本發明涉及核酸恒溫擴增產物的快速檢測方法，利用核酸薄膜層析檢測試紙條檢測目標序列，應用在食源性致病菌的檢測過程中，具體涉及一種沙門氏菌解旋酶恒溫擴增及核酸薄膜層析檢測試紙條。

技術背景

分析以往發生的食品安全事件，細菌性污染引發的食物中毒情況發生頻率高，影響程度大，涉及范圍廣。食源性致病菌導致人類及動物感染疾病的發病率仍居高不下，常見的病原體主要為沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌等。沙門氏菌作為能夠導致人畜共患病致病菌在自然界廣泛存在，目前已經鑒定的沙門氏菌血清型有2500多種，其中致使食源性的沙門氏菌病發生主要的血清型為腸炎、鼠傷寒和豬霍亂沙門氏菌三種，菌體裂解后釋放的內毒素侵襲腸道黏膜、神經及血管，引起頭痛、嘔吐、腹瀉、發熱等中毒癥狀。由此可見食品安全形勢依然嚴峻，有效監控細菌性污染問題成為避免食品污染事件發生的主要解決途徑。因此，快速、敏感、特異的檢測方法對于臨床診斷和保障食品安全是必不可少的。常規標準檢測采取傳統培養的方法，待測致病菌需按照規定的檢測步驟單獨進行檢測，檢測周期長，操作復雜，工作量大，檢驗人員需要具備專業經驗，檢測結果易受人為因素影響從而出現誤判。

應用免疫學基本原理的檢測方法主要依據其抗原與抗體的特異性免疫結合反應。通過微生物本身特異性抗原物質刺激生物體得到相應的特異性抗體。其中采用酶聯免疫試劑盒及膠體金試紙條在檢測食源性致病菌方面已發展成相當成熟的技術，涉及檢測范圍廣泛。該類產品憑借其操作簡便、方便快捷、價格低廉和結果準確等特點，已經逐步進入基層檢測及醫療部門甚至被應用于普通家庭自主檢測，給人們日常診斷疾病帶來許多便利之處。然而免疫技術在目前研究階段及實際應用中仍存在一些不足之處，主要原因在于單克隆抗體的制備程序繁瑣，耗費大量人力及物質資源，由于多方面因素共同作用可能導致得到的抗體特異性并不理想，直接影響檢測結果的特異性和靈敏度。在實際檢測過程中時常發生假陽性或假陰性的報告，表現出該方法穩定性有待進一步提高。

近年來隨著分子生物學的深入研究與快速發展，實際檢驗中細菌等病原體測定方法已經由傳統的單一生化實驗水平轉移到分子生物學的方法如聚合酶鏈式反應(PCR)技術、基因芯片、探針雜交等技術。聚合酶鏈式反應通過特定引物有選擇性的進行體外模擬細胞內部擴增DNA或RNA片段的方法，該DNA復制方法可以實現將極少量基因組中的特定基因片段在短暫幾小時內呈現指數擴增，顯著提高檢測的靈敏度已成為目前研究水平上最靈敏的檢測技術，具有精確度高和特異性強的優勢，在微生物檢測、感染性和遺傳性疾病的診斷及基因突變的檢測等諸多領域發揮重要作用。然而，PCR技術需要精確的熱循環過程，局限于反應過程必需依賴精密儀器設備，因而限制了其在設施缺乏的現場檢測和基層地區應用。

目前國內外核酸恒溫擴增技術迅速發展，現已被廣泛應用的有環介導恒溫擴增、鏈替代擴增、滾環擴增、切口酶核酸恒溫擴增、依賴解旋酶的恒溫擴增等。其反應過程只需在恒定的溫度下進行且能夠實現DNA或RNA的特異性擴增，并且靈敏度能夠達到PCR技術的檢測水平。

發明專利“可避免假陰性的沙門氏菌恒溫熒光檢測引物組、試劑盒及檢測方法”(公開號CN105219870A)及“腸炎沙門氏菌的鏈置換恒溫擴增(SDA)快速檢測試劑盒及其檢測方法”(公開號：CN102382884A)描述依據不同擴增原理均以恒溫條件實現對沙門氏菌DNA核酸序列的擴增，但該類方法仍需結合凝膠電泳及成像系統對實驗數據進行處理分析，沒有明顯簡化檢驗操作步驟和無法在公共衛生突發事件中體現其優勢。

在恒溫擴增過程中利用分別修飾有特定標記物的上、下游引物將擴增產物中導入兩種不同類型的核酸標記物能夠被特異性結合的抗體或其配體捕獲，檢測原理依據近似雙抗體夾心法膠體金免疫層析分析方法，該方法已應用在針對多種食源性致病菌及病毒基因的恒溫擴增產物檢測中，關于沙門氏菌的核酸檢測，公開號為CN102329790A的發明專利“雙標記核酸恒溫擴增方法及檢測試紙條”提供一種利用標記生物素和異硫氰酸熒光素的探針的方法對LAMP反應產物實現快速檢測。但由于該擴增體系需要多條內外引物共同參與，難以避免形成引物二聚體等非特異性擴增產物的形成，故該類型擴增結果不適用于試紙條的檢測。

技術實現要素：

本發明目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種利用解旋酶恒溫擴增檢測具有危害性食源性致病菌-沙門氏菌(Salmonella)的快速檢測技術，特別是一種快速、準確、靈敏的沙門氏菌核酸快速檢測試劑盒、試紙及檢測方法。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種沙門氏菌核酸快速檢測試劑盒，包括正向引物invA-F:序列5’-ATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’,反向引物invA-R:序列：5’-ATGTAGAACGACCCCATAAACACCAA-3’，用地高辛和生物素分別標記上、下游引物的5’端，金標抗體，抗金標抗體種屬的抗體，顯色物生物素的配體物質。

而且，還包括擴增體系，所述擴增體系包括10×Annealing Buffer、dNTP、MgSO₄、NaCl、Enzyme Mix。

而且，所述金標抗體為地高辛和生物素。

而且，所述顯色物生物素的配體物質鏈霉親合素。

而且，所述金標抗體為鼠抗地高辛抗體，抗金標抗體為羊抗鼠二抗。

一種沙門氏菌核酸快速檢測試紙，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，樣品墊一端與金標墊一端端部重疊，金標墊另一端與硝酸纖維素膜端部重疊硝酸纖維素膜另一端部與吸水紙重疊，在硝酸纖維素膜間隔平行嵌裝有檢測線和質控線，檢測線在金標墊一側，質控線在檢測線與吸水紙端部之間；

所述金標墊上噴涂金標抗體，檢測線上包被顯色物生物素的配體物質，質控線上包被抗金標抗體種屬的抗體。

而且，所述金標墊上噴涂標抗地高辛抗體的膠體金，檢測線上包被鏈霉親合素，鏈霉親合素濃度為2mg/mL，質控線上包被稀釋80倍的羊抗鼠二抗。

而且，所述樣品墊為玻璃纖維，各部分重疊部分為2-10mm，在檢測試紙下部安裝PVC背板。

而且，快速檢測試紙使用上樣展開液為添加0.1％BSA和0.1％Tween 20的PBS緩沖液pH 7.4。

一種沙門氏菌核酸快速檢測方法，其包括如下步驟：

⑴將單克隆抗體如鼠抗地高辛抗體作為金標抗體吸附于顯色物質膠體金顆粒上，形成穩定結構的結合體固定在金標墊上，金標墊就是一個玻璃纖維制成的墊；

⑵鏈霉親和素作為標記物生物素的配體物質以線狀形式包被在硝酸纖維素膜上形成檢測線；

⑶選擇抗金標抗體種屬的抗體如羊抗鼠抗體同樣以線狀形式包被在質控線上結合過多的金標抗體；

⑷設計特異性恒溫擴增的上游引物5’和下游引物5’上分別修飾抗原或半抗原物質如地高辛和生物素，當存在待測沙門核酸擴增產物時，在恒溫條件下進行核酸的擴增反應得到同時連接兩種標記物地高辛-目標片段-生物素的擴增產物；

⑸將步驟⑷產生的地高辛-目標片段-生物素首先與金標墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結合，形成地高辛抗體-地高辛-目標片段-生物素顯色顆粒復合體；

⑹步驟⑸得到的顯色顆粒復合物在上樣緩沖液中通過毛細管作用沿纖維素膜向上移動至檢測線被受體鏈霉親合素捕獲得到地高辛抗體-地高辛-目標片段-生物素-鏈霉親合素復合體，在檢測線上沉降形成肉眼可視的顯色條帶，且未結合擴增產物的膠體金顆粒上包被的金標抗體與質控線上的羊抗鼠抗體結合，出現兩條顯色條帶即為陽性結果；

或者，當不存在沙門核酸擴增產物時，不發生上述步驟⑶-⑹，不能與金標墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結合，顯色物質膠體金顆粒不能與檢測線上包被的物質結合形成顯色條帶，質控線上的羊抗鼠抗體與膠體金顆粒上包被的金標抗體結合出現一條顯色條帶即為陰性結果。

本發明與其他技術相比具有以下優勢：

本發明開發出以解旋酶恒溫擴增技術并聯合核酸薄膜層析檢測試紙條檢測沙門氏菌的一種更為高效的分子檢測方法，引物的設計選擇最適擴增片段位置及長度能夠有效避免非特異性擴增的形成，并優化得到最佳展開緩沖液使核酸試紙條達到最理想的顯色效果。該檢測方法不會污染實驗室和周圍環境且不需要昂貴的儀器設備或專業操作技能，從而可以在實驗條件不完善的情況下應對大規模樣品的檢測，具體有點體現在以下幾個方面：

1、本發明所述的檢測沙門氏菌解旋酶恒溫擴增產物的核酸薄膜層析檢測試紙條的特異性強，靈敏度高，操作簡便，穩定性強；

2、擴增過程在封閉的反應體系中進行有效的避免擴增產物的污染；

3、反應速度快，完成樣品的全部檢測步驟只需1小時左右；

4、檢測過程不需要復雜昂貴的儀器設備及專業技術人員操作；

5、適應于食品致病菌的現場快速檢測的初步判斷。

附圖說明

圖1為沙門氏菌引物特異性驗證。圖中M：DNA分子量標記DL2000；1：空白對照；2：腸炎沙門氏菌；3：甲型副傷寒沙門氏菌；4：腸沙門氏菌腸亞種；5：豬霍亂沙門氏菌；6：腸沙門氏菌腸亞種傷寒血清型；7：大腸桿菌O157:H7；8：大腸桿菌(非O157:H7)；9：宋內氏志賀氏菌；10：福氏志賀氏菌；11：產氣腸桿菌；12：單增李斯特菌；13：金黃色葡萄球菌；14：空腸彎曲桿菌。

圖2為核酸薄膜層析檢測試紙條結構。圖中1：樣品墊；2：硝酸纖維素膜；3：背板；4：金標墊(玻璃纖維)；5：檢測線；6：質控線；7：吸水紙。

圖3為沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條特異性驗證。圖中1：腸炎沙門氏菌；2：甲型副傷寒沙門氏菌；3：腸沙門氏菌腸亞種；4：豬霍亂沙門氏菌；5：腸沙門氏菌腸亞種傷寒血清型；6：大腸桿菌O157:H7；7：大腸桿菌(非O157:H7)；8：宋內氏志賀氏菌；9：福氏志賀氏菌；10：產氣腸桿菌；11：單增李斯特菌；12：金黃色葡萄球菌；13：空腸彎曲桿菌。

具體的實施方式

為了理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步說明：下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。

本發明結合解旋酶恒溫擴增技術和核酸薄膜層析檢測技術，建立沙門氏菌核酸快速檢測的方法。本發明旨在利用核酸薄膜層析檢測試紙條檢測的解旋酶恒溫擴增產物，從而實現核酸的快速檢測。設計分別標記生物素和地高辛的沙門氏菌的特異性引物，目標核酸經過解旋酶恒溫擴增形成修飾有兩種標記物的擴增產物，該擴增產物能夠被包被有特異性識別的配體和抗體核酸薄膜層析檢測試紙條檢出。應用抗原或半抗原生物小分子標記的核酸分子能夠被其特異性的抗體或配體識別免疫學檢測原理實現對目標核酸的檢測。常用的核酸標記物中生物素能夠特異性結合其配體鏈霉親合素，而地高辛易于獲得其特異性抗體。因此選擇上述兩種物質作為引物標記物。

1、本發明提供兩條沙門氏菌的特異性擴增引物，選擇沙門氏菌特異性invA基因設計正向引物invA-F:序列5’-ATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’,反向引物invA-R:序列：5’-ATGTAGAACGACCCCATAAACACCAA-3’，地高辛和生物素分別標記上、下游引物的5’端，當目標核酸存在時，經過解旋酶恒溫擴增能夠得到大小為101bp的DNA片段；若沒有目標核酸存在時，則無擴增產物形成，如圖1所示。

2、本發明提供沙門氏菌的解旋酶恒溫擴增方法：沙門氏菌的解旋酶恒溫擴增反應體系包括正向、反向引物(75nM)、10×Annealing Buffer(7μL)、dNTP(3.5μL)、MgSO₄(2μL)、NaCl(4μL)、Enzyme Mix(3.5μL)，用無菌超純水補充到50μL。將提取得到的1μL沙門氏菌DNA作為陽性對照的模板，等量的無菌超純水作為陰性對照加入含有沙門氏菌解旋酶恒溫擴增反應液的PCR管中，將上述反應體系置于68℃下反應90min進行沙門氏菌的恒溫擴增。

3、本發明提供的沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條的檢測方法，其包括如下步驟(原理如圖2所示)：

⑴將單克隆抗體如鼠抗地高辛抗體作為金標抗體吸附于顯色物質膠體金顆粒上，形成穩定結構的結合體固定在金標墊(就是一個玻璃纖維墊)上。

⑵鏈霉親和素作為標記物生物素的配體物質以線狀形式包被在硝酸纖維素膜上形成檢測線。

⑶選擇抗金標抗體種屬的抗體如羊抗鼠抗體同樣以線狀形式包被在質控線上結合過多的金標抗體。

⑷設計特異性恒溫擴增的上游引物5’和下游引物5’上分別修飾抗原或半抗原物質如地高辛和生物素，當存在待測沙門核酸擴增產物時，在恒溫條件下進行核酸的擴增反應得到同時連接兩種標記物地高辛-目標片段-生物素的擴增產物。

⑸將步驟⑷產生的地高辛-目標片段-生物素首先與金標墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結合，形成地高辛抗體-地高辛-目標片段-生物素顯色顆粒復合體。

⑹步驟⑸得到的顯色顆粒復合物在上樣緩沖液中通過毛細管作用沿纖維素膜向上移動至檢測線被受體鏈霉親合素捕獲得到地高辛抗體-地高辛-目標片段-生物素-鏈霉親合素復合體，在檢測線上沉降形成肉眼可視的顯色條帶，且未結合擴增產物的膠體金顆粒上包被的金標抗體與質控線上的羊抗鼠抗體結合，出現兩條顯色條帶即為陽性結果；

或者，當不存在沙門核酸擴增產物時，不發生上述步驟⑶-⑹，不能與金標墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結合，顯色物質膠體金顆粒不能與檢測線上包被的物質結合形成顯色條帶，質控線上的羊抗鼠抗體與膠體金顆粒上包被的金標抗體結合出現一條顯色條帶即為陰性結果。

4、本發明還提供沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條結構如圖2所示：其包括PVC背板上依次為樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜(NC)和吸水紙，上述各部分重疊部分至少保留2mm，硝酸纖維素膜上分別設有檢測線(包含標記物生物素的配體物質)和質控線(包含鏈霉親和素)，所有的材料需在37℃下過夜干燥。

5、本發明對沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條優化：首先對沙門氏菌解旋酶恒溫擴增的反應條件分別進行優化，其中包括引物濃度、MgSO₄濃度、dNTP濃度及反應溫度，得到最佳的反應條件使擴增反應達到最理想的效果。同時優化膠體金檢測試紙條的設計，包括硝酸纖維素膜的類型、檢測線與質控線包被濃度及上樣展開液，使試紙條呈現最佳的顯色效果。

以下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中使用的試劑材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑供應商購買得到。

實施例1

沙門氏菌解旋酶恒溫擴增體系的優化

以引物濃度，MgSO₄，dNTP及反應溫度為變量對沙門氏菌進行正交試驗，引物濃度分別為75nm、80nm和85nm；MgSO₄濃度分別為3mM、3.5mM和4mM；dNTP添加量分別2.5μL、3.5μL和4.5μL；反應溫度分別為63℃、64℃和65℃。其擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳擴增后利用凝膠成像儀觀察擴增效果，經驗證得出沙門氏菌擴增50μL總反應體系，其中包括DNA模板1μL，引物濃度為80nM，MgSO₄濃度為3.5mM，dNTP添加量為4.5μL，最后添加3.5μL Enzyme Mix，置于64℃溫度下反應60min。

實施例2

沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條制備

1、膠體金標記抗體的制備

⑴取1mL的10nm膠體金溶液置于1.5mL干凈的離心管中，滴加一定量的K₂CO₃溶液調節膠體金溶液至最適pH；

⑵取15μL的濃度為1μg/μL抗體滴加到膠體金溶液中，迅速震蕩5min，混勻后的溶液于4℃條件下靜置1h；

⑶滴加20μL 20％的BSA溶液，10μL 20％的PEG 20000溶液，混勻后的溶液于4℃條件下靜置30min；

⑷在2000rpm，4℃低溫條件下，離心15min，小心移取上清液至干凈的離心管中，棄去未標記的膠體金沉淀物；

⑸將上清液在10000rpm，4℃低溫條件下，離心30min，棄上清液，保留標記的膠體金顆粒沉淀，用金標工作液復溶5倍，4℃保存。

2、沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條工作條件的優化

⑴選取四種不同型號的硝酸纖維素膜AE 98、Milipore HF90s、Milipore HF135s、Milipore HF180s，驗證試紙條顯色效果；

⑵檢測線包被鏈酶親和素濃度分別選取0.5、1.0、1.5、2mg/mL，質控線包被的羊抗鼠二抗分別選取稀釋60、80、100、120倍，驗證試紙條顯色效果；

⑶上樣展開液分別采用PBS緩沖液(pH 7.4)、含0.1％BSA的PBS緩沖液(pH 7.4)，0.1％Tween 20的PBS緩沖液(pH 7.4)以及Tris EDTA(TE，pH 8.0)，驗證試紙條顯色效果；

其中選擇型號為Milipore HF 135s的硝酸硝酸纖維素膜，檢測線包被鏈酶親和素濃度2mg/mL，質控線包被稀釋80倍的羊抗鼠二抗，采用Tris EDTA上樣緩沖液的條件下試紙條顯色效果最佳。

3、沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條組裝

⑴將膠體金標記抗體按照30μL/cm逐滴均勻涂布在規格為83mm×3mm金標墊上，室溫真空過夜烘干備用。

⑵檢測線(T線)包被鏈霉親合素，濃度為2mg/mL，質控線(C線)包被羊抗鼠二抗，稀釋100倍，利用劃膜儀在硝酸纖維素膜(NC膜)上按照1μL/cm劃出C、T線，37℃過夜烘干備用。

⑶同樣將樣品墊和吸水紙在37℃過夜烘干，與金標墊，NC膜，吸水紙組裝成試紙條，利用切條機切割成規格為60mm×3.7mm的試紙條，固定在塑料外殼內，室溫下密封、避光、干燥保存。

實施例3

沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條檢測方法的建立

⑴以1μL沙門氏菌DNA作為模板加入含有沙門氏菌解旋酶恒溫擴增反應體系的PCR管中，同時以等量的無菌雙蒸水作為陰性對照，將上述反應體系置于68℃下反應60min進行沙門氏菌的解旋酶恒溫擴增。

⑵選擇0.1％BSA和0.1％Tween 20的PBS緩沖液(pH 7.4)作為上樣展開液，取10μL擴增產物經上樣展開液稀釋10倍后滴加到膠體金試紙條上進行檢測，試驗需重復三次，5分鐘后觀察檢測結果。沙門氏菌的擴增產物呈陽性結果檢測線與質控線均顯紅色；空白對照成陰性只有質控線顯紅色。

實施例4

沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條特異性實驗

按照實例3中所述的方法檢測其他常見食源性致病菌包括大腸桿菌O157:H7、志賀氏菌、產氣腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿，并以等量無菌超純水作為陰性對照，除五株沙門氏菌結果成陽性，其他實驗菌株結果均成陰性，實驗結果如圖3所示，表明該檢測技術具備高特異性。

實施例5

沙門氏菌核酸薄膜檢測試紙條純培養物靈敏度實驗

⑴純菌液靈敏度檢測沙門氏菌，將其接種于10mL LB液體培養基中，37℃過夜培養；

⑵各取1mL進行細菌計數，用0.9％無菌生理鹽水對純菌液進行10倍梯度稀釋，各取1mL用于DNA的提取作為做實驗模板；

⑶按照恒溫擴增反應體系進行試驗，取10μL擴增產物用上樣展開液稀釋至100μL，滴加到試紙條樣品墊上，取試驗重復三次，5min后觀察檢測結果，確定該方法在檢測純菌液的靈敏度。

將沙門氏菌純培液濃度養梯度稀釋至4.5×10¹CFU/mL，經解旋酶恒溫擴增反應后滴加在試紙條上均能顯示出陽性結果，表明沙門氏菌核酸薄膜層析試紙條的靈敏度為4.5×10¹CFU/mL。

實施例6

沙門氏菌核酸薄膜試紙條實際樣品靈敏度實驗

1、固態樣品靈敏度實驗

⑴在無菌條件下稱取25g固體樣品置于無菌均質袋中，均質3min。

⑵將樣品注入225mL SC培養液中，將培養至濃度為10⁸CFU/mL的沙門氏菌，用0.9％無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后，添加1mL的菌液置于樣品增菌液中，使其終濃度為10¹CFU/mL，

⑶在37℃，200r/min條件下培養。期間每隔2h采集一次培養樣品，

⑷每份設定兩個平行實驗組熱處理法提取DNA，同時未添加菌的樣品作為空白對照，按照恒溫擴增反應體系進行試驗，

⑸取10μL擴增產物用上樣展開液稀釋至100μL，滴加到試紙條樣品墊上，試驗重復三次，5min后觀察檢測結果，確定檢測固體類樣品該方法的靈敏度。

2、液態樣品靈敏度實驗

⑴在無菌條件下量取25mL液態或半固體樣品，將樣品注入225mL SC培養液中；

⑵將培養至濃度為10⁸CFU/mL的沙門氏菌，用0.9％無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后，添加1mL的菌液置于樣品增菌液中，使其終濃度為10¹CFU/mL；

⑶在37℃，200r/min條件下培養。期間每隔2h采集一次培養樣品；

⑷每份設定兩個平行實驗組熱處理法提取DNA，同時未添加菌的樣品作為空白對照，按照恒溫擴增反應體系進行試驗；

⑸取10μL擴增產物用已優化的上樣展開液稀釋至100μL，滴加到試紙條樣品墊上，試驗重復三次，5min后觀察檢測結果，確定檢測液態類樣品該方法的靈敏度。

添加有濃度為10¹CFU/mL的沙門氏菌的實際樣品，在增菌2h后能檢出，同時未添菌的樣品未檢出，結果表明該方法可以應用在實際樣品的快速檢測中。