專利名稱：一種含有免疫球蛋白基因的載體、構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種載體，具體地涉及一種含有免疫球蛋白基因的載體及其
構建方法，并以葡激酶(staphylokinase SAK)的融合表達為例，說明該載體
在延長重組蛋白藥物在體內半衰期方面的應用。
背景技術：
利用DNA體外重組技術獲得目的蛋白是蛋白質結構功能和生物工程醫藥 研究的基礎。基因組學和蛋白組學研究的不斷深入，極大地拓展了新型蛋白 質藥物的研究領域。經過幾十年的探索，外源基因在原核細胞中的高效表達 技術已經比較成熟，已有大量通過該表達的重組蛋白應用于臨床。然而目前 臨床上使用的第一代基因工程蛋白藥物，大多數存在半衰期短、需要頻繁給 藥才能達到治療效果，增加了患者治療成本，嚴重降低了患者的生活質量等 問題，從某些方面來說限制了重組蛋白藥物的臨床應用。因此延長重組蛋白 在體內的半衰期，降低外源蛋白的免疫原性是重組蛋白藥物研究需要迫切解 決的問題。
IgG (Immunoglobulin gamma)型的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白 質，它們的半衰期可長達21天，與基因工程蛋白藥物相比，Fc融合蛋白具有半 衰期長、親和力高和免疫源性低等優勢。將人IgG的Fc區域與其它蛋白質(如 各種細胞因子和可溶性受體)結合形成融合蛋白以延長半衰期已有報道 (Capon DJ， Chamow SM， Mordenti J， et al. Nature, 1989， 337， 525 531; Chamow SM, Ashkenazi A， TrendsBiotechnol， 1996， 14 (2) : 52 60)，由于結 構上的同源，Fc融合蛋白表現出的體外藥物代謝動力學特性與同類型的人IgG相當。這種制備融合蛋白的方法己用于一些重要的細胞因子如IL-2和IFNa-2a 和可溶性受體如TNF-Rc和L-5-Rc (Landolfi NF. US PatentNo.5349053; Sm池 CA， Goodwin RG, Beckmann MP. US PatentNo.6224867),由此制備的一些藥物 已成功地使用在臨床上并用于治療一些特定疾病。據此，我們希望采用基因 工程技術制備一種能融合表達IgGFc片段的載體，以期提供高效的應用平臺， 使外源基因能方便地與IgGFc片段融合，融合IgGFc片段的重組蛋白不僅具 有多肽或蛋白所特有的生物學功能，而且兼備較長血清半衰期等特性(Hodges TL, Antimicro-Agonts-Chemother, 1991， 35: 2580-2586)。
到目前為止，尚未見到利用人IgGlFc段構建融合表達載體的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種含有免疫球蛋白基因的載體。 本發明的目的也在于提供該載體的構建方法。 本發明的目的還在于提供一種包含該載體的轉化體。 本發明的目的還在于提供該載體在延長重組蛋白藥物在體內半衰期方面 的應用。
本發明的一種含有免疫球蛋白基因的載體，包含編碼免疫球蛋白IgGl Fc 片段的基因，所述載體的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，該載體被命名為 pBV220/Fc。
所述編碼免疫球蛋白IgGl Fc片段的基因來源于人，其核苷酸序列為SEQ ID
No. 1中的7-717bp。
本發明的轉化體為含有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。 所述pBV220/Fc融合表達載體具備Z力oLI、 ^a/zHI、 5aJI、歷'/7c11、尸stl、
歷'/7din多克隆酶切位點。所述載體的構建方法，按如下操作步驟進行
(1) 根據來源于人的IgGl基因序列，設計并合成針對上述基因序列的引物， 以來源于人的基因組或基因組文庫為模板，通過PCR方法擴增目的產物；
(2) 用T4連接酶將回收后的目的產物，與pEASY-T載體連接，經轉化和篩
選陽性克隆后，進行酶切和測序鑒定；
(3) 測序正確的連接產物和pBV220載體分別經/5boRI和Aa^I雙酶切后用 L連接酶連接，經轉化和篩選陽性克隆后，進行酶切和測序鑒定，最終獲得重 組載體，命名為pBV220/Fc。
所述的引物如下 上游引物
5'-GGAATTCCATGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC-3' (SEQ ID No. 2) 下游引物
G-3' (SEQ ID No, 3)
所述下游引物中包括編碼5肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser柔性接頭(linker) 的基因序歹!j CGATCCGCCACCGCC。
所述模板為人胎肝cDNA文庫。
該載體在延長重組蛋白藥物在體內半衰期方面的應用。 利用本發明的載體表達融合蛋白能使目的蛋白的分子量增加約21kD，其
中，編碼IG1 Fc的基因為1666bp，同時利用IgGl Fc蛋白形成天然的二聚體
結構，增加了整個蛋白的空間結構。體內動物實驗結果表明，由IgGFc連接
的融合蛋白可以顯著的延長其血漿半衰期。
5圖1為從胎肝庫提取的IgGlFc的PCR產物電泳圖2為pEASY-T/Fc克隆的酶切鑒定電泳圖3為載體pBV220和pBV220/Fc重組載體的酶切鑒定電泳1: pBV220/EcoRI+BamHI酶切；2: pBV220-Fc/EcoRI+BamHI酶切
圖4為pBV220/Fc/SAK表達電泳1. 蛋白Marker;
2. pBV220/Fc/SAK/DH5 a誘導表達全菌；
3. pBV220/Fc/SAK/DH5 a誘導表達破碎上清；
4. pBV220/Fc/SAK/DH5 a誘導表達破碎沉淀； 圖5為SAK及Fc-SAK蛋白溶栓活性測定；
1A， 4A重組蛋白Fc-SAK; 1B， 4B， 1C， 4C重組蛋白SAK;2， 3活性標準品
圖6為SAK及Fc-SAK血藥-時間曲線圖7為pBV220載體示意圖8為pBV220/Fc重組載體結構圖9為pBV220/Fc構建流程圖10為5^r基因擴增產物電泳圖。
具體實施例方式
以下實施例并不限定本發明，實施例中未詳細說明的操作步驟請參照《分 子克隆實驗指南》第二版相應部分(J.薩姆布魯克E.F.弗里奇等，科學出版社) 或參閱所用試劑盒的說明書。 實施l重組載體pBV220/Fc的構建
1、釣取編碼人免疫球蛋白IgGl (Human Immunoglobulin gamma-l)重鏈恒定區 Fc片段的基因
具體方法如下根據已報道來源于人的IgGl基因序列(Genbank登錄號為BC006402)，設 計合成特異性引物，釣取的Fc片段位于上述已知序列的816-1523bp位置，弓l物
如下
上游引物
g|gaattc|catggagcccaaatcttgtgacaaaactc-3，(se;q ID No. 2)
￡coR I
下游引物
5awH I G陽3' (SEQ ID No. 3)
勘l I
接頭(linker)
上游引物含有五coRl酶切位點，下游引物帶有編碼5肽0^0^-0^-0^-
Ser柔性接頭(linker)的基因，該基因編碼的5個氨基酸具有疏水性和低電荷效
應，下游引物還帶有lolI禾口B"mHl位點。
以人胎肝cDNA文庫(購自Takara)為模板，用上述的一對引物進行PCR 擴增，引入單克隆酶切位點，獲得帶有接頭(linker)的Fc cDNA， PCR產物 長度為796bp。
PCR反應體系如下
人胎肝庫
上游引物(10umol/O 下游引物(10umol/l) 10xbuffer 2.5mmol dNTP Pyrobest高保真酶(TaKaRa) 水
PCR反應參數均為
94。C5min; 94°C 30s， 55°C 30s, 72°C 30s;
lul 2ul 2ul 5ul 4ul 0.5ul 加至50ul
72 °C 7min
30個循環
PCR產物使用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，如圖1所示。將跑膠后的PCR產物使用凝膠回收試劑盒(購自北京東盛生物試劑有 限公司)進行回收。
2、含IgG Fc重組質粒的構建
回收產物與pEASY-T載體通過T4連接酶連接，轉化感受態細胞DH5a，進 行藍白斑篩選，挑取白斑在LB液體培養基中培養16小時，提質粒，使用&。RI 內切酶進行酶切鑒定，如圖2所示，最后將酶切正確的克隆測序鑒定。
測序正確的質粒用限制性內切酶化oRI和v^;出I (Takara公司)進行雙 酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段IGlFc， 747 bp， pBV220 載體(中國科學院病毒研究所候云德院士厚贈，結構如圖7)也用上述兩種酶 進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，回收3657 bp的載體片段，將 回收的目的基因與載體片段按3:1的比例在T4連接酶的作用下連接，然后將 連接產物轉化感受態細胞DH5a，涂含有氨芐青霉素抗性的LB平板，37。C過 夜培養，挑取陽性克隆在LB液體培養基中培養16小時，提質粒，使用^boRI 和i^MH內切酶進行酶切鑒定，結果如圖3所示，利用T7啟動子引物對酶切 正確的重組質粒進行測序鑒定，測序公司為上海生物公司，測序正確的為 pBV220/Fc重組載體，結構圖如圖8所示。其中質粒DNA的提取、酶切反應、 連接反應、感受態的制備及轉化等操作均參照《分子克隆實驗指南》第二版， 構建載體的整個流程圖如圖9所示。
pBV220/Fc融合表達載體具備J力olI、萬a/zin、 5^21、歷'/7cII、/^tl、歷'/7din 多克隆酶切位點。
實施例2以葡激酶(staphylokinase，SAK)的融合表達為例，說明該載體在延 長重組蛋白藥物在體內半衰期方面的應用
天然葡激酶(staphylokinase， Sak)是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合 成的一種單鏈蛋白，由136個氨基酸組成。葡激酶本身不具有酶活性，其可 與血栓表面的纖溶酶原hl結合形成復合物，并進一步激活纖溶系統。由于 Sak激活纖溶酶具有纖維蛋白專一性，出血傾向較低，Sak的溶栓作用并不影 響血漿中纖維蛋白原和纖溶酶原以及a 2-抗纖溶酶的水平而且對陳舊性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比傳統溶栓藥物更強，因此Sak是一種很有希 望的溶栓劑。
1、 SAK克隆入重組表達載體pBV220/Fc的方法
利用上述重組表達載體pBV220/ Fc中引入的單克隆酶切位點屈oll和 ^ mffl，設計SAK相應的引物上下游分別帶有^olI和&mHI酶切位點。根據已 報道的W堪因序列(Genbank登錄號為GC515445)，設計合成^ 因特異性 引物，引物如下
上游引物 勘ll
G-3， (SEQ ID No. 4)
下游引物
5 ，-CG|GGATCdCTATGAGTGTACCACCATTGGAAGA-3 ， (SEQIDNo.5)
以pBV220-SAK (構建方法參照鄒民吉等，軍事醫學科學院院刊，1998， 22 (4): 257-292)為模板，禾擁上述引物PCR擴增6^違因，擴增片段的長 度為408bp。
PCR反應體系如下
pBV220/SAK lul
上游引物(lOumol/1) 2ul
下游引物(lOumol/1) 2ul
10xbuffer 5ul
2.5mmo1 dNTP 4ul
Pyrobest高保真酶(TaKaRa) 0.5ul
水 加至50ul PCR反應參數均為
94°C 5min;^4。C 30s， 55°C 30s， 72。C 30;; 72°C 7min
30個循環
PCR產物使用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，如圖10所示。擴增產物經回收后，利用限制性內切酶Z力o11和5a 出I酶切后與經相同 酶切的pBV220/Fc載體連接，制備重組質粒，轉化感受態細胞DH5 a ，涂板(氨 芐青霉素抗性)，篩選陽性克隆并測序，具體操作步驟同實施例1，最終得到 重組載體pBV220/Fc/SAK。
2、 pBV220/Fc/SAK和pBV220/SAK在大腸桿菌中的表達與純化 按CaCl2轉化法將表達載體pBV220/Fc/SAK轉化A co〃DH5 a 。按以下步 驟表達和純化轉化菌落經3(TC過夜活化16小時，然后以2。/。比例接種于LB 液體培養基中，3(TC培養至對數生長期(0D 6。。=0. 4 0. 6)，立即轉入42。C水 浴搖床，200 rpm培養4 hr，誘導目的蛋白在￡ co7j'DH5 a中表達。誘導表 達培養物于4。C， 12，000 rpm離心15min，將沉淀重懸于1: 10 PB (100扁ol/L Na2HP04,， 100mmol/LNaH2P04)中，以超聲波破碎菌體(0. 4kW功率破碎10s間 隙10s，總長40min)，離心12000卬m/min離心10min4。C，分別收取沉淀和 上清，進行15% SDS-PAGE電泳，獲得30kD左右的融合蛋白，分析此蛋白在 DH5a中的表達分布情況。蛋白電泳結果如圖4所示。結果表明該融合蛋白在 DH5 a中以包涵體形式表達。超聲處理后得到的包涵體經2 mol/L尿素洗滌2 次，8 mol/L尿素變性溶解，所用柱子為凝膠過濾層析柱(購自Amersham Biosciences公司)，以Sephaciyl-200(S-200)為填料對溶解上清進行凝膠過濾層 析，洗脫劑為8mol/L尿素，采用15% SDS- PAGE分析各洗脫峰對應的樣品純 度。純化的樣品在復性緩沖液(100 mmol/L Na2HP04, 100 mmol/L NaH2P04， 0. 1 mmol/L GSSG ， 1 mmol/L GSH， 0. 1 % PEG)中4。C稀釋復性72hr，之后 以62pg/mL PEG 6000緩慢濃縮。經Lowry法測定，得到蛋白樣品濃度為 4. 25mg/nl。Lowry法原理為，蛋白質在堿性溶液中其肽鍵與012+鰲合，形成蛋白質一 銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，在一定條件 下，利用藍色深淺與蛋白質濃度的線性關系作標準曲線，并測定樣品中蛋白 質的濃度。步驟l，用不同濃度的蛋白標準品繪制標準曲線；步驟2，稀釋待 測樣品至合適濃度，加入堿性銅試劑工作液，充分混勻，25'C水浴10min后 加入Folin-酚試劑，25。C水浴30min,紫外660nm測定吸光值；步驟3，根據 所測樣品吸光值與標準曲線作對比，計算出樣品實際濃度。
pBV220-SAK (中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所實驗室保 存)在大腸桿菌中的表達與純化步驟同pBV220/Fc/SAK，得到重組蛋白濃度 為4mg/mL。
3融合蛋白Fc-SAK的活性鑒定
使用瓊脂糖-纖維蛋白平板溶圈法(Saksela O， Anal Biochem, 1981， 111: 276-282.)測定重組蛋白溶栓活性。Bradford法測定重組蛋白含量，生理鹽 水將重組蛋白Fc-SAK稀釋至5ug/ml后點樣每孔6ul (如圖5的1A， 4A)， 重組蛋白SAK稀釋至5ug/ml后點樣每孔6tU (如圖5的1B， 4B，1C,4C)， 點樣平板在黑色背景下縱橫兩次量取溶圈直徑，以各個稀釋度的活性的對數 為橫坐標，以溶圈直徑的平均數的對數為縱坐標，利用統計學軟件中的回歸 分析方法作標準曲線，根據樣品的溶圈直徑可以求得樣品的活性。使用上述 方法測定重組蛋白Fc-SAK的溶栓活性為2.616X104AU/mg;重組蛋白SAK 的溶栓活性為2.689X104AU/mg;測定中使用的葡激酶蛋白標準品(購自中 國生物制品鑒定)如圖5的2和3，其濃度從左到右依次為500AU/mL， 250AU/mL， 125AU/mL， 62.5AU/mL， 31.25AU/mL04融合蛋白Fc-SAK的半衰期分析
1) 選擇雄性大耳白兔20只，分成兩組，每組10只，皮下注射給藥，分 別注射等量的Fc-SAK、 SAK (實施例2的純化產物)，注射劑量為200ug/kg， 分別于注射0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 8.0、 12.0小時后，經 耳緣靜脈采血400pL， 1%肝素鈉抗凝，血液于4。C放置10min后，5000rpm， 離心10min，收集血漿，-20°。保存，集中檢測。
2) 按SAK ELISA試劑盒(購自Uscn life Science & Technology company) 說明書檢測不同時間點血漿中藥物濃度用Microsoft Excel 2003軟件繪制血 藥-時間曲線(如圖6所示)，采用統計矩方法進行初步藥代動力學分析；不同 蛋白間比較用Student's t-檢驗進行統計分析。本實驗采用統計矩方法進行初步 藥代動力學分析，表1中顯示IgG Fc-SAK的半衰期較SAK生物半衰期得到了 顯著的延長，與SAK相比延長了l倍。
表l不同時間點血漿中藥物濃度
樣品時間(h)SAK (pg/mL)FC-SAK(pg/mL)
0. 2550.79± 17.1845.68±15.13
0. 5305.75±21.61251.77± 19.26
1375.41 ±18.76381.63±12.56
2349.23 ±8.09330.87± 15.50
3215.56±7.87245.27±8.22
4121.41 ±9.47175.61 ±20.31
578.42± 14.53146.59± 10.83
657.29± 14.52120.14±8.39
840.56±23.3979.66 ±8.02
1225.76±7.2055.17± 19.59
參考文獻
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gaattcatgg agccc肌atc ttgtgac肌a actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccceccaa aacccaagga caccctcatg 120
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccetgag 180
gtcaagttca actggtacgt gg狄ggcgtg gaggtgc由atgccaagac aaagccgcgg 240
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360
gagaa幼cca tctccaaagc c肌agggcag ccccgag肌c cacaggtgta caccctgccc 420
ccatcccggg atgagctgac caag肌ccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 540
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 600
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgagt gcgacggggc 720
ggtggcggat cgctcgaggc gggatccgga tccgtcgacc tgcagccaag cttctgtttt 780
ggcttatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag肌gcggtctg 840
ataaaacaga atttgcctcc cggeagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 900
tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctceccatgc gagagtagcc 960
aactgceagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 1020
ctg"g"tg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttg幼 1080
cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgecataaa ctgccaggca 1140
tcaaaggaat eagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttg 1200
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 1260
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 1320
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 1380
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgc狄g agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 1440
cggt肌gatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgttttccaatgatga gcacttttaa 1500
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 1560
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtc狄ag a肌agcatct 1620
tacggatggc atg級c汪gtaa gagaattatg c級gtgctgcc汪taaccatga gtgataacac 1680
tgcggecaac ttacttctga caacgatcgg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 1740
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggatctg aatgaagcca 1800taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggca級ca級cg ttgcgc汪aac 1860
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 1920
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 1980
ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 2040
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 2100
gaaatagaca gatcgctgag由ggtgcct cactgatt肌gcattggtaa ctgtcagacc 2160
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 2220
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 2280
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct tttt(tctgc 2340
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc ageggtggtt tgtttgccgg 2400
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 2460
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcacegc 2520
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgecagtggc gataagtcgt 2580
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 2640
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagataec 2700
tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 2760
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 2820
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc aacctctgac ttgagcgtcg attttgtgat 2880
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttaeggttcc 2940
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 3000
ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 3060
gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgccctta tctttccc" tatttttgct 3120
gcggtaagtc gcataaaaac cattcttcat aattcaatcc atttaetatg ttatgttctg 3180
aggggagtga aaattcccct aattcgatga agattcttgc tc肌ttgtta tcagctatgc 3240
gccgaccaga acaccttgcc gatcagccaa acgtctcttc aggccactga ctagcgataa 3300
ctttccccac aacggaacaa ctctcattgc atgggatcat tgggtactgt gggtttagtg 3360
gttgtaaaaa cacctgaccg ctatccctga tcagtttctt gaaggtaaac tcatcacccc 3420
caagtctggc tatgcagaaa tcacctggct caacagcctg ctcagggtca acgagaatta 3480
acattccgtc aggaaagctt ggcttggagc ctgttggtgc ggtcatggaa ttaccttcaa 3540
cctcaagcca gaatgcagaa tcaCtggctt ttttggttgt gcttacccat ctctccgcat 3600
cacct"ggt aaaggttcta agcttaggtg agaacatccc tgcctgaaca tgagaaaaaa 3660
cagggt狄tc atactcactt ct肌gtgacg gctgcatact aaccgcttca t狄atctcgt 3720
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15<210> 2
<211> 36
<212> DNA
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<223>用于擴增IGlFc基因的上游引物
<400> 2
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<212> DNA
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<223>用于擴增IGlFc基因的下游引物
<400> 3
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223>用于擴增SAK基因的下游引物
<400> 5
cgggatccct atgagtgtac c狄cattgga aga 33
1權利要求
1、一種含有免疫球蛋白基因的載體，包含編碼免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因，其特征在于，所述載體的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2、 根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述編碼免疫球蛋白IgGl Fc 片段的基因來源于人。
3、 一種轉化tf，其特征在于，所述轉化體含有核苷酸序列如SEQ IDNo. l所 示的載體。
4、 一種含有免疫球蛋白基因的載體的構建方法，其特征在于，由如下操作步驟構成(1) 根據來源于人的IgGl基因序列，設計并合成針對上述基因序列的引物， 以來源于人的基因組或基因組文庫為模板，通過PCR方法擴增目的產物；(2) 用T4連接酶將回收后的擴增產物，與pEASY-T載體連接，經轉化和篩選 陽性克隆后，進行酶切和測序鑒定；(3) 測序正確的連接產物和pBV220載體分別經fcoRI和"』1雙酶切后用 T4連接酶連接，經轉化和篩選陽性克隆后，進行酶切和測序鑒定，最終獲得重 組載體。
5、 根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述的引物為 上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No. 3所示。
6、 根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述模板為人胎肝cDNA 文庫。
7、 權利要求1所述的載體在延長重組蛋白藥物在體內半衰期方面的應用。
全文摘要
本發明公開了屬于分子生物學領域的一種含有免疫球蛋白基因的載體，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發明也公開了該載體的構建方法，使用該載體能顯著延長重組蛋白藥物在體內半衰期，從而可以延長藥效、減少患者用藥次數、降低成本。
文檔編號C12N15/63GK101509011SQ20091008060
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月20日 優先權日2009年3月20日
發明者徐東剛, 王園園, 王金鳳, 欣 蔡, 鄒民吉 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所