，RMD:aricemutantdatabaseforfunctionalanalysisofthericegenome,NucIAcidsRes(2006):D745-D748)挑選出2000份水稻轉基因品種"中花ll號(為中國農業科學院培育的常用水稻品種)"的種子，經浸種、催芽等常用步驟后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料種兩行，每行10株，為一個家系。種植密度為5寸X8寸，種植地點為湖北省武漢市洪山區獅子山地區華中農業大學的試驗田，按常規的水稻種植方法進行田間管理。經過大田篩選共獲到60個分蘗性狀突變的家系，主要包括分蘗多、分蘗少及分蘗角度等類型的突變體。其中，有一個家系的突變體表型為分蘗少、矮化、穗小、結實率降低(如圖l)，申請人把這個突變體命名為6c7W。2.分離6c7W突變體T-DNA插入位點的側翼序列利用Tail-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)技術(Liu等，ThermalsymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomalwalking.1995，Genomics,25:674-681;Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.2007,PlantJ,49:947-959)分離了這個家系的側翼序列。根據側翼序列與水稻基因組的匹配情況確定插入位點，結果發現該側翼序列位于水稻的第5染色體上，插入位點對應于水稻基因組注釋網站(http:〃rice.plantbiology.msu.edu/)上的一個基因(登錄號LOC_Os05g32110)，該基因為COBRA蛋白家族的一個成員，命名為5C7H5C/W基因包括6個外顯子和5個內含子，T-DNA插入第4個外顯子中(見圖3A)。利用Tail-PCR方法(文獻參見本實施例)分離得到的6c/W突變體T-DNA插入位點的側翼序列如下cgggggggatttcgtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatccttcctgctgtgtatctctctcatcattttataatgacacaattgtgaactgcccaacatgctcttgtggctgcc犯犯caatgggac卿tcctggaagctgtgt3aagtg3gtt3ataaaaccaaaactcttacttcgcttcttgttgaggcccaacttttctgc犯冊ttgctaacaagttccatgcatttccacagtgagaattcaccttatttacaatctgccattgatggccctggcaaatggaccggtcagcctcttgtccaatgtacttctcacatgtgcccgatcagaatccactggcatgtgaaactcaactataaggaatattggagagtgaagatcacgattacgaacttcaact3ccgcatgaatt3cacacagtggaatttggtcgctcaacatcctaacttc犯taatatcacccagctgtttagcttcaactax;aagcc3ctt3ctccatatggaagcaagataagtaagtcaatttacaaactgttctcctttatttaagaaaattggagtgcacttgtaatacgttccttcatctcactcgtcctactctctatcggtgatcgaagtttattctttgaggtatatatgatactgcgatgattctgggg卿taagttctataacgatgtgctcatgagagctgggtccacttgg3tatgcacacgtcag犯ctttcttctgcggaaggattctg3ggatcttcctctttggagaggggatgggcccttccccagcaccgcgtgtacttc幼tggatg3t犯ttggtgtcatgccgcccttcgggatgcatctccattggttggcttatggcaggttctctctggacaaaagcaaccattggaccctcggggggtgtggctatttcc犯attcgggtgggcctacUtgcggggcttaggcgatggagtggaggggatcccg卿aattttcgggggactttcaatgttgcaggcccatgtgggggacactgccaacaaatacttggtctactcgtcgttc卿g3.5C7i^基因的突變導致植株矮小、結實率低的表形為了證實分蘗少、矮化、結實少的突變表型是由于BCZ4基因內的T-DNA插入引起，本發明對20個T1代轉基因植株(其中，第4、5、6、14株為突變表型)進行了T-DNA插入位點側翼序列與突變表型的共分離檢測。共分離檢測的具體步驟為(1)在5C7丄4基因T-DNA插入位點兩側設計一對基因組引物P1(5，墨CTGGGACTACCAACAAGACA-3，)和P2(5，誦AGTTAGGATGTTGAGCGACC-3，)，在T陽DNA上設計一條載體引物P3(5，-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3'),如圖3A。在T1代植株中，5C"純合T-DNA插入植株只有當P2和P3配對時才可以擴增出目標產物，由于T-DNA插入片段太大，P1與P2配對擴增的產物無法得到；野生型植株由于沒有T-DNA的插入，所以P2和P3配對擴增沒有產物，但可以利用引物P1與P2配對擴增得到目標產物；而5CLW雜合T-DNA插入轉基因植株則P1和P2配對以及P2和P3配對時都可以擴增得到產物。(2)應用CTAB法(參fi^Liu等，Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandthepreciselocationoftheS5locusinthemolecularmap.1997，TAG，95:809-814)從20株T!代單株中分別抽提總DNA作為模板，用(1)中引物進行PCR擴增。反應體系為20pL，具體包含DNA模板1^iL;10倍體積的Taq7酶反應緩沖液2nl;2mMdNTP1.5nL;25mM鎂離子1.2pL;10pM引物0.2pL;0.3單位Taq酶，加雙蒸水至20inL。反應參數設置如下94°C5min;94。C45sec，53。C45sec，72°C1.5min，28cycles;72'C5min，25'Clmin。(3)將反應產物跑瓊脂糖凝膠電泳，根據凝膠上的帶型判定各個單株的基因型。實驗結果顯示，20株T!代單株中，4株突變體表型植株的基因型均為5C7W純合T-DNA插入，而其他13株表型正常的植株基因型為野生或雜合型(如圖3B)。這表明6c7W突變體的突變表型是由于5C7丄4基因內的T-DNA插入造成，且該突變體為隱性突變體。實施例2:fiCIL4基因控制水稻纖維素的合成由于COBRA家族的多個成員參與植物纖維素的合成，且一些纖維素合成酶的突變體也具有同6c/"相似的表型(Tanaka等，Threedistinctricecellulosesynthasecatalyticsubunitgenesrequiredforcellulosesynthesisinthesecondarywall.2003,PlantPhysiol,133:73-83)。為了確定5C7丄4基因是否參與水稻纖維素的合成，本發明測定了6c7W突變體與野生型植株莖桿的纖維素含量。結果如圖2A所示，6c/W突變體的莖桿纖維素含量較野生型明顯降低，減少程度約為24%。另外，為了確定6d/4突變體纖維素的減少是否位于特定的細胞，申請人對突變體與對照的第二節間橫切片進行了calcofluor染色。Calcofluor(fluorescentbrightener28;Sigma)染色能使纖維素在紫外光照射下發出綠色熒光，而熒光的強弱直接反映了纖維素含量的多少。結果如圖2B-E所示突變體(圖2C、E)與野生型(圖2B、D)有明顯的顏色差異，突變體的顏色相對于野生型染色要較淺，這一結果進一步說明6c7W突變體的纖維素含量都減少了。所以可以得出5C"4基因參與水稻莖桿纖維素的合成，而纖維素合成的障礙可能就是導致6c/W突變體分蘗少、矮化、結實率下降等突變表型的原因。纖維素含量測定的實驗具體步驟如下:(I)將突變體與對照的莖桿第二節取下，液氮磨成細粉，在50mMPH7.2的磷酸緩沖液中洗3次，70%的乙醇70°C提取1小時，重復兩次,真空烘干。每份材料各取5個生物學重復。(2)樣品中加入500nL乙酸-硝酸試劑，混勻，沸水煮30分鐘。離心，棄上清，加lml水重懸。離心，棄上清，力口lml丙酮。離心，棄上清，干燥，力口800^L67%的硫酸室溫溶解1.5小時，取10nL稀釋至lml。(3)再取40^L加160^L水，冰凍，加400nL蒽酮(0.02克蒽酮溶于10ml濃硫酸，現配現用，用前冰箱中冷卻2小時以上)，沸水浴16分鐘，冰上放2-3分鐘，室溫放置5-10分鐘，測定A620處的吸光度。(4)將0.02克watermanpaper紙溶于800pL67%的硫酸，加水到200ml，分別取20nl、40nl、60^1加水至200nl，其余步驟同(3)，做標準曲線。根據標準曲線，得出突變體與對照樣品中的纖維素含量。纖維素染色步驟如下用0.005%的calcofluor(fluorescentbrightener28;購自Sigma公司)將野生型與突變體的切片(10um厚)染色2分鐘，在熒光顯微鏡(DM4000B，Leica^Germany)下觀察、拍照。實施例3:轉化BC7Z^基因導致突變體纖維素含量升髙，1.5C7丄4基因互補載體的構建互補載體pCgOOl的構建方法如下以pCAMBIA2301載體為骨架載體(購自CAMBIA公司，http:〃www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用HindIII酶切"日本晴"(一個公開報道的水稻品種)BAC克隆OSJNBa007犯05,得到一系列將酶切片段，其中包括目的片段含整個5C/W基因編碼區及ATG前約1.9kb和終止密碼后約1.2kb，如圖4A。將酶切片段與HindIII酶切的去磷酸化的的載體質粒pCAMBIA2301連接(所使用的內切酶、堿性磷酸酶均購自寶生物工程(大連)有限公司，連接酶購自Promega公司，具體用法與用量參考該產品的說明書)。連接產物通過電轉化的方法(電轉化儀為eppendorf公司產品，本發明所用電壓為1800V,具體操作參考該儀器的使用說明書)導入大腸桿菌(購自Promega公司)中，加800ulLB復蘇45分鐘，取250ul涂于含卡那霉素、X-gal及IPTG的LA平板，37。C溫箱培養14-16小時(LA與LB配方參考J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)。挑白色單克隆，擴大培養并抽提質粒，通過PCR篩選陽性克隆、酶切驗證及測序驗證后得到目的克隆。把構建好的載體電轉化到農桿菌￡/"/05(購自CAMBIA公司)菌株中。2.遺傳轉化采用農桿菌介導的遺傳轉化方法(參照Hiei等，Efficienttransformationofrice(Oy加s加VaL.)mediatedby爿gro6ac化"'i/附andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.1994,PlantJ,6:271-282)將互補載體pCg001導入6c/W突變體的愈傷，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有G418(購自北京原平皓生物技術有限公司)抗性的愈傷、分化、生根及煉苗移栽大田得到轉基因植株(農桿菌介導的遺傳轉化試劑及配方見申請人已經公開的專利，
專利名稱：為水稻木質素合成基因FC1及應用，申請號200610018105.5;公開號CN1995346)。按照相同的遺傳轉化方法將空載體pCAMBIA2301導入6c/"突變體的愈傷，得到的轉基因植株作為陰性對照。本實施例研究結果顯示，將互補載體pCg001導入&/突變體的愈傷，共獲得互補轉化苗96株，其中39株陰性,為突變表型，57株為陽性，55株恢復正常生長；獲得空載體轉化子30株，均為突變表型，如圖4B。以上結果表明分蘗少、矮化、結實率低的突變表型確實是由于5CLW基因突變而造成。為了檢測互補后代的遺傳穩定性，本實施例隨機選取14份T0代互補轉基因植株，利用Southern雜交(具體操作參考Wu等,Developmentofenhancertraplinesforftmctionalanalysisofthericegenome.2003,PlantJ，35:418-427)分析了這些互補轉基因植株的拷貝數。結果顯示，其中有5份互補轉基因植株為單拷貝，這5份單拷貝互補轉基因植株有3份獲得了Tl代種子。大田種植單拷貝家系的Tl代，其中恢復正常生長的植株為轉基因陽性植株，而未恢復正常表型的植株均為轉基因陰性植株。這些研究結果進一步表明te/W突變體的突變表型確實是由于5C/i^基因的突變而造成的。實施例4:fiC7i^基因與其它纖維素合成相關基因的關系及其實際應用本發明利用本申請人所在作物遺傳改良國家重點實驗室CREP數據庫(http:Vcrep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl),分析了5CIW基因與水稻基因組中所有其他基因的表達相關性。如表1所示，萬C/W基因與9個基因具有很高的表達相關性(相關系數>0.88)，其中的5個基因(C￡&4/,C￡&4S,C五i人C￡&43,和CSLF6)或其同源物已經被顯示參與纖維素的合成(Burton等，TheCe"genefamilyofbarley.Quantitativeanalysisoftranscriptsrevealstwogroupsofco-expressedgenes.2004，PlantPhysiol,134:224-236;Zhou等，OsGLUl，aputativemembrane-boundendo-l，4-beta-D-glucanasefromrice,affectsplantinternodeelongation.2006,PlantMolBiol,60:137-151;Burton等，TheGeneticsandTranscriptionalProfilesoftheCelluloseSynthase-Likei/vCs/FGeneFamilyinBarley.2008，PlantPhysiol,146:182卜1833)。5CL^基因與這些纖維素相關基因的共表達進一步說明5C7i^基因是水稻纖維素的合成中必需的基因。表1gC/W基因和水稻中其它基因的表達相關性分析(相關系數>0.88的基因被顯示)基因登陸號(水稻基因組注釋網站，相關系數基因注釋http:〃rice.plantbiology.nisu.edu/index.shtml)LOC_Os05g08370LOC_Os07gl0770LOC_Os05g04380LOC_Os03g526300.916443890.9150778420.W3083011CESA1CESA8peroxidase1precursor0.902740106endo-1，4-beta-glucanaseCel1LOC一Os02g335500.902465467VAMPproteinSEC22LOCJ3s07g241卯0.895753078CESA3LOC一Os04g475200.889758525auxin-independentgrowthpromoterLOC—Os08g063800.889380865CSLF6LOC—Os06g036400.887354336proteinbindingprotein為了調查其他纖維素合成基因的表達在&c7W突變體中是否被影響了，申請人利用常用的定量RT-PCR方法檢測了8個基因的表達水平，其中包括5個與5C/W共表達的基因(0&4/,C￡X4&C五",C￡&43,CS丄M)和三個在水稻中已經克隆的纖維素合成酶基因(C五&HC￡&47,C五&49)。如圖5所示，C五&4i和CE&49的表達在te/W突變體中表達水平比野生型顯著升高了。盡管其他CESA基因、CiX7和C^:尸6的表達水平在統計學上沒有顯著的^變化，但它們的平均表達水平在6c/W突變體中也比野生型都有所提高。在&c7/4突變體中纖維素合成相關基因表達水平的上升反應了纖維素合成過程中可能存在一種負反饋機制，即通過提高其它纖維素合成相關基因的表達來彌補k:7W突變體中的纖維素損失。定量RT-PCR實驗具體步驟參照Huang等的實驗方法進行(Huang等，Down-regulationofa5TZfiVT/yVfi9湖77QVyKl^L47i9A^relatedhistonedeacetylasegene,fls5y77,inducesDNAfragmentationandcelldeathinrice,PlantPhysiol(2007):1508-1519)。具體步驟如下(1)RNA材料準備:取野生型與te7W突變體植株抽穗期第二節間的樣品，每種樣品各取3個生物學重復。(2)RNA樣品的抽提及反轉錄見參考文獻(Huang等'Down-RegulationofaS/Z:￡iVr7^FOiM477CWi￡G(/i^rcy2-RelatedHistoneDeacetylaseGene,OsvS77V,InducesDNAFragmentationandCellDeathinRice,PlantPhysiol(2007):1508-1519)。(3)定量RT-PCR在ABI7500定量PCRsystem(AppliedBiosystems，美國)上進行，采用2—A"相對定量的方法進行表達量的比較。25nL反應體系包含1反轉錄產物，12.5pL尸re肌'x￡T(Takara)，0.5wlRoxReferenceDyeII(Takara)及0.2^M引物。反應參數設置如下95°C/10sec;95'C/5sec,60°C/40see,40cycles。所有定量RT-PCR引物參見表2。表2本發明中使用的定量RT-PCR引物基因名稱正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')"""C￡&4_/TTGACTTGCACGATCGATACGTCCCACATAAACTGGACCCTGC￡&43GCATTTTTGCTACTGGCATCCTCCCTGGAACAAAGCAAAGAGC五認GTTCGATGGCATTGATCGCACCACATAAACCGGACCTTGGAC五&47CCGGATGGATGATTCTTGTTGCCCCCAAAACACTTTTATCCCTGTTGAAGGTGCTGGATTCGATGAGAGTGGAGGCAACAAACGC雄9AGGCCATCCATGTCATCAGCTTTGAACCCCGTTAGGATGTCCTCACAGAGGTGCATCAATCCCCGGACATCTTTGAAGCCATCAC鮮6GCTCATGATCACCCCCATCATAGAAGTTGAAGAACACGCCGCG5孤/ACCGGCAAAGCCACTATTTGCCATCTGGCCCATCATCTCTA5CACCCCAACCTCAACAACGTCAAACATGCCGGTGTCGTTGAT5C7丄7GTGCAATGCCTCAGAGGATTCAAGCAATACGAAGGCCGAAG5C/ZJAAGTTGTCAGGTTCCACGGTGGCTTTCCTCAGCGTGACAACA5C7丄6CAATGACTTGCTCATGACGGCAAGGCCCAGCCTTTCTCAAAGBC"7CATCACCGAGGTCTTCAGCTTAGCCCATAGAACATCGCCGTA5C，ACTTCAGTCTTATGGCGCCTGTCATCAGAACTTGAGTCGCCCC/6/一/"AACCAGCTGAGGCCCAAGA_ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA通過植物基因工程技術可以將5C/￡4基因在水稻中特定組織部位或特定時期異位表達，通過調控5C7丄4基因的時空表達模式及表達量達到調控水稻產量和纖維素含量的目的。另外，還可以利用5C7丄4基因借助基因工程方法對植物纖維素的結構進行改造，培育纖維素結晶度低、易于降解新型能源型植物，從而提高植物秸桿的利用效率。本發明所涉及到的農桿菌介導的遺傳轉化試劑及配方如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine,6-節基腺嘌呤)；KT(Kinetin,激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，卩引哚乙酸)；2，4-D(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid,2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate,水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KN03)28.3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0g硫酸銨((NH4)2S04)4.63g硫酸鎂(MgS04.7H20)1.85g氯化鈣(CaCl2.2H20)1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)J碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3B03)0.16g硫酸錳(MnS04'4H20)0.44g硫酸鋅(ZnS04'7H20)0.15g室溫下溶解并定容至IOOOml。3)Fe2EDTAJfc存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeS04'7H20)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70。C，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA'2H20)3.73g在它們都溶解后混合在一起，7(TC水浴中保持2小時，定容至1000ml，4'C保存備用。4)維生素t!:存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素Bl(ThiamineHC1)0.1g維生素B6(PyridoxineHC1)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至lOOOml,4'C保存備用。5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4N03)硝酸鉀磷酸二氫鉀硫酸鎂氯化鈣室溫下溶解并定容至IOOOml。6)MSmin母液(100X)碘化鉀硼酸硫酸錳(MnS04'4H20)硫酸鋅(ZnS04'7H20)鉬酸鈉(Na2Mo04'2H20)硫酸銅(CuS04'5H20)氯化鈷(CoCl2'6H20)0.083g0.62g2.23g0.86g0.025g0.0025g0.0025g16.5g削g1.7g3.7g4.4g室溫下溶解并定容至IOOOml。7)2，4-DC存液(1rag/ml)2,4-D100mg.lmlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,室溫保存。8)6-BAJC存液(lmg/ml)6-BA100mg.1milN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml,室溫保存。9)NAAjfc存液(lmg/ml)NAA100mg.lmllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,4'C保存備用。10)IAA撥液(lmg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,4'C保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml,滅菌后4'C保存備用。12)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內，4'C保存備用。13)IN氫氧化鉀忙存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至lOOml,室溫保存備用。14)KT貯存液(lmg/ml)KT100mg.1milN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTAJt存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-DJC:存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸并定容至IOOOml,分裝到50ml三角瓶(25ml>,封口滅菌。2)繼代培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTAje存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2,4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至卯Oml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸并定容至IOOOml,分裝到50ml三角瓶(25m1/，封口滅菌。3)預培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素!t存液(100X)2.5ml2,4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調節pH值至iJ5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基并加入5ml葡萄糖貯存液和250nlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。4)共培養基N6max母液OOX)12.5mlN6mix母液(100X)Fe2+EDTA貯存液(100X)維生素貯存液(100X)2，4-D貯存液CH蔗糖瓊脂粉1.25ml2.5ml2.5ml0.75ml0.2g5g1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基并加入5ml葡萄糖貯存液和250piAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿),5)懸浮培養基5ml0.5ml0.5ml1ml0.2ml0.08g2gN6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAJC存液(100X)維生素貯存液(100X)2，4-D貯存液CH蔗糖加蒸餾水至100ml，調節pH值至lj5.4,分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入lml葡萄糖貯存液和100plAS貯存液。6)選擇培養基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAJt存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH25ml2.5ml2.5ml2.5ml0.625ml0.15g"g1.75g封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250nl50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。瓊脂粉加蒸餾水至250ml，調節pH值至U6.0，7)預分化培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(ioox)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAAJt存液50nlIAA貯存液50piCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9,封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250pl50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。8)分化培養基N6max母液(10X)100ralN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTAlt存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA)d存液2mlKTIC存液2mlNAAJt存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCHlg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝至ijlOOml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTAJt存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養基(LB培養基不含瓊脂粉)蛋白胨2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后室溫保存備用。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟愈傷誘導(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15%氯化汞(HgCl2)15分(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)置于黑暗處培養5周，溫度26il'C。愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度26士rc。預培養挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養基上黑暗下培養4天，溫度26士rc。農桿菌培養(1)在帶有卡那霉素的LA培養基上預培養含構建好載體的農桿菌EHA105兩天，溫度28'C;(2)將農桿菌轉移至懸浮培養基里，28'C搖床上培養2-3小時。農桿菌侵染(1)將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內；(2)調節農桿菌的懸浮液至OD60()0.8-1.0;(3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養基上培養2天，溫度19-20。C。愈傷洗滌和選擇培養(1)滅菌水洗漆愈傷至看不見農桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm,第二次以后為250ppm)分化(1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7天；(2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26'C，5—7周。生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時產生的根；(2)然后將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26'C。移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。在溫室煉苗約2周左右后，再移載大田。序列表<110〉華中農業大學<120>控制水稻纖維素合成的基因BC1L4作為水稻遺傳改良的應用<130〉〈141〉2009-05-13〈歸1〈170>Patentlnversion3.1〈210>1〈211>2851〈212>DNA<213>水稻(Oryzasativa)<220〉<221>gene〈222>(1)..(2851)<223>〈220〉〈221>exon〈222>(2559)..(2848)〈223〉〈220〉<221〉exon〈222〉(2158)..(2438)〈223>〈220〉〈221〉exon〈222〉(1907).(2066)<223〉<220><221〉exon〈222〉(1053)..(1509)<223〉<220〉〈221>exon<222>(689).(768)〈223〉〈220〉<221>exon<222>(1)..(103)17〈223〉<400〉18tggcggtgggggga>gccggg3gctcc卿tecgtggcgccgtgctgc48MetAlaValGlyGlyAlaGlySerSerArgSerValAlaProCysCys151015tgctgcgccgtgctgetcgcggcggcgctgetcttctccgcgccggcc96CysCysAlaValLeuLeuAlaAlaAlaLeuLeuPheSerAlaProAla202530accacaggtttccccggctctcgctccttctctctctctctctctgtttgcgcctgc153ThrThrcagctcgtgccgtgccggtctcagatccatgcgccggcccgatcgecgaggctctcgact213犯ctttcacga_gttgtg3cc3cgag3tttgggc幼tgcgatcccctcctgsctgtgtcgg273tggctccagttcggtgtgtcggtggctttttttttttttttgaattccgattcgtttcat333cagtaattcagttcgtttcgctcctgcttttgccag犯ttcttggagcagattaggtagc393agtaattcagttcgtttcgctcccgcttgaceggattettggatcaggttaggtagctta453gatccattgagaggagcacgcatggagcttccttcccacactaatcagtgcccaaggtga513cacgatataacgtttcccttc鄉卿ggcctaactcatggttcaggatcgaattcga^agggcttattcttgstatgcaaaaaattccc3tctgccgaaactcttttttttccagatcgctgctaatttgttttcctctaaategggat573acccccattt633tgcagag690GlugettatgatgcgctggatccaaatggaaacateAlaTyrAspAlaLeuAspProAsnGlyAsnlieacgataa犯tgggac738ThrlieLysTrpAsp404550gttatgtcgtggactcctgatggctatgttgtaagtagcaaccccacaccValMetSerTrpThrProAspGlyTyrVal556078818aaaaaatgc3tcttgt3ttgttcgttcaaa犯aatccatctgcatcttgtttccccaact848attattaggccataattttattttatttgatactactacaagttgtctttgaagtacaaa908gttgatagcataaccagcagctggtcagaaacatatgcagcaatt犯caataataaacac968gagttttatgtcagcatattatggatactctgattatcttgtatatgtgtgtcatgattt1028ccccccaaaatgtttcttgtgcaggetgtggtcacgatgttcaactatcaaAlaValValThrMetPheAsnTyrGin6570c犯ttcGinPhegca犯gAlaLyscsgggcGinGly卿ga/tLysAsp120caaateGinlie135gacccaAspProgggactGlyThreggArg卿LysAsp105cccProC3CHisgagGlu90tgcCys8caThratelie75gtcValteaSergttValgetAlateaSeraccThrcagGinattlie卿LysgttValasttgcAsnCysaatgetAsnAla155aac肌gAsnLys170tgcCys140getAlaThrgcaAlatggTrpttcPhegatAsp125LyscctProtegSertctSergttValLys110ctgLeugetAlatecSeraagLysgggGly3tgMet95ggtGlycttLeuggaGlytggTrp80gttValggcGlycc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