專利名稱：一種抗寄生蟲的化合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物科學，具體說就是一種抗寄生蟲的化合物及其制備方法。
背景技術：
放線菌是自然界分布最廣泛的微生物類群之一，而鏈霉菌(Sti^ptomyces)是放線菌中最大的一個類群，也是抗生素的重要產生菌。目前，包括出現在專利中的種已經超過 3000個，至1996年有效描述的種有464個和亞種45個。據統計，鏈霉菌產生的抗生素占 抗生素的70%左右。占放線菌產生抗生素的90%以上。而目前我國發現的農用抗生素，無 論是大面積應用還是局部地區商品化產品，或是有較大應用潛力的農用抗生素產生菌均為 鏈霉菌° 尼莫克汀(Nemadectin)(圖一)由藍灰鏈霉菌 Streptomyces cyaneogriseussp. noncyanogenus發酵產生，是十六元大環內酯化合物，屬于米爾貝霉素族(Milbemycin)抗 生素。以尼莫克汀為基礎半化學合成的莫西克汀(Moxidectin)(圖二)在C-23位引入= N-OCH3基團，親脂性更強。莫西克汀同伊維菌素(Ivermectin)的作用機制基本相似，但比 伊維菌素具有更高的活性。莫西克汀可用于抗多種體內外寄生蟲，其中內寄生蟲主要是線 蟲，外寄生蟲有螨、蜱和蚤類。它抗寄生蟲的特點是作用強烈，用藥量少，并且對人安全、無 毒害、不污染環境，只殺害蟲，不殺害蟲天敵，也不易產生抗藥性，可以作為防治該類藥物產 生抗性的復配及輪換用藥，是目前最有前途的廣譜、高效、新型、抗蟲、無交叉感染的生物殺 蟲劑，被譽為當今活性最高的殺蟲劑之一，是目前最有前途的抗蟲抗生素。

發明內容
本發明的目的在于提供一種高活性、藥效持久的抗寄生蟲的化合物及其制備方法。本發明的目的是這樣實現的所述的抗寄生蟲的化合物，分子式為=C36H5tlO7 ；結構式為 所述的抗寄生蟲的化合物的制備方法，步驟如下步驟一培養基的制備平板及斜面培養培養基的組成(g/L)葡萄糖10，麥芽 糖 3，酵母抽提粉 3，K2HPO4 · 3Η20 0. 5，MgSO4 · 7Η200· 5，NaCl 0. 5，KNO3 1，微量元素溶液 5，pH 7. O 7. 2，使用去離子水配制，微量元素溶液(g/L) =MgSO4 · 7H20 80，CaCO3 10，FeCl3 6，ZnSO4 2, MnSO4 2，CuSO4 0· 5，CoCl2 0. 4，用去離子水定容，置于28°C的培養箱中，相對濕 度40 60%，培養9d;步驟二 種子培養種子培養基組成(g/L)葡萄糖5，麥芽糊精20，可溶性淀粉 1，酵母膏10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，pH 7. 0 7. 2，使用自來水配制；將成熟斜面上的孢子 用滅菌后的接種鏟挖塊接種于種子培養搖瓶中(挖塊大小約1X0. 5cm)，種子搖瓶裝液量 25ml/250ml，于28°C，250rpm旋轉式搖床上培養48h ；
步驟三搖瓶發酵發酵培養基組成(g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽餅粉25，CaCO3 3 ；pH 7. 0 7. 2，使用自來水配制；將種子液按8%的移種量接入發酵搖瓶中，發酵搖瓶裝 液量為25ml/250ml三角燒瓶，于28°C，250rpm旋轉式搖床上培養9d ；步驟四分離和提純化合物發酵液經100 200目篩網過濾后，濾渣用甲醇提 取，提取液濃縮至一定體積后用EtOAc萃取，將萃取夜濃縮后依次進行硅膠柱層析，RP-18 柱層析所得到的化合物，得到無色的粉末狀化合物。步驟五硅膠層析其所用到的填料是200-300目的硅膠，流動相為石油醚乙酸 乙酯=9 1-5 5 (V/V)兩種洗脫液混合進行梯度洗脫。其中RP-18柱層析使用混合溶 齊U，甲醇與水=80 20-95 5(V/V)的溶液進行梯度洗脫的。本發明抗寄生蟲的化合物及其制備方法，所述的化合物為具有抗動物體內外寄生 蟲及其蟲卵活性的新化合物1，以200 μ g/kg的計量下能夠有效驅殺豬體內線蟲和體外血 虱。對抑制線蟲感染長達42d，對蟲卵再出現抑制長達85d。與莫西菌素相比，相同實驗環境 和劑量下，即以200 μ g/kg,莫西菌素對抑制豬體內線蟲感染為35d，對蟲卵再出現為80d。 因此得出結論，本發明所得到的新化合物有比目前市售的抗寄生蟲類藥物莫西菌素有更強 的抗多種寄生蟲的活性。


圖1為本發明的尼莫克汀(Nemadectin)結構式；圖2為本發明的尼莫克汀(Moxidectin)結構式；圖3為本發明的鏈霉菌neau3在高氏一號培養基上的菌落形態；圖4為本發明的鏈霉菌neau3在熒光倒置相差顯微鏡(400X)下的菌絲形態；圖5為本發明的鏈霉菌neau3在掃描電鏡(5000 X)下的菌絲形態。
具體實施例方式下面結合附圖舉例對本發明作進一步說明。實施例1 菌株發酵本發明涉及的一種鏈霉菌屬菌株，為從湖北省來鳳縣的一個 土樣中分離得到的。2009年10月10日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心”，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所。保藏登記號為CGMCC No. 3316，命名為鏈霉菌neau3(Str印tomyces sp. neau3)的菌株。該菌株不但能夠產生尼 莫克汀，還能產生新化合物1。該菌株的16S rDNA序列為GCCCCGGAGTTCCGTCGTTATAGTGCAGTCGACGATGAAGCCTTTCGGGGTGGATTAGT
GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGC GGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAAAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATGGACGAAGTCGTAGCAGAGTGATCTACGGCC該序列在美國國立衛生研究院全國生物技術研究中心(NCBI)的數據庫GeneBank 等記號為DQ924968. 1，由東北農業大學生物化工研究室提供。平板及斜面培養培養基的組成(g/L)葡萄糖10，麥芽糖3，酵母抽提粉3， K2HPO4 · 3H20 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5，KNO3I,微量元素溶液 5，pH 7. 0 7. 2，使用 去離子水配制。微量元素溶液(g/L)=MgSO4 · 7H20 80，CaCO3 10，FeCl3 6，ZnS042, MnSO4 2，CuSO4 0.5，CoCl2 0.4，用去離子水定容。置于28°C的培養箱中，相對濕度40 60%，培養9d。種子培養種子培養基組成(g/L)葡萄糖5，麥芽糊精20，可溶性淀粉1，酵母膏 10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，PH 7.0 7. 2，使用自來水配制。將成熟斜面上的孢子用滅菌后的接種鏟挖塊接種于種子培養搖瓶中(挖塊大小 約1X0. 5cm)，種子搖瓶裝液量25ml/250ml，于28°C，250rpm旋轉式搖床上培養48h。搖瓶發酵發酵培養基組成(g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽餅粉25，CaCO3 3 ；pH 7.0 7. 2，使用自來水配制。將種子液按8%的移種量接入發酵搖瓶中，發酵搖瓶裝液量為25ml/250ml三角燒 瓶，于28°C，250rpm旋轉式搖床上培養9d。
實施例2 化合物的分離30L發酵液經200目篩網過濾，并且用水清洗慮餅，發酵 液和清洗用的水全都棄掉，用10L甲醇浸提過濾后得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最后 將甲醇溶液濃縮到大約2L，再將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相減 壓蒸餾會產生30g油狀物質。將所得油狀物上硅膠柱(粒徑200 300目)進行層析，分 別用石油醚乙酸乙酯=9 1-5 5(V/V)兩種洗脫液混合進行梯度洗脫，得到了三個組 分，將組分三上RP-18硅膠柱進行層析，用甲醇水=80 20-95 5 (V/V) 二種洗脫液混 合進行梯度洗脫，會得到化合物l(30mg)。其中得到化合物1的結構式為 化合物1的物理化學性質如下性狀(Appearance)白色粉末；溶解性(Solubility)易溶于氯仿、丙酮、甲醇；比旋度(Specific rotation) [ a ]D25+45. 1 (c 0. 10，EtOH)；分子式(Molecular formula) :C36H5(l07 ；ESIMS m/z :593[M-Hr，High-resolution ESIMS :617. 3447[M+Na] + (calcd for C36H5007Na,617. 3449)；UV absorption spectrum 入 max (EtOH) nm (log e ) 270 (4. 16)，296 (4. 03)；IR absorption spectrum :Vmax cnT1 3447，2961，2927，1705，1613，1457，1383， 1282，1162,997 ；NMR(CDC13,400MHz) S 7. 82 (1H，s，H_3)，6. 97 (1H，s，H_6)，6. 51 (1H，d，J = 11. 2， H-9)，6. 24 (1H, dd, J = 11. 2，14. 9，H-10)，5. 90 (1H, dd, J = 7. 0，14. 9，H-ll)，2. 54 (1H, m, H-12)，1. 98 (1H, m H_13a)，2. 17 (1H, m, H_13b)，5. 13 (1H, m, H-15)，2. 28 (2H, m, H-16)， 3. 71 (1H, m, H-17)，1. 23 (1H, m, H_18a)，2. 05 (1H, m, H_18b)，4. 17 (1H, m, H_19)，1. 38 (1H, br t, J = 11. 8，H-20a)，2. 05 (1H，m，H_20b)，1. 73 (1H，m，H_22a)，1. 98 (1H，m，H_22b)，3. 80 (1H, m, H-23)，1. 63 (1H, m, H-24)，3. 69 (1H, d, J = 10. 9，H-25)，2. 24 (3H, s, H-26)，5. 80 (2H, br s, H-27)，1. 08 (3H, d，J = 6. 6，H_28)，1. 63 (3H, br s, H_29)，0. 79 (3H, d, H_30)，5. 13 (1H, d，J = 7. 9，H-32)，2. 54 (1H, m, H_33)，1. 58 (3H, d，J = 0. 8，H_34)，0. 93 (3H, d，J = 6. 6， H-35)，0. 98(3H，d，J = 6. 6，H-36) ； 13C 匪R(CDC13，100MHz) 8 165. 6(s,C-l), 114. 9(s,C-2),133. 3(d, C-3)，126.1 (s, C-4)，160. 3 (s, C_5)，107.5 (d, C_6)，138.3 (s, C_7)，124. 0 (s, C-8)，127. 7(d, C-9)，122. 1 (d, C_10)，146. 3(d, C_11)，34. 4 (d，C—12)，47. 8 (t，C_13)， 136. 1 (s, C-14)，121.7 (d，C-15)，34. 1 (t, C-16)，69. 1 (d, C_17)，40. 0 (t, C_18)，64.6 (d, C-19)，44.1 (t, C-20)，99.8 (s, C-21)，41.0 (t，C-22)，69. 5(d, C_23)，35. 9 (d, C_24)， 76. 7(d, C-25)，15.6 (q, C—26)，66. 6 (t, C—27)，19. 7 (q, C—28)，16.3 (q, C—29)，13.9 (q, C-30)，130. 7(s，C-31), 137. 4(d, C-32)，26. 8 (d，C-33)，11. 0 (q，C-34)，22. 8 (q，C-35)， 22. 8 (q, c-36).新化合物1在結構上與尼莫克汀(圖1)最主要的不同是，化合物1對應尼莫克汀 的酯鍵已斷裂，分子呈鏈狀。實施例3 結合圖4、圖5，出發菌株的形態鑒定(1)在高氏一號培養基上，菌落顏色為灰白色，菌落形態實心圓形，見圖3。(2)孢子絲直、柔曲，孢子橢圓形，圓球形或柱形，表面光滑，熒光倒置相差顯微鏡 和掃描電鏡照片分別見圖4、圖5。實施例4 抗蟲活性測定對豬體內外寄生蟲及其蟲卵的觸殺作用將100頭斷奶仔豬分為四組，分別進行如下處理。第一組為高劑量組，皮下注射 劑量為400 u g/kg ；第二組為中劑量組，皮下注射劑量為300 u g/kg ；第三組為低劑量組 200 yg/kg;第四組為對照組，不做任何處理。依試驗前后豬體內外寄生蟲(卵)罹患數量 進行比較來確定新化合物對驅殺豬體內線蟲和體外血虱的效果。依據豬再感染寄生蟲的時 間，確定藥物在豬體內的殘效期。新化合物1，以200 y g/kg的計量下能夠有效驅殺豬體內線蟲和體外血虱。對抑制 線蟲感染長達42d，對蟲卵再出現抑制長達85d。
權利要求
一種抗寄生蟲的化合物，其特征在于分子式為C36H50O7；結構式為F2009100731241C00011.tif
2. 一種抗寄生蟲的化合物的制備方法，其特征在于步驟如下 步驟一培養基的制備平板及斜面培養培養基的組成(g/L)葡萄糖10，麥芽糖3， 酵母抽提粉 3，K2HP04 3H20 0. 5，MgS04 7H200. 5，NaCl 0. 5，KN03 1，微量元素溶液 5，pH 7. 0 7. 2，使用去離子水配制，微量元素溶液(g/L) :MgS04 7H20 80，CaC03 10，FeCl3 6， ZnS04 2，MnS04 2，CuS04 0. 5，CoCl2 0. 4，用去離子水定容，置于28°C的培養箱中，相對濕度 40 60%，培養9d ；步驟二 種子培養種子培養基組成(g/L)葡萄糖5，麥芽糊精20，可溶性淀粉1，酵 母膏10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，pH 7. 0 7. 2，使用自來水配制；將成熟斜面上的孢子用 滅菌后的接種鏟挖塊接種于種子培養搖瓶中(挖塊大小約1X0. 5cm)，種子搖瓶裝液量 25ml/250ml，于28°C，250rpm旋轉式搖床上培養48h ；步驟三搖瓶發酵發酵培養基組成(g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽餅粉25，CaC03 3 ； pH 7.0 7. 2，使用自來水配制；將種子液按8%的移種量接入發酵搖瓶中，發酵搖瓶裝液 量為25ml/250ml三角燒瓶，于28°C，250rpm旋轉式搖床上培養9d ；步驟四分離和提純化合物發酵液經100 200目篩網過濾后，濾渣用甲醇提取，提 取液濃縮至一定體積后用EtOAc萃取，將萃取夜濃縮后依次進行硅膠柱層析，RP-18柱層析 所得到的化合物，得到無色的粉末狀化合物。步驟五硅膠層析其所用到的填料是200-300目的硅膠，流動相為石油醚乙酸乙酯 =9:1-5: 5 (V/V)兩種洗脫液混合進行梯度洗脫。其中RP-18柱層析使用混合溶劑，甲 醇與水=80 20-95 5(V/V)的溶液進行梯度洗脫的。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種高活性、藥效持久的抗寄生蟲的化合物及其制備方法。所述的抗寄生蟲的化合物，分子式為C36H50O7；所述的抗寄生蟲的化合物的制備方法包括培養基的制備、平板及斜面培養、種子培養、搖瓶發酵、分離和提純化合物、硅膠層析。所述的化合物為具有抗動物體內外寄生蟲及其蟲卵活性的新化合物1，與莫西菌素相比，相同實驗環境和劑量下，即以200μg/kg，莫西菌素對抑制豬體內線蟲感染為35天，對蟲卵再出現為80天。本發明所得到的新化合物比目前市售的抗寄生蟲類藥物莫西菌素有更強的抗多種寄生蟲的活性。
文檔編號C12R1/465GK101875679SQ20091007312
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月2日 優先權日2009年11月2日
發明者向文勝, 姜玲, 王明, 王相晶, 高愛麗 申請人:東北農業大學