專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米mon863的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法，具體 說(shuō)是一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N863的方法，通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)管濁度或 觀察加入IOOO x SYBR Green后顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來(lái)判斷擴(kuò)增 情況。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因作物(Genet ically Modif ied Crop s，筒稱(chēng)GMC)，是指人 類(lèi)利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)，將某些生物基因轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物中去，改造農(nóng)作 物的遺傳物質(zhì)，使其在性狀(如抗性、產(chǎn)量、熟期)、品質(zhì)等方面向人類(lèi)需 要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變，這樣得到的農(nóng)作物叫做"轉(zhuǎn)基因作物"，也稱(chēng)為"基因改 造作物"或"基因改良作物"。
玉米是世界上重要的糧食作物之一，在其生長(zhǎng)過(guò)程中受到的危害主要 來(lái)自病蟲(chóng)害，其次為雜草。據(jù)統(tǒng)計(jì)，玉米如不噴施殺蟲(chóng)劑可能造成59%的 產(chǎn)量損失。因此，基因工程技術(shù)最早應(yīng)用在玉米上是開(kāi)發(fā)具有抗蟲(chóng)和抗除 草劑特性的玉米品系。經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織(organization for economic cooperation and develclpment， 0ECD) 2000年登記的轉(zhuǎn)基因玉米品系共 計(jì)18種，主要改良性狀為抗病蟲(chóng)害和耐除草劑等。2000年美國(guó)栽種的轉(zhuǎn)基 因玉米中72%屬抗蟲(chóng)害特性，24%屬耐除草劑，4%則兼具抗蟲(chóng)害及耐除 草劑兩種特性。
MON 863轉(zhuǎn)基因玉米是美國(guó)孟山都公司2003年投放市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品， 具有防病蟲(chóng)害能力。2004年4月，歐盟食品安全局確認(rèn)MON863安全可靠。 2005年8月，歐盟批準(zhǔn)將這種轉(zhuǎn)基因玉米用于動(dòng)物飼料，2006年1月批準(zhǔn)其 用于人類(lèi)食品。
1998年8月以來(lái)，國(guó)際上就轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境的安全 性問(wèn)題引發(fā)了一場(chǎng)世界性的關(guān)于"生物安全"的論戰(zhàn)。不同國(guó)家和國(guó)際組
3織對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、可能帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 作為食品對(duì)人體健康問(wèn)題、產(chǎn)品加貼標(biāo)簽問(wèn)題、運(yùn)輸問(wèn)題、國(guó)際貿(mào)易問(wèn)題、 知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題等展開(kāi)了激烈爭(zhēng)論隨著大量轉(zhuǎn)基因作物逐步走向市場(chǎng)，轉(zhuǎn)基 因作物和轉(zhuǎn)基因作物加工的食物的安全性問(wèn)題也開(kāi)始受到人們的關(guān)注。從 本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因作物和常規(guī)育成的作物品種沒(méi)有差別。常規(guī)育種一般是 通過(guò)有性雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)，而植物基因工程則是用農(nóng)桿菌、基因槍、電激、微
注射等技術(shù)將外源重組DNA導(dǎo)入植物基因組中。盡管從理論上講，轉(zhuǎn)基因 的遺傳特性及表型應(yīng)該可以更加精確的預(yù)測(cè)，在應(yīng)用上更加安全，但對(duì)轉(zhuǎn) 基因作物進(jìn)行安全性評(píng)估仍然很有必要。
歐盟最早提出對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理。1999年，要求出口到歐盟 的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識(shí)的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亞、新西蘭對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做 了不同規(guī)定，域值從1-5%不等。
我國(guó)于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》， 于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)、標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管 理三個(gè)配套管理辦法，確定了第一批實(shí)施標(biāo)識(shí)管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目 錄，并于2002年3月20日起正式實(shí)施。
目前，轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)途徑主要有兩種， 一是檢測(cè)是否有外源基因 (DNA )，該途徑主要基于PCR技術(shù)和核酸探針的雜交檢測(cè)技術(shù)能精確、快 速地檢測(cè)GMC中是否有外來(lái)基因(包括目的基因、標(biāo)記基因和引物)；二是 檢測(cè)是否有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)的產(chǎn)物)，主要采用化學(xué)分析、凝膠電 泳和酶聯(lián)免疫的方法，檢測(cè)工作較為繁雜。其中的PCR檢測(cè)方法是主要的 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括定性PCR方法、復(fù)合PCR方法、巢式PCR方法、 竟?fàn)幮远縋CR方法、熒光定量PCR方法等。國(guó)內(nèi)外推廣使用的是定性PCR 和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。PCR擴(kuò)增技術(shù)的一般檢測(cè)程序是提取植物基 因組DNA —PCR擴(kuò)增—酶切試驗(yàn)—檢測(cè)目的基因—檢測(cè)報(bào)告。檢測(cè)儀器設(shè) 備主要是PCR儀、電泳儀、冷凍離心機(jī)、紫外觀察(或成像)儀等。由于 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)所需的技術(shù)條件較高，儀器設(shè)備較為昂貴，且檢測(cè)成本和費(fèi)用較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863的方法及根 據(jù)外源基因與內(nèi)源基因接合處序列設(shè)計(jì)一套引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)肉眼 觀察濁度或觀察加入SYBR Green后顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 判斷擴(kuò)增情況。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863的特異性引物，其中外引物正向序 列5，-TCAAAGATGGAATGGCCCAG-3，，外引物反向序列 5，-TCTTTGAGTGCCCGTCGTA-3，； 內(nèi)引物正向序列 5，-CCGGTCGTGCGTGGTATGTTCAAGGTTAACGTACGCGATGC-3，，內(nèi)引物反向序列 5'-CGCAGGTGCCAGATCCTCAATGGTACACTAGGCTGATCGA-3'。
本發(fā)明采用上述一套引物進(jìn)行快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N863的方法，其 特征在于包括如下步驟
(1)將引物混合溶液及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模 板DNA,在63-65 。C進(jìn)行45-60min，并且在80。C持續(xù)2min, 4XM呆存；
其中的擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25yL，其各種成分分別 為10xThermoPo1 Buffer 2.5|iL， 4mol/L甜菜堿6.25pL， 0. 2mol/L MgS04 0.25juL，引物混合液lpL， lOymol/L dNTPs 3. 5pL, 8000U/L 鏈置換活性DM聚合酶l-2pL，模板DMl-5pL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊 到25yL，混勻離心4000-8000rpm, 5-10秒上才幾。
(2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25yL,采用不同方法判斷擴(kuò)增與否， 包括直接向擴(kuò)增管中加入焚光染料SYBR Green，通過(guò)顏色變化觀察有無(wú) 擴(kuò)增反應(yīng)；或評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀物的量來(lái)觀察有無(wú)擴(kuò)增反 應(yīng)；或通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明所述的引物混合溶液指的是將上迷4條特異引物分別配成濃度 為100nmol/L的母液，然后取外引物各ljiL，內(nèi)引物各8pL,加滅菌去 離子水2jiL,充分混合，制得引物混合溶液。
5本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中所述的鏈置換活性的DNA聚合酶為 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2juL。
本發(fā)明所述的熒光染料SYBR Green加入量為l-2jnL,濃度為1000倍。 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，模板DM指的是從待測(cè)樣品提取的基因組廳。
為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的測(cè)定方法，下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法 4故以詳細(xì)的i兌明。
1、 原理
本方法應(yīng)用一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其原理是采用4條特異引物及 一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63X:-65'C對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間 擴(kuò)增效率可達(dá)到109-1(T個(gè)拷貝。具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易 檢測(cè)等特點(diǎn)。
2、 引物設(shè)計(jì)
本研究依據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MON863外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計(jì) 了4條引物。引物由上海生物工程公司合成。
表l引物序列表如下:_
_引物名稱(chēng)_序列(5'to3')__
Mon863正向外引物 TCAAAGATGGAATGGCCCAG Mon863反向外引物 TCTTTGAGTGCCCGTCGTA
Mon863正向內(nèi)引物 CCGGTCGTGCGTGGTATGTTCAAGGTTAACGTACGCGATGC Mon863反向內(nèi)引物 CGCAGGTGCCAGATCCTCAATGGTACACTAGGCTGATCGA
3、 反應(yīng)條件
反應(yīng)試劑需要鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、轉(zhuǎn)基因玉米MON863特異性 引物、甜菜堿、MgS0,和反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間依 據(jù)引物的效率和模板DM質(zhì)量變化， 一般為lh或更少。加入模板DM，在 63-65。C進(jìn)行45-60min，并且在8(TC,持續(xù)2min而終止。
這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)就是不需要熱循環(huán)，不需要PCR儀等昂貴的儀器，僅 需要恒溫水浴鍋或金屬加熱塊維持反應(yīng)溫度。材料與方法
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物；甜菜堿溶液；MgS04溶液；dNTPs;
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25jiL，其各種成分及終濃度 分另'J為10 x ThermoPol Buffer 2. 5 4mol/L甜菜堿6. 25 uL， 0. 2mol/L MgS04 0. 25 pL,引物混合液lnL， 10 y mol/L dNTPs 3. 5 y L， 8000U/LBst DNA聚合酶大片段l-2pL,模板DNAl-5nL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 p L, 混勻離心(4000-8000rpm， 5-10秒)后上機(jī)。
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程在63-65匸進(jìn)行45-60min，并且在80X:持續(xù)2min, 4X:保存；
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25]uL用不同的檢測(cè)方法判斷擴(kuò)增與否。 4、擴(kuò)增結(jié)果觀察
有三種觀察方法，適合不同情況下進(jìn)行
1) 使用2%瓊脂糖凝膠，加入EB染色劑，100V電泳50min，在紫外燈下 觀察。反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生各種片斷長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此在電泳圖鐠 中顯示為從點(diǎn)樣孔處開(kāi)始的彌散和階梯狀條帶現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)圖l。
2) 由于反應(yīng)形成大量雙鏈DNA產(chǎn)物，所以可直接向擴(kuò)增管中加入熒光 染料SYBRGreen，通過(guò)肉眼觀察，無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管呈橙色，有擴(kuò)增反 應(yīng)的反應(yīng)管將變?yōu)榫G色。結(jié)果見(jiàn)圖2。
3) 檢測(cè)還可以通過(guò)評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來(lái)進(jìn) 行。在反應(yīng)中，在核酸大量合成時(shí)，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸4美沉淀，可以用 肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)反應(yīng)管中的沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。
本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因玉米MON863檢測(cè)的擴(kuò)增方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1) 操作簡(jiǎn)便不需要復(fù)雜的儀器，只需一恒定溫度就能反應(yīng)。
(2) 高特異性該技術(shù)由4條引物擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)段，因此具有高 度特異性。
(3) 快速高效整個(gè)擴(kuò)增不到lh即可完成，產(chǎn)量可達(dá)到109-l(T個(gè)拷貝；
(4) 鑒定簡(jiǎn)便可以用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度或者通過(guò)SYBR Green顏色變化判斷擴(kuò)增與否。


圖l為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜。自左向右依次為Marker、空白對(duì)照、 陰性對(duì)照、陰性樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性樣品。
圖2為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green結(jié)果圖。左為陽(yáng)性對(duì)照，右為陰性對(duì)照。
圖3為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green結(jié)果圖。從左邊依次為陰性對(duì)照、陽(yáng) 性對(duì)照、待測(cè)樣品。
圖4為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green結(jié)果圖。由左至右為陰性對(duì)照、陽(yáng)性 對(duì)照、待測(cè)樣品1和待測(cè)樣品2。
圖5為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖語(yǔ)。由左至右DL2000 DNA Marker、陰 性對(duì)照、待測(cè)樣品l、待測(cè)樣品2、待測(cè)樣品3、陽(yáng)性對(duì)照。
圖6為實(shí)施例4，采用本發(fā)明方法擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫 外燈下觀察結(jié)果，其中1，10%; 2,1%; 3,0.1%; 4,0.01%; 5, 0.001%; 6, 0.0001%; 7,陰性對(duì)照；M,DL2000 DNA， Marker。
圖7為實(shí)施例4，常規(guī)定性PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析， 紫外燈下觀察結(jié)果。其中l(wèi)，10'/。; 2,1%; 3,0.1%; 4,0.01%; 5, 0.001%; 6， 0.0001%; 7，陰性對(duì)照；M，DL2000 DNA， Marker。
具體實(shí)施例方式
為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的方法，下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以 詳細(xì)的說(shuō)明，在此需加以說(shuō)明的是本發(fā)明所述的引物序列見(jiàn)表l。 實(shí)施例l
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜菜堿溶液；
0. 2mol/L MgS04溶液。
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25niL，其各種成分分別為 10x ThermoPol Buffer 2. 5juL， 4mol/L甜菜堿6. 25 n L， 0. 2mol/L MgS04 0.25yL，混合引物lpL， 10pmol/L dNTPs 3.5jiL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段ljiL，模板DNAlnL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25nL，混合均 勻后離心(4000rpm， 5秒)上機(jī)。
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)程序在63C進(jìn)行60min，并且在80X:，保溫2min， 4
x:，保存。
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液15yL，直接向擴(kuò)增管中加入熒光染料 lpL 1000 xSYBR Green，振蕩混勻，肉眼》見(jiàn)察結(jié)果。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng) 管呈橙黃色，有擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管將變?yōu)榫G色。結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖可見(jiàn)， 待測(cè)樣品為陽(yáng)性樣品，含有轉(zhuǎn)基因玉米MON863成份。
實(shí)施例2
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜菜堿溶液；
0. 2mol/L MgS(V溶液。
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分分別為 10xThermoPo1 Buffer 2. 5pL， 4mol/L甜菜堿6. 25pL， 0. 2mol/L MgS04， 混合引物O. 25yL , 10"mol/L dNTPs 3. 5juL， 8000U/L Bst DNA聚合酶 大片段2mL,模板DNA 2jiL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25jiL,混合均勻、 離心(8000rpm, IO秒)上機(jī)。
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)程序在65。C進(jìn)行45min,并且在80TC，保溫2min， 4 °C,保存。
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液15pL,直接向擴(kuò)增管中加入焚光染料 2juL 1000 xSYBR Green，震蕩混勻，肉眼觀察結(jié)果。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng) 管呈橙黃色，有擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管將變?yōu)榫G色。結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖可以看 出，待測(cè)樣品l為陽(yáng)性樣品，不含有轉(zhuǎn)基因玉米MON863成分，樣品2不含有 轉(zhuǎn)基因玉米MON863成分。
實(shí)施例3
(1)試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜菜堿溶液； 0. 2mol/L MgS04溶液。
9(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25yL，其各種成分分別為 10 x ThermoPol Buffer 2. 5 pL， 4mol/L甜菜堿6. 25pL， 0. 2mol/L MgS04, 混合引物O. 25niL , 10ymol/L dNTPs 3. 5nL， 8000U/L Bst DNA聚合酶 大片段2yL，模板DNA 5pL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25juL，混合均勻、 離心(5000rpm，5秒)上機(jī)。
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)程序在63lC進(jìn)行60min，并且在8(TC，保溫2min， 4 r,保存。
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液25 jaL經(jīng)2。/。瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外 燈下觀察結(jié)果。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管無(wú)明顯條帶，有擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管出 現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見(jiàn)圖5，三個(gè)樣品都含有轉(zhuǎn)基因玉米MON863成分。 實(shí)施例4
對(duì)比實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因玉米M0N86 3的定性PCR測(cè)定方法與本發(fā)明的測(cè)定方 法的對(duì)比
(1) 本發(fā)明方法試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合 酶大片段和10倍ThermoPo1 Buffer溶液；特異性引物混合液；4mol/L甜 菜堿溶液；0. 2mol/L MgS04溶液；DNA模板包括含有轉(zhuǎn)基因玉米M0N863成
份r/" o. i°/。、 o. oi°/。、 o. 001°/。、 o. oooi%、 oy。的樣品。
(2) 本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分 分別為10 x ThennoPol Buffer 2. 5 jiL， 4mol/L甜菜堿6. 25 jliL, 0. 2mol/L MgS04 0. 25 yL，混合引物ljnL， 10/imol/L dNTPs 3. 5jiL， 8000U/L Bst DM聚合酶大片段2jiL，模板DNA 5pL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25卩L， 混合均勻后充分混勻、離心(8000rpm, 5秒)上機(jī)。
(3) 本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)程序在63。C進(jìn)行60min,并且在80。C保溫2min， 4"C,保存；
(4) 本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取反應(yīng)產(chǎn)物4pL,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳 分析，紫外燈下觀察結(jié)果。無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管無(wú)明顯條帶，有擴(kuò)增反應(yīng) 的反應(yīng)管出現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見(jiàn)圖6: 1,10%; 2,1%; 3,0.1°/。； 4,0.01%; 5， 0.001%; 6， 0. 0001%; 7，陰性對(duì)照；M, DL2000 DNA， Marker。(5 ) PCR方法反應(yīng)引物采用本發(fā)明反應(yīng)中 一對(duì)外引物擴(kuò)增目標(biāo)基因。 PCR反應(yīng)為25 pL體系，IOxPCR buffer (Promega) 2. 5 pL， 10 mM dNTPs (Promega ) 0. 5 |i L，上游和下游引物(10 mM)各O. 5 p L, Taq酶(5 U/ jiL， Promega) 0.5 nL， DNA模板lpL，滅菌去離子水19.5 n L。反應(yīng)程 序?yàn)?5 。C預(yù)變性5min; 95'C變性30 s， 52匸退火30 s， 72匸延伸30s， 35 個(gè)循環(huán)；72 。C延伸7min。 PCR產(chǎn)物取IO p L于2。/。瓊脂糖凝膠電泳，100 V電 壓下40min,通過(guò)凝膠成像分析儀觀察，結(jié)果見(jiàn)圖7: 1,10%; 2,1%; 3,0.1%; 4,0.01%; 5， 0.001%; 6， 0. 0001%; 7，陰性對(duì)照；M， DL2000 DNA， Marker。 由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的方法靈敏度明顯高于PCR方法的 敏感度，能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米MON8 6 3含量更低的樣品。
在詳細(xì)說(shuō)明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在 不脫離上述申請(qǐng)專(zhuān)利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于 本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說(shuō)明書(shū)中所舉實(shí)例實(shí)施方式的限 制。序列表
<110> 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室
<120> —種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 20bp
<212> ■
<213> 人工序列
<權(quán)> 1
tcaaagatgg aatggcccag 20
<210> 2 <211> 19bp <212>畫(huà) <213>人工序列 <400> 2
tctttgagtg cccgtcgta 19
<210> 3 <211> 41bp <212> DNA <213>人工序列 <權(quán)> 3
ccggtcgtgc gtggtatgtt caaggttaac gtacgcgatg c 41
<210> 4 <211> 楊p<212> DNA <213> 人工序列 <400> 4
cgcaggtgcc agatcctcaa tggtacacta ggctgatcga 40
權(quán)利要求
1、用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863的特異性引物，其特征在于包括外引物正向序列5’-TCAAAGATGGAATGGCCCAG-3’，外引物反向序列5’-TCTTTGAGTGCCCGTCGTA-3’；內(nèi)引物正向序列5’-CCGGTCGTGCGTGGTATGTTCAAGGTTAACGTACGCGATGC-3’，內(nèi)引物反向序列5’-CGCAGGTGCCAGATCCTCAATGGTACACTAGGCTGATCGA-3’。
2、 一種采用權(quán)利要求1所述特異性引物快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863 方法，其特征在于包括如下步驟(1)將引物混合溶液及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模 板DNA，在63-65。C進(jìn)行45-60min,并且在80。C持續(xù)2min, 4匸保存；其中的擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL,其各種成分分別 為10xThermoPo1 Buffer 2.5yL， 4mol/L甜菜堿6.25jiL, 0. 2mol/L MgS04 0. 25 jnL，引物混合液lpL， 10 p mol/L dNTPs 3.5|nL， 8000U/L鏈 置換活性DM聚合酶l-2jaL，模板DM1-5mL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到 25juL，混勻、離心4000-8000rpm, 5—IO秒上才幾；(2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25pL，采用不同方法判斷擴(kuò)增與否， 包括直接向擴(kuò)增管中加入熒光染料SYBR Green，通過(guò)顏色變化觀察有無(wú) 擴(kuò)增反應(yīng)；或評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀物的量來(lái)觀察有無(wú)擴(kuò)增反 應(yīng)；或通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。
3、 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中所述的引物混合溶液指的是 將權(quán)利要求1所述的4條特異引物粉末分別配成濃度為100jamol/L的母 液，然后取外引物各lpL，內(nèi)引物各8iaL，加滅菌去離子水2pL,充分混合，制得引物混合溶液。
4、 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中熒光染料SYBR Green濃度為1000倍，加入量為1-2pL。
5、 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中所迷的鏈置換活性的DM聚 合酶為8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l-2|iL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)基因玉米MON863的快速檢測(cè)方法。其原理是采用4條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63℃-65℃對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，45-60min擴(kuò)增可達(dá)到10⁹-10¹⁰個(gè)拷貝。其鑒定采用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度或者通過(guò)加入SYBR Green顏色變化判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101519693SQ200910068338
公開(kāi)日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者蘭青闊, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 趙 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室