檢測花生過敏原用擴增內標、其構建方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測花生過敏原用擴增內標、其構建方法及其應用。該擴增內標基因的序列為SEQIDNO.1所示的堿基序列。這預示了在DNA水平檢測已深加工食品中所含的過敏原物質是可能的。采用本發明的擴增內標進行花生過敏原的PCR檢測具有較高的靈敏度和特異性，可用于實際商品檢測，并能有效排除可能存在的假陰性結果，具有一定的應用價值。
【專利說明】檢測花生過敏原用擴增內標、其構建方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測花生過敏原用擴增內標、其構建方法及其應用。
【背景技術】
[0002]由于食品成分及其加工的復雜性，在DNA提取中殘留的某些雜質成分對PCR擴增可能產生抑制作用，除抑制劑以外，其他原因主要有PCR儀故障、PCR檢測體系不恰當、DNA聚合酶失活以及人為操作失誤等，可能導致PCR檢測出現假陰性結果，這會使得花生過敏患者誤食含有花生成分的食品，造成食品安全問題，危害公眾健康，因而需要絕對避免。在PCR反應體系中加入擴增內標(internal amplification control, IAC)是指示假陰性結果的有效手段之一，近年來已經成為PCR檢測標準化的趨勢。
[0003]擴增內標(InternalAmplification Control, IAC)是添加到 PCR 反應體系中用以指示假陰性現象的一段人工構建的DNA序列。其作用原理是:將擴增內標添加到PCR反應體系中，使之與目標基因序列共同進行擴增，如果在反應體系中存在一些抑制因素，則擴增內標和目的序列的擴增反應都將受到抑制，從而達到指示PCR反應假陰性的目的。從擴增內標與目的序列在擴增時是否存在競爭性的角度，擴增內標可分為兩類:競爭性擴增內標與非競爭性擴增內標。競爭性擴增內標是指在同一 PCR反應體系中與目的基因序列共用同一對引物進行擴增反應的一段基因序列。非競爭性擴增內標則是指在PCR擴增反應中不與目的基因序列共用同一對引物的一段序列。用競爭性擴增內標可以避免在同一 PCR檢測體系中使用多對引物，進而可`以避免引物間的相互作用。

【發明內容】

[0004]本發明的目的之一在于提供一種檢測花生過敏原用擴增內標。
[0005]本發明的目的之二在于提供該擴增內標的構建方法。
[0006]本發明的目的之三在于提供使用該擴增內標在檢測花生過敏原中的應用。
[0007]假陰性是指由于PCR反應體系中存在抑制因素及其他相關原因致使原來應該為陽性的結果卻呈現陰性的現象。擴增內標(Internal Amplification Control, IAC)是添加到PCR反應體系中用以指示假陰性現象的一段人工構建的DNA序列。在PCR反應體系中加入擴增內標是指示假陰性結果的有效手段之一，因為將擴增內標添加到PCR反應體系中，使之與目標基因序列共同進行擴增，如果在反應體系中存在一些抑制因素，則擴增內標和目的序列的擴增反應都將受到抑制，從而達到指示PCR反應假陰性的目的。實驗結果表明，通過復合引物技術構建擴增內標，以及確定擴增內標在PCR體系中的添加量，可以檢測食品中的花生成分。本發明在上述基礎上完成。
[0008]為達到上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種檢測花生過敏原用擴增內標，其特征在于該擴增內標基因的序列為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
[0009]一種構建上述的檢測花生過敏原用擴增內標的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.通過BLAST比對，選擇與花生過敏原Arah I基因同源性較低的單增李斯特菌FSLR2-561基因(NC_017546 )作為內參基因，根據內參基因的序列設計引物，選擇擴增產物比目的片段大150bp~250bp的引物FSL-F/R;所述的花生過敏原Ara h I的基因為:
Ara h 1-F: CTGGAAACCTTGAACTCGT,
Ara h 1-R: GTTGATGGCTACTGGATGA ；
所述的內參基因FSL R2-561的引物序列為:
FSL-F: TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC,
FSL-R: CATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCA ；
b.選取步驟a所得的內參基因的引物FSL-F/R的5’末端的8個堿基與花生過敏原引物Ara hl-F/R的3’末端相連，得到27bp的長引物IAC-F/R，該長引物的序列為:
IAC-F: CTGGAAACCTTGAACTCGTTAGCCAAC,
IAC-R:GTTGATGGCTACTGGATGACATCATTT ；
c.以步驟a所得內參基因FSLR2-561基因為模板，以步驟a所得FSL-F/R為引物，進行PCR擴增，得到351bp的PCR產物；以該PCR產物為模板，步驟b所得長引物IAC-F/R為引物，進行PCR擴增，得到389bp的PCR產物即IAC片段；
d.將步驟c所得IAC片段進行P·CR擴增，將擴增產物進行割膠回收，連接到載體PMD18-T Simple Vector，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，提取質粒，即得到檢測花生過敏原用擴增內標。
[0010]上述的檢測花生過敏原用擴增內標在檢測花生過敏原中的應用。
[0011 ] 所述擴增內標對PCR檢測方法的影響及其靈敏度，首先需通過PCR擴增得到擴增內標的檢測限，接著在花生過敏原PCR檢測體系中分別添加擴增內標檢測限4倍、2倍和I倍的擴增內標，評價擴增內標對花生過敏原PCR檢測方法的影響并確定該方法的靈敏度。因為擴增內標與花生DNA在PCR反應體系中競爭同一對引物，所以需要對擴增內標的添加量進行優化，在確保內標能夠清晰指示假陰性時，盡量選擇較低濃度，使其對PCR方法的靈敏度的影響降到最低。
[0012]所述PCR檢測方法的特異性，以高粱、玉米、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、大豆、豌豆、芝麻、芹菜、番茄、蘋果、梨、蝦、蟹、生蠔、魚、牛奶等常見的動、植物DNA為模板，評價基于擴增內標的花生過敏原PCR檢測方法的特異性。
[0013]本發明基于擴增內標的花生過敏原PCR檢測方法，具有下列優點:
(I)特異性好，不與其他樣品DNA發生交叉反應。本發明基于擴增內標的花生過敏原PCR檢測方法，將常見的動、植物過敏原用于特異性實驗，結果沒有發生交叉反應，只有花生DNA出現了特異性的目的條帶，其他樣品DNA只有內標條帶，說明該方法的特異性好。
[0014](2)靈敏度較高，可以檢測微克級別的花生。本發明基于擴增內標的花生過敏原PCR檢測方法，擴增內標的添加不影響PCR方法的檢測靈敏度，靈敏度實驗表明該PCR方法的靈敏度為0.4叩花生0嫩，相當于4.97 μ g花生，可檢測微克級的花生，說明該方法的靈敏度較高。
[0015](3)結果判定準確、可靠，可有效排除可能存在的假陰性。本發明基于擴增內標的花生過敏原PCR檢測方法，將擴增內標添在至PCR體系中，一方面不影響PCR方法的靈敏度，另一方面，可以有效指示假陰性，提高PCR結果的準確性。應用于實際商品時，有6種商品的PCR擴增受到抑制，通過改進DNA提取方法和對提取DNA進行稀釋處理，有3種商品能夠檢測出花生成分，說明該PCR方法可以有效排除存在的假陰性，提高PCR檢測方法的可靠性，具有一定的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是內參基因為模板，FSL-F/R為引物得到351bp的PCR產物；
圖2是圖1中的PCR產物為模板，長引物IAC-F/R為引物得到的擴增產物；
圖3是IAC構建示意圖；
圖4是IAC的檢測限；
圖5是IAC添加量的選擇；其中A-C圖:IAC的量分別為IAC檢測限的4倍、2倍、I倍；1-6 花生 DNA 依次為 50、10、2、0.4,0.08 (ng)及空白。
[0017]圖6是PCR檢測方法的特異性；1-22分別為花生、高粱、玉米、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、大豆、豌豆、芝麻、芹菜、番茄、蘋果、梨、蝦、蟹、生蠔、魚、牛奶DNA以及空白。
[0018]圖7是PCR檢測方法的應用。其中A圖:1-22依次為花生、餅干-1、餅干-2、餅干_3、餅干-4、餅干-5、餅干-6、餅干-7、餅干-8、飲料-1、飲料_2、飲料_3、飲料-4、飲料-5、飲料_6、粉劑-1、粉劑-2、糖果-1、糖果-2、堅果-1、堅果-2、空白；B圖:1_8依次為花生、餅干_2、餅干_3、飲料-2、飲料-5、堅果-1、堅果_2、空白。
【具體實施方式】
[0019]實施例1利用復合引物技術構建擴增內標 (O內參基因的選擇及引物設計
通過BLAST比對，選擇與花生過敏原Ara h I基因同源性較低的單增李斯特菌FSLR2-561基因(NC_017546)作為內參基因，根據內參基因的序列，用Primer 5.0設計引物，選擇擴增產物比目的片段大200bp左右的引物FSL-F/R。花生過敏原Ara h I和內參基因 FSL R2-561 的引物序列分別為 Ara h 1-F, CTGGAAACCTTGAACTCGT, Ara h 1-R,GTTGATGGC-
TACTGGATGA ;FSL_F, TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC, FSL-R, CATCATTTAGCGTGA-
CTTTCTTTCA。
[0020](2)長引物的獲得
選取內參基因FSL R2-561的引物FSL-F/R的5’末端的8個堿基與花生過敏原引物Arah 1-F/R的3’末端相連，得到27bp的長引物IAC-F/R，引物序列為IAC-F，CTGGAAACCTTG-AACTCGTTAGCCAAC.1AC-R, GTTGATGGCTACTGGATGACATCATTT。
[0021](3) IAC片段的獲得
以內參基因為模板，FSL-F/R為引物，進行PCR擴增，得到351bp的PCR產物(圖1);以該PCR產物為模板，長引物IAC-F/R為引物，進行PCR擴增，得到389bp的PCR產物即IAC片段(圖2)。IAC片段構建示意圖見圖3。
[0022](4) IAC質粒的構建
將上述IAC片段的PCR產物進行割膠回收，連接到載體pMD18-T Simple Vector，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，提取質粒，用ND-1OOO微量分光光度計測定IAC質粒的純度和濃度，結果OD260/280為1.88，濃度為160.9 ng/μ L，測序驗證，_20°C備用。該擴增內標基因的序列為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
[0023]實施例2擴增內標對PCR檢測方法的影響及其靈敏度 (1) IAC檢測限的確定
根據IAC拷貝數計算公式:IAC拷貝數=摩爾數(mol)X(6.02X 1023 copies/mol)，其中摩爾數=質量/內標重組質粒分子量(1.92 X IO6 g/mol),計算IAC的拷貝數,將IAC質粒10倍梯度稀釋(7.85X IO4~7.85 copies/μ L)，分別取2 μ L進行PCR擴增(圖4)。由圖4可以看出，IAC的檢測限為1.57X IO2 copies/PCR。
[0024](2) IAC對PCR檢測方法的影響及其靈敏度
IAC添加量的選擇應遵循以下原則，在確保內標能夠清晰地指示假陰性的同時，應盡量選擇較低濃度，使其對檢測靈敏度的影響降到最低。分別設置內標添加量為內標檢測限的I倍，2倍和4倍觀察其對靈敏度的影響(圖5)。由圖5可以看出，當IAC添加量為IAC檢測限的2倍時，不影響花生過敏原的檢測靈敏度(預實驗結果顯示花生過敏原PCR方法的靈敏度為0.4 ng)，且IAC的PCR產物清晰可見。因此，選擇IAC檢測限的2倍即3.14X IO2copies/PCR作為內標的添加量。
[0025]實施例3 PCR檢測方法的特異性
以高粱、玉米、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、大豆、豌豆、芝麻、芹菜、番茄、蘋果、梨、蝦、蟹、生蠔、魚、牛奶等常見的動、植物DNA為模板，花生過敏原特異性引物Ara h 1-F/R為引物進行PCR擴增(圖6)。由圖6可以看出，只有花生DNA擴增出了 179 bp的目的條帶，其他20種常見動、植物DNA只能擴增出內標條帶，說明該PCR方法的特異性良好。
[0026]實施例4 PCR檢測方法的應用
利用上述建立的基于擴增內標的花生過敏原PCR檢測方法對20種含有或可能含有花生成分的市售加工食品進行檢測。結果見圖7。由圖7-A可知，有7種食品的PCR擴增受到抑制，其他14種商品的檢測結果與食品包裝一致；將6種受抑制的商品DNA經過改用試劑盒法重新提取DNA和稀釋處理后，得到如圖7-B所示的結果。由圖7-B可知，3種食品檢出為陽性，3種為陰性，說明該PCR方法可有效排除可能存在的假陰性結果，提高檢測的可靠性。
[0027]含擴增內標的PCR方法檢測花生過敏原的具體過程如下:
(1)從超市購買花生、高粱、玉米、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、大豆、豌豆、芝麻、芹菜、番茄、蘋果、梨、蝦、蟹、生蠔、魚和牛奶原料以及其他20種含有或可能含有花生的食品。用CTAB法和深加工食品DNA提取試劑盒提取上述樣品DNA。
[0028](2)含擴增內標的PCR方法檢測花生過敏原
1)在0.5 mL的EP管中配制PCR反應體系，總體系20 μ L:2 μ L樣品DNA模板(10ng) ,2 μ L 擴增內標(1.57 X IO2 copies/μ L), 2 μ L IOXBuffer (Mg2+ plus) ,3.2 μ LdNTP (2.5 mM), 0.2 μ L rTaq 酶(5 U/μ L)，I μ L Ara h 1-F/R 引物(each 3 μ Μ)，ddH20補齊至20 μ L0
[0029]2)將上述EP管放入PCR儀中進行PCR反應，具體反應條件:94°C預變性3 min，接著反應35個循環，每個循環包括94°C變性30 s，59°C退火30 s，72°C延伸20 S，循環結束后，72°C延伸 10 min。
[0030]3) PCR結束后，取出EP管，對EP管中的PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用GIS-1000凝膠成像系統分析結果。 [0031](3)結果判定:若能觀察到179bp的花生目的條帶和389bp的擴增內標條帶，則說明樣品中含有花生成分；若只能觀察到179bp的花生目的條帶，也說明樣品中含有花生成分；若只能觀察到389bp的擴增內標條帶，則說明樣品中含有花生成分；若不能觀察到任何條帶，則說明PCR反應受到抑制。
【權利要求】
1.一種檢測花生過敏原用擴增內標，其特征在于該擴增內標基因的序列為SEQ IDN0.1所不的喊基序列。
2.—種構建根據權利要求1所述的檢測花生過敏原用擴增內標的方法，其特征在于該方法的具體步驟為: a.通過BLAST比對，選擇與花生過敏原Arah I基因同源性較低的單增李斯特菌FSLR2-561基因(NC_017546 )作為內參基因，根據內參基因的序列設計引物，選擇擴增產物比目的片段大150bp~250bp的引物FSL-F/R;所述的花生過敏原Ara h I的基因為:
Ara h 1-F: CTGGAAACCTTGAACTCGT,
Ara h 1-R:GTTGATGGCTACTGGATGA ； 所述的內參基因FSL R2-561的引物序列為:
FSL-F: TAGCCAACCGATGTTTCTGTATC,
FSL-R: CATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCA ； b.選取步驟a所得的內參基因的引物FSL-F/R的5’末端的8個堿基與花生過敏原引物Ara h 1-F/R的3’末端相連，得到27bp的長引物IAC-F/R，該長引物的序列為:
IAC-F:CTGGAAACCTTGAACTCGTTAGCCAAC，
IAC-R:GTTGATGGCTACTGGATGACATCATTT ； c.以步驟a所得內參基因FSLR2-561基因為模板，以步驟a所得FSL-F/R為引物，進行PCR擴增，得到351bp的PCR產物；以該PCR產物為模板，步驟b所得長引物IAC-F/R為引物，進行PCR擴增，得到389bp的PCR產物即IAC片段； d.將步驟c所得IAC片段進行PCR擴增，將擴增產物進行割膠回收，連接到載體PMD18-T Simple Vector，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，提取質粒，即得到檢測花生過敏原用擴增內標。
3.一種根據權利要 求1所述的檢測花生過敏原用擴增內標在檢測花生過敏原中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103589790SQ201310505536
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】蔡琴, 陳沁 , 張文舉, 關瀟, 鄧志瑞 申請人:上海大學