專利名稱：一種運用熒光pcr技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法
技術領域：
本發明涉及屬于過敏原檢測技術，具體地說是運用熒光PCR反應來檢測過敏原的技術， 特別是食品中過敏原榛果成分的方法。
技術背景食物過敏是人們對食物產生的一種不良反應，屬于機體對外源性物質的一種變態反應。 近二十年來，食物過敏逐漸被重視，已被認為是嚴重的公共衛生問題，而且WHO預測食物 過敏可能成為今后最常見的流行病之一。根據美國FDA資料統計，在美國，2%的成年人和 5%的嬰幼兒患有食物過敏癥，每年大約30000人需要臨床緊急治療，150人死于食物引起的 過敏反應。在所有過敏反應中，花生和樹堅果過敏占10-47%。FDA于2005年10月5日發布《食品過敏原標識和消費者保護法案一2004》(FALCPA)， 規定主要食物過敏原包括樹堅果等八種食物的成分。日本標簽標注也要求將樹堅果列為推薦 標注成分。據國外有關學者應用ELISA方法結合PCR—ELISA法對商品進行調查，在41種 市售商品中就有27種含有過敏原榛果成分而未在標簽中標識。目前國內外對過敏原榛果成分的檢測研究主要集中在ELISA、 PCR—ELISA、 PCR、熒 光PCR及生物傳感器檢測等方面。目前對于過敏原的檢測方法FDA和AOAC共同研究推薦 使用的試劑盒有三種，均為ELISA方法。但如果產品中蛋白質遭到破壞，ELISA方法就檢測 不到。而DNA比蛋白質穩定，PCR方法較ELISA方法更為準確，并且避免了對大量抗體的 需求，歐盟、日本和AOAC都建議使用PCR方法進行確證，但沒有明確特異性的引物序列。 本研究針對榛果成分rCor a 1.0401 DNA序列設計引物及TaqMan探針，建立了運用熒光PCR 技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法。 發明內容針對上述情況，本發明克服了現有技術中的缺點，提供了運用熒光PCR技術檢測食品中 過敏原榛果成分的方法，具體的講就是，外切酶探針熒光PCR技術(Taqman探針法)檢測 食品中過敏原榛果成分的方法。其技術內容包括使用該方法所使用的引物、探針及構建的報告質粒。其中引物、探針 的全部序列如下引物所用引物序列一CCCCGCTGTTTGTGATAT所用弓1物序列二 ATGATAATAAGCGATACTGTGAT探針所用探針序列TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT以及由上述序列衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義 互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。還包括與之配套的熒光PCR反應條件。 本發明是通過以下技術方案實現的(1) 設計特異性寡核苷酸引物、探針，將探針法探針序列三用FAM熒光基團標記，用 于外切酶探針熒光PCR技術檢測；(2) 以探針法引物序列一和探針法引物序列二作為引物，以食品中過敏原榛果成分的相 關基因DNA為模板，進行目的基因的特異性擴增；(3) 擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并將數據傳輸至電腦通過 配套軟件進行分析可以觀察到對食品中過敏原榛果成分進行特異性擴增產生的特定波長的 FAM熒光信號，則證明待測樣品中存在食品中過敏原榛果成分；如沒有觀察到任何一種熒光 信號則證明待測樣品中不存在食品中過敏原榛果成分。本研究所建立的熒光PCR方法，與花生、麥粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等沒有 交叉反應，具有很好的特異性，檢測靈敏度可達到5mg/kg。本發明中熒光PCR反應體系中各組分構成比例如下成分 濃度 加樣量PCR體系預混合物 2倍 25pL探針法所用引物序列一 10nmol/L 2pL探針法所用引物序列二 10pmol/L 2pL探針法所用探針序列一 10pmol/L 1.5pL DNA樣品 5pL雙蒸水 14.5nL總體積 50熒光PCR擴增程序如下(1) 50°C 2分鐘(2) 95°C 10分鐘(3) 95°C15秒(4) 60°C1分鐘(5) 回到第3步，重復45次擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并將數據傳輸至電腦通過配套 軟件進行分析可以觀察到對食品中過敏原榛果成分進行特異性擴增產生的特定波長的FAM 熒光信號，則證明待測樣品中存在食品中過敏原榛果成分；如沒有觀察到任何一種熒光信號 則證明待測樣品中不存在食品中過敏原榛果成分。與現有技術相比，本發明的有益效果是可以檢測由于產品中蛋白質遭到破壞，ELISA 方法不能檢出的食品中過敏原榛果成分。本發明用PCR的方法擴增靶基因，避免了 ELISA 反應的復雜處理過程，節約時間；PCR鑒定方法受到的其他蛋白的干擾較小，較ELISA方法 更為準確。


圖1榛果DNA，熒光信號強度。 圖2榛果添加至巧克力樣品DNA，熒光信號強度。 圖3非榛果的其他堅果DNA，熒光信號強度。
具體實施方式
下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細描述。 實施例1樣本榛果。 l.樣品處理(I )分別取300mg樣品研磨成粉狀，放入1.5 mL離心管中，加入600 pLCTAB緩沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/。鹽酸調pH值至8.0) ，15 (20mg/ml) 蛋白酶K， 65。C溫育30min;加入500 pL酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)混合液強烈振蕩， 離心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min， 棄上清；用200nLTE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)；加等體積氯仿異戊醇(24: 1) 混合液強烈振蕩，離心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心 12000 rpm， 10 min，棄上清；用200 pLTE溶解。溶解的溶液作為樣品重復上述步驟純化DNA。用DNA分析儀檢測其純度及濃度。 2. PCR擴增成分 濃度 加樣量 PCR體系預混合物 2倍 25pL探針法所用引物序列一 1(Himol/L 2pL探針法所用引物序列二 1Opmol/L 2nL探針法所用探針序列一 lOpmol/L 1.5pL DNA樣品 5pL 雙蒸水 14.5nL 總體積 50 nL熒光PCR擴增程序如下(1) 50°C 2分鐘(2) 95'C 10分鐘(3) 95°C 15秒(4) 60°C 1分鐘(5) 回到第3步，重復45次PCR共進行6管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為待測樣品的原濃度DNA樣品; 待測樣品的10'倍稀釋DNA樣品；待測樣品的1(^倍稀釋DNA樣品；待測樣品的103倍稀釋DNA樣品；待測樣品的104倍稀釋DNA樣品；待測樣品的105倍稀釋DNA樣品。 3.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到各濃度樣品分別在28.9、 32.4、 35.4、 37.3、 38.2、 40.28循 環產生了明顯的FAM熒光，結果如圖l。圖1中的各條曲線所代表的FAM熒光強度信號分別是-1. 待測樣品的原濃度DNA樣品；2. 待測樣品的101倍稀釋DNA樣品；3. 待測樣品的102倍稀釋DNA樣品；4. 待測樣品的10M咅稀釋DNA樣品；5. 待測樣品的104倍稀釋DNA樣品；6. 待測樣品的105倍稀釋DNA樣品； 實施例2樣本不含榛果成分的巧克力做添加基質。取l g研磨成糊狀的榛果加入99g巧克力中 4(TC水浴融化，攪拌30min，充分混合均勻。取3 g上述添加榛果的巧克力加入27 g巧克力 中，以此不斷稀釋，最終制成含榛果1000mg/kg、 100mg/kg、 30mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5mg/kg的巧克力。(1)分別取300 mg樣品，放入L5 mL離心管中，加入600 pL CTAB緩沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L, 10。/。鹽酸調pH值至8.0) ,15 [iL (20 mg/ml)蛋白酶K， 65。C 溫育30min;加入500nL酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)混合液強烈振蕩，離心12000rpm15 min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000卬m， 10min，棄上清；用200 nL TE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)；加等體積氯仿異戊醇(24: 1)混合液強烈振蕩，離 心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000卬m， 10min，棄 上清；用200pLTE溶解。溶解的溶液作為樣品重復上述步驟純化DNA。用DNA分析儀檢測其 純度及濃度。l.樣品處理2. PCR擴增成分PCR體系預混合物探針法所用引物序列一探針法所用引物序列二探針法所用探針序列一DNA樣品雙蒸水總體積熒光PCR擴增程序如下濃度 2倍1Ojxmol/L 1Ojxmol/L25pL l早加樣量5pL 14單 50 nL(2) 95'C 10分鐘(3) 95。C 15秒(4) 60°C 1分鐘(5) 回到第3步，重復45次PCR共進行7管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為含榛果成分為1000 mg/kg、 100mg/kg、 30mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5 mg/kg樣品及空白對照。 3.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到各濃度樣品分別在26.5、 31.5、 32.00、 33.88、 34.29、 37.64循環產生了明顯的FAM熒光，結果如圖l。圖1中的各條曲線所代表的FAM熒光強度信號分別是1. 含榛果成分1000 mg/kg巧克力DNA樣品；2. 含榛果成分100 mg/kg巧克力DNA樣品；3. 含榛果成分30 mg/kg巧克力DNA樣品；4. 含榛果成分20 mg/kg巧克力DNA樣品；5. 含榛果成分10 mg/kg巧克力DNA樣品；6. 含榛果成分5 mg/kg巧克力DNA樣品；7. 空白對照； 實驗表明該方法檢測靈敏度達到5 mg/kg。實施例3樣本榛果、麥粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃。1. 樣品處理(1)分別取300mg樣品研磨成粉狀，放入1.5 mL離心管中，加入600 nLCTAB緩沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/o鹽酸調pH值至8.0) ，15 pL (20mg/ml) 蛋白酶K， 65。C溫育30min;加入500^L酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)混合液強烈振蕩， 離心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min， 棄上清；用200pLTE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)；加等體積氯仿異戊醇(24: 1) 混合液強烈振蕩，離心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心 12000 rpm， 10min，棄上清；用200TE溶解。溶解的溶液作為樣品重復上述步驟純化DNA。 用DNA分析儀檢測其純度及濃度。2. PCR擴增成分 濃度 加樣量PCR體系預混合物 2倍 25|aL探針法所用引物序列一 lOpmol/L 2pL探針法所用引物序列
探針法所用探針序列
DNA樣品
雙蒸水
總體積
10拜ol/L
恥
5jjL 14單 50 >iL
熒光PCR擴增程序如下
(1) 50°C 2分鐘
(2) 95°C 10分鐘
(3) 95。C 15秒
(4) 60°C 1分鐘
(5) 回到第3步，重復45次
PCR共進行7管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為待測樣品的原濃度DNA樣品。
3.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到榛果DNA在29.3循環產生了明顯的FAM熒光，結果如圖3。 圖3中的曲線所代表的FAM熒光強度信號分別是待測樣品的原濃度DNA樣品。
實驗表明該方法特異性強。l為原濃度樣品。
序列列表
SEQUENCE USITNG
<110>天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗中心
<120> —種運用熒光PCR技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法
<140> 200910068850.4 <141> 2009-05-15
<160> 3<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA <213>人工合成
<220>
<221> prim一bind
<222> (1)..(18)
<400> 1
ccccgctgtttgtgatat 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA <213>人工合成
<220>
<221> prm一bind<222> (1)"(23)
<400> 2
atgataataagcgatactgtgat 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA <213>人工合成
<220>
<221> prim一bind <222> (1)..(21)
<400> 3
tcccgtttctcgtccctgcggt 2權利要求
1.一種運用熒光PCR技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，其特征在于，一種熒光PCR技術是指外切酶探針熒光PCR技術(TaqMan)探針技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法。
2. 根據權利要求1所述的一種運用熒光PCR技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，其特征在于，外切酶探針熒光PCR技術(TaqMan探針法)檢測榛仁的方法所使用的引物、探針的序列如下引物所用引物序列一CCCCGCTGTTTGTGATAT所用弓I物序列二 ATGATAATAAGCGATACTGTGAT探針所用探針序列TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT
3. 根據權利要求2所設計的引物序列、探針序列，其特征在于，還包括由上述三條引物和探針衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。
4. 根據權利要求1所述的一種運用熒光PCR技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，其特征在于，PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍25 jjL探針法所用引物序列一10,ol/]L2pL探針法所用引物序列二2jjL探針法所用探針序列一10jimol/Lv1.5(iLDNA樣品5jiL雙蒸水14,5|aL總體積50
5.根據權利要求1所述的一種運用熒光PCR技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，其特征在于，PCR方法中擴增程序為(1) 50°C 2分鐘(2) 95" 10分鐘(3) 95°C 15秒(4) 60°C1分鐘(5) 回到第3步，重復45次。
全文摘要
本發明公開了一種運用熒光PCR技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，屬于過敏原檢測技術，特別是指外切酶探針熒光PCR技術(TaqMan)檢測食品中過敏原榛果成分的方法。其技術方案是針對過敏原榛果成分rCor a 1.0401 DNA序列設計引物及TaqMan探針，建立熒光PCR檢測方法。本發明包括設計的榛果成分特異性的引物和探針以及與之配套的熒光PCR反應條件。本方法，與花生、麥粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等沒有交叉反應，具有很好的特異性，檢測靈敏度可達到5mg/kg。本發明所載明的方法可以用于檢測食品中的過敏原，避免使用該類食物導致的過敏反應，具有實際意義。
文檔編號C12Q1/68GK101643787SQ200910068850
公開日2010年2月10日 申請日期2009年5月15日 優先權日2009年5月15日
發明者培 劉, 吳冬雪, 霞 張, 張海濱, 張海英, 王乃福, 穎 陳, 高旗利 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心