專利名稱：山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法
山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法本發(fā)明涉及基因敲除載體，尤其涉及一種山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法。肌肉生長抑制素，即MSTN，也被稱為“生長分化因子8”，是TGF- β超蛋白家族成員之一，具有抑制骨骼肌分化的作用。MSTN與動(dòng)物骨骼肌總量的調(diào)節(jié)有關(guān)，其功能的缺失會造成骨骼肌異常肥大。在牛中，MSTN基因保守功能區(qū)的一個(gè)突變與產(chǎn)肉量密切相關(guān)，該突變純合體及雜合體肉牛均表出肌肉發(fā)達(dá)、初生重增加和生長速度快的優(yōu)勢。采用基因打靶制備的MSTN基因敲除小鼠，其骨骼肌重量是普通小鼠的2倍以上，而脂肪比例并未隨之增加， 表明MSTN基因的缺失或突變將引起其骨骼肌重量的顯著增加。因此，生產(chǎn)MSTN基因敲除山羊，可望提高山羊胴體瘦肉率，達(dá)到提高飼料利用率、降低飼養(yǎng)成本的目的。基因打靶也被稱為“位點(diǎn)特異性同源重組”或“基因敲除”，是20世紀(jì)80年代后半期興起的一種以基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)為基礎(chǔ)的遺傳操作技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)利用外源DNA與細(xì)胞基因組DNA同源序列發(fā)生同源重組對細(xì)胞基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾，可實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合，使人類定向改造生物遺傳信息的期望付諸現(xiàn)實(shí)。目前，小鼠等嚙齒動(dòng)物的基因打靶技術(shù)已經(jīng)比較成熟，眾多學(xué)者利用基因定點(diǎn)敲除小鼠研究哺乳動(dòng)物的基因功能。由于缺乏成熟的胚胎干細(xì)胞系，豬、牛、羊等大型哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞基因打靶一直未能實(shí)現(xiàn)。近年來，體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展為基因敲除大型動(dòng)物的生產(chǎn)提供了有效的技術(shù)支撐。若對體細(xì)胞進(jìn)行基因敲除，再以靶細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，可獲得基因敲除動(dòng)物，采用此技術(shù)途徑生產(chǎn)的的基因敲除豬、牛、羊已相繼誕生。在體細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶已獲得成功，但體細(xì)胞發(fā)生同源重組的機(jī)率偏低，通常只有10_6 10_7。已有的研究發(fā)現(xiàn)同源序列的同源性及同源序列的長度是影響同源重組效率的主要因素，即當(dāng)載體中采用與打靶目的細(xì)胞系完全相同的同源序列時(shí)，可獲得5 20倍提升的同源重組效率性；另外，當(dāng)載體同源序列從4kb增加至9kb時(shí)，基因靶位操作效率增加10倍。因此，在獲得同源序列時(shí)，不但要保證其具有相當(dāng)?shù)拈L度，還要保證其具備高度同源性。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)設(shè)計(jì)4對引物，2對引物用于山羊胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增片段，即擴(kuò)增出MSTN基因同源長臂的引物L(fēng)AF和LAR和擴(kuò)增出MSTN基因同源短臂的引物SAF和 SAR ;另2對引物用于鑒定pLOXP-MSTN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞獲得抗性克隆細(xì)胞，即用于從pLOXP-MSTN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增同源短臂的引物SAFl和SARl ;用于從 pLOXP-MSTN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增基因neo部分序列的引物NF和NR ；
(2)采取分步克隆策略構(gòu)建最終打靶載體；pL0XP載體包含正向選擇基因neo表達(dá)元件、負(fù)向選擇基因HSV-tk表達(dá)元件以及質(zhì)粒骨架；將pLOXP和pMD18-T-SA分別用Sail、 BamHI雙酶切，凝膠電泳回收相應(yīng)的片段，其中pLOXP酶切回收約為8. Okb的載體大片段， PMD18-T-SA酶切回收的是約I. 9kb的SA片段，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后得到含有重組載體pLOXP-SA的克隆；將載體pLOXP-SA和pMD18_T_LA 分別用Notl、XhoI雙酶切，凝膠電泳回收相應(yīng)片段(pLOXP-SA酶切回收約為9. 9kb的載體大片段，PMD18-T-LA酶切回收約4. 6kb的LA片段)后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組子，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定最后得到山羊成纖維細(xì)胞 MSTN基因打靶載體pLOXP-MSTN ；(3)將打靶載體的線性化后，轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞系，利用含G418的培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選5至10天后，獲得抗性細(xì)胞，提取抗性細(xì)胞克隆DNA進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行基因序列測序以進(jìn)一步驗(yàn)證，獲得MNST基因敲除的山羊胎兒成纖維細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果是用Long-PCR方法等構(gòu)建Myostatin基因敲除載體,并對山羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得基因敲除細(xì)胞。運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)，可以獲得高瘦肉率動(dòng)物，構(gòu)建MNST基因敲除的山羊模型，為進(jìn)一步研究該基因在山羊中的功能具有重要的意義。一、材料安徽白山羊胎兒成纖維細(xì)胞由本校實(shí)驗(yàn)室提供；打靶載體pLOXP由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供；pMD18-T載體、高保真長片段Tap聚合酶和DNA Marker標(biāo)準(zhǔn)、 限制性內(nèi)切酶，即Xhol，SaLI，NotI和BamHI以及T4DNA連接酶等均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自QIAGEN公司；大腸桿菌DH5a、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒購自北京天根科技生化有限公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒購自 QIAGEN 公司；轉(zhuǎn)染試劑 Basic Nucleofector kit 購自 LONZA 公司。二、方法(I)引物設(shè)計(jì)與合成由于目前尚無山羊MSTN基因的序列報(bào)道，所以根據(jù)GenBank中綿羊⑶F_8基因的序列設(shè)計(jì)山羊MSTN基因PCR擴(kuò)增引物。所設(shè)計(jì)引物序列見表I。表I引物序列
權(quán)利要求
1.一種山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法,其特征在于,包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)4對引物，2對引物用于山羊胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增片段，即擴(kuò)增出MSTN基因同源長臂的引物L(fēng)AF和LAR和擴(kuò)增出MSTN基因同源短臂的引物SAF和 SAR ;另2對引物用于鑒定pLOXP-MSTN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞獲得抗性克隆細(xì)胞，即用于從pLOXP-MSTN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增同源短臂的引物SAFl和SARl ;用于從 pLOXP-MSTN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增基因neo部分序列的引物NF和NR ；(2)采取分步克隆策略構(gòu)建最終打靶載體；pL0XP載體包含正向選擇基因neo表達(dá)元件、負(fù)向選擇基因HSV-tk表達(dá)元件以及質(zhì)粒骨架；將pLOXP和pMD18-T-SA分別用Sail、 BamHI雙酶切，凝膠電泳回收相應(yīng)的片段，其中pLOXP酶切回收約為8. Okb的載體大片段， PMD18-T-SA酶切回收的是約I. 9kb的SA片段，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后得到含有重組載體pLOXP-SA的克隆；將載體pLOXP-SA和pMD18_T_LA 分別用Notl、XhoI雙酶切，凝膠電泳回收相應(yīng)片段，其中pLOXP-SA酶切回收約為9. 9kb的載體大片段，PMD18-T-LA酶切回收約4. 6kb的LA片段，然后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組子，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定最后得到山羊成纖維細(xì)胞MSTN基因打靶載體pLOXP-MSTN ；(3)將打靶載體的線性化后，轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞系，利用含G418的培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選5至10天后，獲得抗性細(xì)胞，提取抗性細(xì)胞克隆DNA進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行基因序列測序以進(jìn)一步驗(yàn)證，獲得MNST基因敲除的山羊胎兒成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山羊Myostatin基因敲除載體的構(gòu)建方法。該方法根據(jù)綿羊Myostatin基因序列，設(shè)計(jì)了兩對PCR引物，以山羊胎兒成纖維細(xì)胞中提取的基因組DNA為模板，采用高保真長片段Taq酶，通過Long-PCR方法來擴(kuò)增獲得同源臂，同源長短臂分別為4.6kb和1.9kb。為驗(yàn)證所得到的同源臂序列是否可用，將擴(kuò)增片段分別克隆到pMD18-T載體上，酶切、PCR鑒定后進(jìn)行序列測定及同源性比較。再將同源長、短臂分別克隆到載體pLOXP，后用酶切、PCR方法進(jìn)行鑒定。篩選得到構(gòu)建含有neo和HSV-tk正負(fù)篩選標(biāo)記基因的MNST基因打靶載體pLOXP-MSTN。本發(fā)明用Long-PCR方法等構(gòu)建Myostatin基因敲除載體，并對山羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得基因敲除細(xì)胞。運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)，可以獲得高瘦肉率動(dòng)物，構(gòu)建MNST基因敲除的山羊模型，為進(jìn)一步研究該基因在山羊中的功能具有重要的意義。
文檔編號C12N15/09GK102586310SQ201210060220
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者任春環(huán), 劉旭光, 劉洪瑜, 張子軍, 程簫, 郭曉飛, 陳家宏, 駱先虎, 黃椏鋒 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)