專利名稱：哲羅鮭微衛星序列與多態性微衛星標記的獲取方法和哲羅鮭多態性微衛星標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微衛星序列與多態性微衛星標記的獲取方法和多態性微衛星標記。
背景技術：
哲羅鮭是我國土著的珍稀名貴的魚類，是鮭科魚類中體型最大的魚類。由于環境惡化及過度捕撈等因素，其目前的資源量已十分稀少、瀕臨滅絕；因此，1998年哲羅鮭被列入《中國瀕危動物紅皮書(魚類)》，2004年被列入《中國物種紅色名錄》。哲羅鮭同時也是一種優良的冷水性養殖魚類，其具有生長快速、抗逆性強的特點，目前已成功進行了野生哲羅鮭的人工馴養，并在此基礎上成功開展了規模化繁殖和養殖。但由于其自殘嚴重、不耐高溫、不耐低氧及在北方地區低溫季節(如冬春季水溫在1(TC以下季節)生長緩慢等特性，限制了哲羅鮭的養殖區域及養殖產量，增加了養殖成本，因此有必要對目前人工馴養的哲羅鮭進行進一步選育。 隨著生物技術領域的發展，分子標記已在物種的保護遺傳學、進化遺傳學及魚類的選擇育種中得到充足的發展，尤其是在動物的選擇育種上的應用，大大促進了分子標記輔助選擇技術的進步，在魚類中成功的就有羅非魚催乳素基因對耐鹽性狀的選擇(專利號ZL 02821303. 3)。哲羅鮭作為瀕危物種及優良的養殖種類，而可利用的分子標記數量卻十分有限，目前Genbank中收錄的哲羅鮭的核酸序列僅270多條，其中有153條為本發明發明人所在實驗室提交的微衛星序列，其余大部分為哲羅鮭的線粒體部分基因序列，可利用的微衛星分子標記僅十幾個，因此開發哲羅鮭的微衛星標記對這一物種進行保護遺傳學、進化遺傳學的研究是十分必要的，同時也為哲羅鮭的分子標記輔助選擇提供充足的分子標記。 微衛星是基因組中由1 6個核苷酸組成的短串聯重復3 6次以上的DNA序列，利用重復序列兩側的保守序列設計引物，以此開發微衛星標記(微衛星標記由微衛星序列和微衛星序列引物兩部分組成)。由于微衛星標記多態性程度高且共顯性遺傳，通過它計算雜合度可以較好地反映群體內的變異，因此微衛星標記對于遺傳學研究是十分重要的。微衛星標記的開發可以分為3步一、從基因組中克隆或分離出含有短串聯重復的DNA序列，即微衛星序列；二、在微衛星序列的兩側保守序列中設計PCR擴增的引物；三、采用合適的方法鑒定所設計引物的多態性。目前微衛星標記的開發費時費力，主要困難集中在微衛星序列的獲得、引物設計及引物PCR擴增條件的優化上。微衛星序列的分離或克隆現有多種方法，如小片段基因組文庫的雜交篩選、FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences)、磁珠富集法等，由于磁珠富集法具有陽性克隆率及微衛星序列的得率較高的特點，所以目前被廣為應用，但該方法需采用同位素(缺點具有放射性)或生物素二次雜交(缺點毒性較大)技術，增加了微衛星序列分離的風險和成本，所以在使用中具有局限性。

發明內容
本發明的目的是為了解決目前采用磁珠富集法分離或克隆微衛星序列存在放射性或毒性較大，增加了微衛星序列分離的風險和成本的問題，而提供的一種哲羅鮭微衛星序列與多態性微衛星標記的獲取方法和哲羅鮭多態性微衛星標記。 本發明哲羅鮭微衛星序列按以下步驟獲得一、提取哲羅鮭基因組DNA;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛星富集文庫的構建；三、菌落PCR擴增并進行陽性克隆檢測和測序，即獲得哲羅鮭微衛星序列。 本發明哲羅鮭多態性微衛星標記按以下步驟獲得一、提取哲羅鮭基因組DNA;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛星富集文庫的構建；三、菌落PCR擴增并進行陽性克隆檢測和測序，獲得哲羅鮭微衛星序列；四、對哲羅鮭微衛星序列進行分析和引物設計；五、微衛星序列引物多態性鑒定，獲得具有哲羅鮭多態性微衛星序列及其引物。
本發明哲羅鮭多態性微衛星標記共7對； 微衛星標記HtaCa69的序列如SEQ ID NO : 1所示，其正向引物序列為
5' -GCAGGCTCTCGCACTAACA-3'，反向引物序列為5' -CTGTCCCATTTGATGTCTGATAA-3'; 微衛星標記HtaCalOl的序列如SEQ ID NO :2所示，其正向引物序列為
5' -GTCGTTTGCCTCACCTCATA-3'，反向引物序列為5' -CGTTACAGCCACATTCCTACAA-3'; 微衛星標記HtaCal09的序列如SEQ ID NO :7所示，其正向引物序列為
5' -AGGGGATTCGGCTATTTCAC-3'，反向引物序列為5' -CCTCTCATTGTGTTGGAGCA-3'; 微衛星標記HtaCal72的序列如SEQ ID NO :3所示，其正向引物序列為
5' -AACCGTCCCCTAACCCAAT-3'，反向引物序列為5' -TGCTTACCTCTCCCCAAAGT-3'; 微衛星標記HtaCal83的序列如SEQ ID NO :4所示，其正向引物序列為
5' -TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3'，反向引物序列為5' -GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3'; 微衛星標記HtaCal85的序列如SEQ ID NO :5所示，其正向引物序列為
5' -GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3'，反向引物序列為5' -TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3'; 微衛星標記HtaCa203的序列如SEQ ID NO :6所示，其正向引物序列為
5' -AGCGGAAATAGCAGGAGGTT-3'，反向引物序列為5' -GAATACCACAGCCCAGCATT-3'。 本發明哲羅鮭微衛星序列的獲取方法可以快速、方便的獲得哲羅鮭微衛星序列；
本發明哲羅鮭多態性微衛星標記的獲取方法可以快速、方便的獲得哲羅鮭多態性微衛星標記。 本發明方法中結合了 FIASCO和磁珠富集法的優點，同時避免了磁珠富集法中放射性同位素或生物素二次雜交鑒定陽性克隆所帶來的風險，具有成本低、安全性高的優點。本發明方法所獲的生物材料可用于哲羅鮭的保護遺傳學、親緣關系分析、連鎖圖譜構建及養殖群體的遺傳管理。


圖1是具體實施方式
十二中選用限制性內切酶Tru9I和Tsp509I進行酶切，酶切片段連接后步驟二 c回收的長度為500 900bp的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2是具體實施方式
十二中限制性內切酶Sau3AI的酶切片段和生物素標記的(CA)w寡核苷酸探針構建的微衛星富集文庫的菌落PCR電泳圖。圖3是具體實施方式
十二中限制性內切酶Tsp5091的酶切片段和生物素標記的(CA)w寡核苷酸探針構建的微衛星富集文庫的菌落 PCR電泳圖。圖4是具體實施方式
十二中限制性內切酶Tru9I的酶切片段和生物素標記的 (CA)16寡核苷酸探針構建的微衛星富集文庫的菌落PCR電泳圖。圖5是具體實施方式
十二 中限制性內切酶CviQI的酶切片段和生物素標記的(CA)w寡核苷酸探針構建的微衛星富集 文庫的菌落PCR電泳圖。圖6是具體實施方式
十二中限制性內切酶Bfal的酶切片段和生 物素標記的(CA)w寡核苷酸探針構建的微衛星富集文庫的菌落PCR電泳圖。圖7是具體實 施方式十二中限制性內切酶TaqI的酶切片段和生物素標記的(CA)w寡核苷酸探針構建的 微衛星富集文庫的菌落PCR電泳圖。圖8是具體實施方式
十二中限制性內切酶Sau3AI的 酶切片段和生物素標記的(CAG)w寡核苷酸探針構建的微衛星富集文庫的菌落PCR電泳圖。 圖9是具體實施方式
十三中微衛星標記為HtaCalOl的檢測結果圖。圖10是具體實施方式
十三中微衛星標記為HtaCa69的檢測結果圖。圖11是具體實施方式
十三中微衛星標記為 HtaCal72的檢測結果圖。圖12是具體實施方式
十三中微衛星標記為HtaCal83的檢測結果 圖。圖13是具體實施方式
十三中微衛星標記為HtaCal85的檢測結果圖。圖14是具體實 施方式十三中微衛星標記為HtaCa203的檢測結果圖。圖15是具體實施方式
十三中微衛星 標記為HtaCal09的檢測結果圖。
具體實施例方式
本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一 本實施方式哲羅鮭微衛星序列按以下步驟獲得一、提取哲羅 鮭基因組DNA;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛星富集文庫的構建；三、菌落PCR擴增并 進行陽性克隆檢測和測序，即獲得哲羅鮭微衛星序列。 具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中采用限制 性內切酶單酶切或雙酶切哲羅鮭基因組DNA。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟二分以下步驟 實現 a、哲羅鮭基因組DNA的酶切 哲羅鮭基因組DNA酶切體系為20iiL，由2iiL 10 X酶切buffer、0. 2 ii L濃度為 10ng/ ii L的BSA、2. 5U限制性內切酶、5 y L濃度為100ng/ y L的哲羅鮭基因組DNA和余量 的滅菌去離子水組成；酶切孵育時間為4h ;
b、連接 連接體系為40 ii L，由20 ii L步驟a酶切片段、2 ii L粘末端雙鏈接頭、 4 ii L10Xbuffer、6weiss單位T4DNA連接酶和余量的滅菌去離子水組成，并于4。C水浴中過 夜連接；其中雙鏈接頭按以下步驟制備等體積混合濃度均為10pmol/L的單鏈寡核苷酸連 接頭A和單鏈寡核苷酸連接頭B， 95t:變性10min，然后經過4h勻速冷卻至l(TC ，即得到雙 鏈接頭； c、目的片段獲取 用單鏈寡核苷酸連接頭A做擴增引物進行擴增，擴增反應體系為25 ii L，由3 ii L步 驟b連接產物、1. 5ii L引物、2. 5ii L 10XBuffer、1. 5ii L濃度為25mmol/L的MgCl2、2 ii L濃度為2. 5mmol/L的dNTP、0. 3 y L濃度為5U/ y L的Taq酶和余量的無菌超純水組成；擴增反 應程序為72°C 2min，94t:預變性5min，循環設置為94t:變性30s、53t:退火30s、72。C延伸 lmin，共14 20個循環，72t:延伸10min ;擴增產物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測， 用Promega PCR產物回收試劑盒切膠回收長度為500 900bp的DNA片段；
d、微衛星富集文庫的構建
1、雜交取12iiL步驟c回收的DNA片段置于95t:環境中變性10min，然后立即加入到 68°C 、體積為38 ii L的雜交液中雜交lh后得到雜交DNA ;其中38 y L的雜交液由1. 5 y L濃 度為10 ii mol/L的生物素標記的含有重復序列的探針、5 ii L濃度為10pmol/L的單鏈寡核苷 酸連接頭A，15iiL 20XSSC，0. 5ii L質量濃度為10X的SDS和16 y L ddH20組成；
n、平衡磁珠 在1. OmL離心管中加入100 y L鏈霉親和素磁珠和200 y L洗液C洗滌2次，然后將 離心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，棄除上清液，再用200 y L洗液D洗滌磁珠3 5次，之后加入150 y L洗液D室溫放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值為8. 0的EDTA的 濃度為lmmol/L、pH值為8. 0的Tris-Cl的濃度為10mmol/L、NaCl的濃度為2mmol/L ;洗液 D是用6 X SSC液稀釋的質量濃度為0. 1 %的SDS溶液；
ni、親和捕捉 將步驟I得到的雜交DNA加入步驟II平衡磁珠中25t:溫浴20min，然后去除上清 液，再用洗液D 25t:洗滌磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68。C洗滌磁珠2次，再用洗液 F洗滌磁珠2次，而后用200 ii L 0. 1 X TE洗滌磁珠2次，再加入30 y L 0. 1 X TE在95。C變 性10min，然后收集上清液，即得到含有重復序列的單鏈DNA片段；其中洗液E是用3XSSC 液稀釋的質量濃度為0. 1 %的SDS溶液，洗液F為6 X SSC液；
IV、 PCR擴增含有微衛星序列的DNA片段 PCR反應體系為25ii L，由內含4種dNTP的混合PCR緩沖液18ii L、單鏈寡核苷酸連 接頭A為引物0. 5 ii L、T叫DNA聚合酶0. 5 y L，步驟III收集的上清液4 y L和余量的無菌 水組成；PCR擴增反應程序為94t:預變性5min，循環設置為94。C變性30s、53。C退火30s、 72t:延伸lmin，共20 30個循環，72t:延伸10min，用Promega PCR產物回收試劑盒純化 回收，去除多余的引物、dNTP和接頭；
V、T-載體連接及克隆 T-載體連接反應體系為10 ii L，由5 ii L T-載體商業包裝中2 X連接緩沖液、1 y L 載體pMD18-T vector和4 y L步驟IV純化回收的DNA片段組成；同時以T載體自身連接作 為對照，4t:連接過夜；再用CaCl2制備的感受態大腸桿菌DH5a進行轉化，得到基因組微衛 星富集文庫，并將文庫中的單菌落轉移培養平板中按順序排列。其它步驟及參數與實施方 式二相同。 本實施方式內切酶從NEB公司購買。酶切孵育溫度參見限制性內切酶使用說明。
T4DNA連接酶購自于美國Promega公司。pMD18-T vector購自于寶生物工程(大 連)有限公司(大連TaKaRa公司)。感受態大腸桿菌DH5 a購自于蓋寧生物科技(北京) 有限公司。 本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態細胞和質粒等均容易購得，若無特殊
9要求則濃度為產品標注濃度。本實施方式中未注明的操作步驟參見試劑使用說明。
本實施方式步驟dill中25t:溫浴使生物素和鏈霉親和素結合。
本實施方式步驟dV中連接緩沖液中包含連接酶。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟二 d I中生 物素標記的含有重復序列的探針為生物素標記的(CA)w寡核苷酸探針或生物素標記的 (CAG)16寡核苷酸探針。其它步驟及參數與實施方式三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同點是步驟二 a中限制性 內切酶為限制性內切酶Tsp509I、限制性內切酶Tru9I、限制性內切酶CviQI、限制性內切酶 Bfal、限制性內切酶Sau3AI或限制性內切酶TaqI ;步驟二中使用限制性內切酶Tsp509I其 單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3'，單鏈寡核苷酸連接頭 B的堿基序列為5' -AATTGGTACGCAGTCTAC-3';使用限制性內切酶Tru9I、 CviQI或Bfal 其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為5' -GACGATGAGTCCTGAG-3 '，單鏈寡核苷酸連接 頭B的堿基序列為5' -TACTCAGGACTCAT-3';使用限制性內切酶Sau3AI其單鏈寡核苷酸 連接頭A的堿基序列為5' -GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3'，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿 基序列為5 ' -CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3';使用限制性內切酶Taql其單鏈寡核苷酸 連接頭A的堿基序列為5' -GACGATGAGTCCTGAG-3'，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列為 5' -CGCTCAGGACTCAT-3'。其它步驟及參數與實施方式四相同。 本實施方式中限制性內切酶Tsp5091的粘末端序列為5' -AATT、酶切溫度孵育為 65°C，限制性內切酶Tru9I的粘末端序列為5' -TA,酶切溫度孵育為65°C，限制性內切酶 CviQI的粘末端序列為5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內切酶BfaI的粘末端序列為 5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內切酶Sau3AI的粘末端序列為5' -GATC、酶切溫度 孵育為37°C，限制性內切酶TaqIGATC的粘末端序列為5' -CG.酶切溫度孵育為65°C。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟三中用通用引 物M13+或M13—與含有重復序列的探針為引物進行菌落PCR擴增，PCR反應體系為15yL， 由濃度為10ymol/L的正向引物、0. 6ii L濃度為1Oiimol/L的反向引物、1. 5ii L Taq DNA 聚合酶商業包裝中10XBuffer、0. 9ii L濃度為25,1/L的MgCl2、 1. 2 ii L濃度為2. 5,1/ L的dNTP、0. 12 ii L濃度為5U/ y L的T叫DNA聚合酶和余量的無菌去離子水組成；用無菌 牙簽按順序將單菌落挑入反應管中進行菌落PCR，PCR反應程序為94t:預變性5min，94t:變 性30s、60。C退火30s、72。C延伸lmin，共30個循環，72。C延伸5min，PCR反應產物用濃度為 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑取PCR擴增產物為200 750bp的具有明顯條帶的陽性克隆 進行測序。其它步驟及參數與實施方式五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六的不同點是步驟二 d I中選用 生物素標記的(CA)w寡核苷酸探針，則步驟三PCR擴增引物為M13+和(CA、。，或者M13-和 (CA、。；步驟二d I中選用生物素標記的(CAG)w寡核苷酸探針則步驟三PCR擴增引物為 M13+和(CAG)e，或者M13-和(CAG)e。其它步驟及參數與實施方式六相同。
具體實施方式
八本實施方式哲羅鮭多態性微衛星標記按以下步驟獲得一、提 取哲羅鮭基因組DNA ;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛星富集文庫的構建；三、菌落PCR 擴增并進行陽性克隆檢測和測序，獲得哲羅鮭微衛星序列；四、對哲羅鮭微衛星序列進行分 析和引物設計；五、微衛星序列引物多態性鑒定，獲得哲羅鮭多態性微衛星標記。
10
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
八的不同點是步驟二分以下步驟 實現 a、哲羅鮭基因組DNA的酶切 哲羅鮭基因組DNA酶切體系為20iiL，由2iiL 10 X酶切buffer、0. 2 ii L濃度為 10ng/ ii L的BSA、2. 5U限制性內切酶、5 y L濃度為100ng/ y L的哲羅鮭基因組DNA和余量 的滅菌去離子水組成；酶切孵育時間為4h ;
b、連接 連接體系為40 ii L，由20 ii L步驟a酶切片段、2 ii L粘末端雙鏈接頭、 4 ii L10Xbuffer、6weiss單位T4DNA連接酶和余量的滅菌去離子水組成，并于4。C水浴中過 夜連接；其中雙鏈接頭按以下步驟制備等體積混合濃度均為1Opmol/L的單鏈寡核苷酸連 接頭A和單鏈寡核苷酸連接頭B，95t:變性10min，然后經過4h勻速冷卻至l(TC，即得到雙 鏈接頭； c、目的片段獲取 用單鏈寡核苷酸連接頭A做擴增引物進行擴增，擴增反應體系為25 ii L，由3 ii L步 驟b連接產物、1. 5ii L引物、2. 5ii L 10XBuffer、1. 5ii L濃度為25mmol/L的MgCl2、2 ii L濃 度為2. 5mmol/L的dNTP、0. 3 y L濃度為5U/ y L的Taq酶和余量的無菌超純水組成；擴增反 應程序為72°C 2min，94t:預變性5min，循環設置為94t:變性30s，53t:退火30s，72。C延伸 lmin，共14 20個循環，72t:延伸10min ;擴增產物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測， 用Promega PCR產物回收試劑盒切膠回收長度為500 900bp的DNA片段；
d、微衛星富集文庫的構建
1、雜交 取12iiL步驟c回收的DNA片段置于95t:環境中變性10min，然后立即加入到 68t:、體積為38 ii L的雜交液中雜交lh后得到雜交DNA ;其中38 y L的雜交液由1. 5 y L濃 度為10 ii mol/L的生物素標記的含有重復序列的探針、5 ii L濃度為10pmol/L的單鏈寡核苷 酸連接頭A，15iiL 20XSSC，0. 5ii L質量濃度為10X的SDS和16 y L ddH20組成；
n、平衡磁珠 在1. OmL離心管中加入100 y L鏈霉親和素磁珠和200 y L洗液C洗滌2次，然后將 離心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，棄除上清液，再用200 y L洗液D洗滌磁珠3 5次，之后加入150 y L洗液D室溫放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值為8. 0的EDTA的 濃度為lmmol/L、pH值為8. 0的Tris-Cl的濃度為10mmol/L、NaCl的濃度為2mmol/L ;洗液 D是用6 X SSC液稀釋的質量濃度為0. 1 %的SDS溶液；
ni、親和捕捉 將步驟I得到的雜交DNA加入步驟II平衡磁珠中25t:溫浴20min，然后去除上清 液，再用洗液D 25t:洗滌磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68。C洗滌磁珠2次，再用洗液 F洗滌磁珠2次，而后用200 ii L 0. 1 X TE洗滌磁珠2次，再加入30 y L 0. 1 X TE在95。C變 性10min，然后收集上清液，即得到含有重復序列的單鏈DNA片段；其中洗液E是用3XSSC 液稀釋的質量濃度為0. 1 %的SDS溶液，洗液F為6 X SSC液；
IV、 PCR擴增含有微衛星序列的DNA片段 PCR反應體系為25ii L，由內含4種dNTP的混合PCR緩沖液18ii L、單鏈寡核苷酸連接頭A為引物0. 5 L、T叫DNA聚合酶0. 5 y L，步驟III收集的上清液4 y L和余量的無菌 水組成；PCR擴增反應程序為94t:預變性5min，循環設置為94。C變性30s，53。C退火30s， 72t:延伸lmin，共20 30個循環，72t:延伸10min，用Promega PCR產物回收試劑盒純化 回收，去除多余的引物、dNTP和接頭；
V、T-載體連接及克隆 T-載體連接反應體系為10 ii L，由5 ii L T-載體商業包裝中2 X連接緩沖液、1 y L 載體pMD18-T vector和4 y L步驟IV純化回收的DNA片段組成；同時以T載體自身連接作 為對照，4t:連接過夜；再用CaCl2制備的感受態大腸桿菌DH5a進行轉化，得到基因組微衛 星富集文庫，并將文庫中的單菌落轉移培養平板中按順序排列； 步驟二d I中生物素標記的含有重復序列的探針為生物素標記的(CA)w寡核苷酸 探針或生物素標記的(CAG)w寡核苷酸探針； 步驟二 a中限制性內切酶為限制性內切酶Tsp5091 、限制性內切酶Tru91 、 限制性內切酶CviQI、限制性內切酶Bfal、限制性內切酶Sau3AI或限制性內切 酶T叫I ;步驟二中使用限制性內切酶Tsp5091其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿 基序列為5 ' -CTCGTAGACTGCGTACC-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列為 5 ' -AATTGGTACGCAGTCTAC-3 ';使用限制性內切酶Tru91、 CviQI或Bfal其單鏈寡核苷 酸連接頭A的堿基序列為5 ' -GACGATGAGTCCTGAG-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基 序列為5' -TACTCAGGACTCAT-3 ';使用限制性內切酶Sau3AI其單鏈寡核苷酸連接頭A 的堿基序列為5 ' -GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列 為5 ' -CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3 ';使用限制性內切酶Taql其單鏈寡核苷酸連接 頭A的堿基序列為5 ' -GACGATGAGTCCTGAG-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列為 5' -CGCTCAGGACTCAT-3'; 步驟三中用通用引物M13+或M13—與含有重復序列的探針為引物進行菌落PCR擴 增，PCR反應體系為15iiL，由0. 6iiL正向引物、0. 6iiL反向引物、1.5iiL Taq DNA聚合酶商 業包裝中10XBuffer、0. 9ii L濃度為25mmol/L的MgCl2、1. 2ii L濃度為2. 5mmol/L的dNTP、 0. 12 ii L濃度為5U/ ii L的Taq DNA聚合酶和余量的無菌去離子水組成；用無菌牙簽按順序 將單菌落挑入反應管中進行菌落PCR，PCR反應程序為94t:預變性5min，94t:變性30s、6(rC 退火30s、72t:延伸lmin，共30個循環，72t:延伸5min，PCR反應產物用濃度為1%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測，挑取PCR擴增產物為200 750bp的具有明顯條帶的陽性克隆進行測序；
步驟二 d I中選用生物素標記的(CA) 16寡核苷酸探針，則步驟三PCR擴增引物為 M13+和(CA、。，或者M13-和(CA)1Q ;步驟二 d I中選用生物素標記的(CAG) 16寡核苷酸探針 則步驟三PCR擴增引物為M13+和(CAG)e，或者M13-和(CAG)6。其它步驟及參數與實施方 式八相同。 本實施方式內切酶從NEB公司購買。 T4DNA連接酶購自于美國Promega公司。pMD18-T vector購自于寶生物工程(大 連)有限公司(大連TaKaRa公司)。感受態大腸桿菌DH5 a購自于蓋寧生物科技(北京) 有限公司。 本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態細胞和質粒等均容易購得，若無特殊 要求則濃度為產品標注濃度。本實施方式中未注明的操作步驟參見試劑使用說明。
本實施方式步驟dill中25t:溫浴使生物素和鏈霉親和素結合。
本實施方式步驟dV中連接緩沖液中包含連接酶。 本實施方式中限制性內切酶Tsp5091的粘末端序列為5' 4八17、酶切溫度孵育為 65°C，限制性內切酶Tru91的粘末端序列為5' -TA,酶切溫度孵育為65°C，限制性內切酶 CviQI的粘末端序列為5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內切酶BfaI的粘末端序列為 5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內切酶Sau3AI的粘末端序列為5' -GATC、酶切溫度 孵育為37°C，限制性內切酶TaqIGATC的粘末端序列為5' -CG.酶切溫度孵育為65°C。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
八或九的不同點是步驟四對哲羅 鮭微衛星序列進行分析和引物設計按以下步驟實現
①根據步驟二限制性內切酶和粘末端雙鏈接頭序列分組； ②根據分組采用相對應的粘末端連接接頭序列進行載體和接頭去除，所用程序為 DNA測序污染序列批量處理工具(專利申請
發明者佟廣香, 匡友誼, 孫效文, 尹家勝 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所