專利名稱：一種利用白樺懸浮培養生產齊墩果酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物—i:程領域，具體涉及一種由懸浮法培養內樺而生產齊墩果酸的方法。
背景技術：
早在《本草綱S》中有記載，曄樹皮可用于黃疸、乳痛、疥瘡等疾病的治療。在R間樺樹皮還用f-治 療慢性痢疾及淸熱解毒、.ih咳、平喘等。隨著研究發現，樺樹皮的主要藥用成分是次生代謝類二萜物質，
以白樺酯醇含量最為豐富，占樹皮干重15~35%左右。許多研究都證實白樺三萜可抑制直腸癌、肺癌、白 血病、淋巴癌、前列腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞生長(Zhukova, 2005)。而齊墩果酸是白樺三萜的一種組 成成分，具有降低谷丙轉氨酶，促進細胞再生，防止肝硬化，抗炎和強心作用，是治疔肝炎的有效成分， 近年乂證明其具有一定的降糖、消炎、抗氧化、抗癌活性，且毐副作用小，安全性高，有廣闊的臨床應用 前景，因此受到廣泛關注。目前，以小花清風藤、木瓜、女貞子等為原料提取齊墩果酸的研究已有報道， 但利用fl樺細胞培養生產齊墩果酸的研究還未見報道。
以細胞全能性為基礎建立起來的植物細胞培養技術為植物藥生產提供了一條新途徑。由于利用植物細 胞培養法生產植物天然活性物質具有不受氣候、病蟲害等自然條件的影響，而且不占用土地,不消耗自然 資源，生產周期短和人為可控等優點，因而被認為是解決植物藥生產與天然植物資源可持續發展之間矛盾 的一種新型生物技術。研究表明，通過細胞培養方法獲得的次生代謝物質含量遠遠高于植物本身，如完整 植株至少需2 3年時間才可使紫草素含量達1 2% (干重)，而細胞培養僅需二周時間即可使細胞中紫草 素含量達14%。截止S前為止，已有300多種植物，超過600種的植物藥物來自細胞培養，包括紫草素， 人參皂苷，喜樹堿，紫杉醇，甘草皂苷等。日本mtsui公司通過對紫草細胞培養生產尚無法人T合成的 紫草素，培養細胞產率為天然細胞產率1000倍，現在日本紫草來源主要是細胞組織培養，另外雷公藤， 人參皂甘等許多植物次生代謝產物在生產上均已取得較人的成績，有的培養規模上萬噸，并巳進行了工業 化生產。這些試驗及實踐均證明植物細胞不僅具有構成一個完整植株的全部遺傳信息，、同時，在生化特征 上,也具有其親本植株產生次生代謝產物的遺傳基礎和生理功能。雖然有白樺葉和懸浮培養細胞中含達瑪 烷的報道(2003)，但目前尚未見能夠使用來自白樺無菌苗誘導的愈傷組織和懸浮培養細胞進行合成齊墩 果酸的報道。

發明內容
以成年白樺一年生枝休眠芽、展葉芽以及種子為外植體，按常規方法經消毒滅菌和固體培養誘導愈傷 組織，選取黃綠松散愈傷組織，在B5培養基中進行懸浮培養，培養激素為0.1 0.4mg/L6-BA和0.01 0. lmg/LTDZ。愈傷組織搗碎，接入250mL二角瓶，其中裝有培養基100mL，接種量為3g 5g,置于旋轉搖床中震蕩培養，轉速120rpm/min，培養基均以12rC高壓滅菌，i爭養溫度為24 26°C ，光照強度1000 1500 Lx,光/暗周期16h/8h，濕度60% 70%，每15天繼代培養一次，增殖倍數達到4 8倍。進一步根據 細胞團生長量和齊墩果酸含量選出高產白樺懸浮培養細胞系，多次繼代穩定后通過高效液相色譜法檢測齊 墩果酸含量可達到0.2]7 0.714mg/g (干重)。為解決齊墩果酸類抗腫瘤大然藥物來源緊缺，加速臨床大規 模應用，提供-種新方法。
技術方案
以成年白樺一年生枝休眠芽、展葉芽以及種子為誘導組培苗的外植體，經表面消毒，接祌丁-
WPM+1.0mg/L 6-BA培養基進行閂杵新.培苗的誘導及繼代培養，取生長30大左右的節.培苗，將莖段和葉 片切成lcm左右,接種于白樺愈傷組織誘導培養基IS上，進行白樺愈傷組織誘導，選擇細胞生長速度快， 松散的愈傷組織，接種在B5培養基中進行懸浮培養將愈傷組織搗碎，接入250mL二角瓶，其中裝有培 養基100mL，接種量為3g 5g,置于旋轉搖床中震蕩培養，轉速120rpm/min，培養基均以12rC高壓滅菌, 培養溫度為24 26°C ，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60% 70%，每15天繼代培養一 次，獲得穩定生產齊墩果酸的懸浮細胞系，經過濾，烘干，粉碎，有機溶劑(95%乙醇)提取等步驟，利 用液相色譜方法對齊墩果酸檢測和定量分析。
本專利具有以下優點
1) 生產環境不受地域、季節、水質、病蟲害、氣候等t]然環境的影響。
2) 生產周期短，生產過程不產生大量廢渣廢水，安全無污染，具有生態效益。
3) 培養的白樺懸浮細胞具有生產齊墩果酸物質的能力，實現了白樺天然植物資源及其藥用成分的開發 利用。
4) 該發明生產的白樺懸浮細胞， 一個繼代周期為15天，平均細胞增長4 8倍左右， 一批細胞年繼代 至少20次。如能進入規模化生產，以原始細胞lkg計算，僅以齊墩果酸總產量100kg/年，lg齊墩 果酸100元人民幣計算，其價值也是相當可觀的。
5) 為解決抗肝病、抗腫瘤天然藥物來源緊缺，加速臨床大規模應用，提供一種新途徑，具有很高的經 濟效益和社會效益。
具體實施方式
1)材料來源
取自東北林業大學白樺強化種子園成年白樺的1年生枝的休眠芽和展葉芽以及種子。 2)外植體的表面消毒
4(1) 休眠芽經流水沖洗后，在709i乙醇中浸泡5min。在超凈工作臺上剝去外層芽鱗，僅剩2 3mm 長的芽尖，基部連帶1 2mm長的莖段。放到70%乙醇中30s，再在10%次氯酸鈣上淸液中消毒10min， 無菌水漂洗3 5遍，接種到初始培養基上。
(2) 展葉芽剝掉外層綠葉，取出嫩芽(3 5mm長)放到70%乙醇中30s，再在10%次氯酸鈣上清 液中消毒10rain，無菌水漂洗3 5遍，接種到初始培養基上。
(3) 種子先用無菌水浸泡48h，然后在70%乙醇中浸泡10min， 10%次氯酸鈣中消毒20min，最后 無菌水漂洗3 5遍，接種到初始培養基上。
初始培養基和繼代培養基為WPM培養基，附加1.0mg/L 6-BA。 100mL三角瓶，裝60mL WPM培 養基+6-BAlmg/L,每瓶置3個外植體。接種初期(培養2 3d)時有輕微褐變， 一般換一次新鮮培養 基就可消除褐變。此后篩選壯苗，每25d繼代一次，具體是以lcrn長帶葉芽的莖段或帶嫩葉的組培苗 頂端部分插于培養基中，每瓶3 5株。培養基用1 mol/L NaOH或HC1調至pH為6. 0 6. 5， 121'C高 壓滅菌20min，培養溫度22 25'C，光/暗周期16h/8h,光照強度1000 1500 Lx，濕度60% 70%。
3) 愈傷組織誘導與繼代
選擇生長狀態良好的白樺組培苗，在超凈工作臺上取其莖段和葉片切成lcm左右，去掉莖段上的 葉片及側芽，每瓶三個莖段或葉片進行誘導愈傷組織。A樺愈傷組織誘導與繼代培養基為IS， 20g/L 蔗糖、5.3g/L瓊脂粉,pH值為6.0 6.5， lOOtnL三角瓶，裝60mL培養基。每25d繼代一次，細胞變得 松散，進行懸浮培養。培養基均以12rC高壓滅菌，培養溫度為24 26°C，光照強度1000 1500 Lx,光 /暗周期16h/8h，濕度60% 70%。
4) 懸浮細胞培養方法:
選擇生長速度快，形態松散，顏色黃綠的愈傷組織在B5培養基+0. 1 0.4mg/L6-BA和0.01 0. lmg/L TDZ培養基中進行懸浮培養。在超凈工作臺上，將愈傷組織用無菌手術刀和鑷子挾碎，接入 250mL二角瓶，其中裝有培養基100mL，接種量為3g 5g。置于旋轉搖床中震蕩培養，轉速120rpm/min, 培養基均以12rC高壓滅菌,培養溫度為24 26'C，光照強度1000 1500 Lx，光/暗周期16h/8h，濕 度60% 70%。
將最初接種的愈傷組織分別進行懸浮培養，15天繼代一次。每次繼代前，將較大的細胞團取出， 用鑷子鋏碎，過篩，在愈傷組織誘導培養基上繼代培養，以保存細胞，其余單細胞和小細胞團，按3g 5g/100ml的接種量分裝在含新鮮B5培養基的培養瓶，多次繼代后，篩選高產懸浮細胞系。分別按最初 愈傷組織無性系收獲細胞團，6(TC烘干至恒重，粉碎后，使用液相色譜方法測定細胞中齊墩果酸含量。 4)液相色譜測定齊墩果酸的方法
準確稱取0.2g干燥的白樺細胞樣品，將其直接加到5mL離心管中，并加入4mL 95%的分析乙醇， 常溫過夜浸提12h，然后在強度為10kHz下超聲時間40min，取上清液，并將其用0. 45um濾膜過濾作為樣品檢測液。液相色譜檢測條件色譜柱HiQsilC18V4.6mmX250mm;流動相乙腈(乙腈8:水2);柱溫25'C;靈敏度16AUFS;流速l. OmL/min;檢測波長210nm,進樣10uL。檢測獲得的白樺懸浮培養細胞中齊墩果酸含量可達到0.217 0.714mg/g。
實例1
在實驗室小試培養中，按本發明獲得的白樺組培苗切成糸—段lcm左右，3個材料接種愈傷組織誘導培養基IS培養基中。蔗糖20g/L，瓊脂5. 3g/L，調節PH值6. 0 6. 5左右，分裝于100ml 二角瓶中，每瓶60ml。塑料封口膜封口后，進行高壓消毒，壓力為1. 0-1. 2Kg/cm2，時間為20min。 一個月后每瓶愈傷組織生長量可達10g左右。25天繼代一次，獲得松散的易于懸浮培養的細胞，懸浮培養基配方按本發明方法配制，培養基分裝在250mL三角瓶中，接種量3g 5g/100mL,在搖床上培養，轉速120轉Anin，光照16小時/天，溫度25'C，培養15天后每瓶細胞鮮重可達15 20g，將大塊愈傷組織挑出，破碎后在愈傷組織誘導培養基中培養或繼續進行懸浮培養。再繼代接種量3g 5g/100mL，接種于新鮮液體培養基中繼續培養，培養15大后可獲得鮮細胞總量75 100g左右，如需要可繼續擴人培養，此時可收獲一部分懸浮培養細胞，烘干，粉碎，稱量，95%乙醇過夜浸提，0.45uM微膜過濾。色譜柱HiQsil C18V 4.6mmX250mni;流動相乙腈(乙腈8:水2);柱溫25。C;靈敏度16AUFS;流速1. OraL/min;檢測波長210nm,進樣10uL。檢測獲得的白樺懸浮培養細胞中齊墩果酸含量。


圖l白樺懸浮培養細胞團
權利要求
1、一種通過白樺懸浮培養生產齊墩果酸的方法，其特征在于包括以下步驟1)通過常規方法培養獲得白樺愈傷組織；2)將愈傷組織在B5懸浮培養基上培養。pH6.5，250mL三角瓶，裝100mL培養基，121℃高壓蒸汽滅菌20min。旋轉搖床中震蕩培養，每個懸浮培養繼代周期后，培養物過篩，將單細胞和小細胞團，分裝在含新鮮液體培養基的培養瓶中繼續培養獲得懸浮細胞系；3)高效液相法檢測齊墩果酸含量。
2、 根據權利要求書1所述的方法，其特征在丁'接種量為3g 5g/100n]L，轉速120rpm/min，培養溫度為24 26°C，光照強度1000 1500 Lx，光/暗周期為16h/8h,濕度60% 70%。
3、 根據權利要求書1所述的方法，其特征在于添加的激素為0. 1 0. 4 mg/L6-BA和0. 01 0. lmg/L TDZ。
4、 根據權利要求書l所述的方法，其特征在于懸浮細胞系接種后15天收獲。
5、 根據權利要求書1所述的方法，其特征在于懸浮細胞系多次繼代后，平均細胞增殖仍達到4 8倍，齊 墩果酸含量可達到0. 217 0. 714mg/g (干重)。
全文摘要
一種利用白樺懸浮培養生產齊墩果酸的方法。該方法是以白樺成樹一年生枝休眠芽、展葉芽和種子為材料，接種于WPM+6-BA 1mg/L培養基中獲得白樺無菌苗，再以無菌苗莖段和葉片為外植體，在培養基IS上誘導獲得穩定、快速生長的愈傷組織，最后在B5培養基，激素為0.1～0.4mg/L6-BA和0.01～0.1mg/L TDZ的培養基中進行懸浮細胞系的培養，蔗糖為20g/L，pH值為6.0～6.5，接種量鮮重為30～50g/L。23～25℃，110～130轉/min，光照8～10h/d，光照強度1400～1700Lx，15天繼代1次，多次繼代培養后獲得穩定的白樺懸浮培養細胞系。經高效液相色譜法檢測，獲得的白樺懇浮培養細胞中齊墩果酸含量可達到0.217～0.714mg/g(干重)。本發明是第一次在白樺植物中通過細胞工程方法生產齊墩果酸，此方法周期短，成本低，能節省大量人力、物力、提高勞動生產率，為解決天然植物藥物來源緊缺和工業化大規模生產齊墩果酸藥物提供了一種新途徑。
文檔編號C12N5/04GK101475929SQ20091007129
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月19日 優先權日2009年1月19日
發明者靜 尹, 曾凡鎖, 博 王, 由香玲, 范桂枝, 詹亞光, 齊鳳慧 申請人:東北林業大學;詹亞光