專利名稱：與衰老相關退行性疾病的線粒體nd3基因snp g10310a分子標記、檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測線粒體ND3基因單核苷酸多態性(SNP)的方法，具體地說是 一種檢測線粒體ND3基因mtDNA 10310位點的SNP的方法以及檢測該位點SNP的試劑盒 和該試劑盒的應用。
背景技術：
健康長壽一直是各國研究的熱點，這是由于長壽老人在衰老的過程中并不患衰 老相關的退行性疾病如中風，心血管疾病，2型糖尿病，帕金森病，老年性癡呆，癌 癥等，而健康的生活。這些衰老相關的退行性疾病不僅給患者帶來沉重的經濟負擔、 影響生活質量，同時由于我國自1998年進入老齡化社會以來，老齡人口占全人口構 成比(10%)在逐年增高，預計到2020年，我國大于60歲的人口將占全人口的27%,所 以也會給社會造成巨大的壓力，將會成為影響我國社會福利和衛生經濟的重大醫學 問題。長壽的機制研究可以為衰老相關疾病的病理機制提供線索并可以預測衰老相 關疾病的發病風險。
與患衰老相關的退行性疾病是受多個遺傳和環境因素影響的一種復雜遺傳性 狀，包括基因之間及基因和環境之間的相互作用。基因和(或)環境通過減少衰老相 關的退行性疾病或減緩衰老來促進長壽。但是影響長壽的確切因素迄今為止尚未闡 明。雙生子研究表明長壽表型25。/。是由遺傳因素決定的(ChristensenK， Johnson TE， Vaupel貝The quest for genetic determinants of human longevity: challenges and insights. Nature, 2006; 7:436-448)。同時，家系分析中也表明百歲老人的 兄弟姐妹的壽命要比一般人群高約4倍(ChristensenK， Johnson TE， Va叩el JW. The quest for genetic determinants of human longevity: challenges and insights. Nature, 2006:7:436-448)。這些研究證明了遺傳因素在長壽的機制中起 到重要作用。并且，在病例對照的關聯研究中發現了與長壽相關的一些遺傳標記， 如4號染色體和一些基因如，AP0E， HLA， mtDNA等。
由于線粒體在細胞中的重要作用及線粒體的突變可以引起衰老相關的疾病 (Audesh Bhat， Anil Koul， Swarkar Shar腿，et al. The possible role of 10398Aand 16189C mtDNA variants in providing susceptibility to T2DM in two North Indian populations: a replicative study. Hum Genet, 2007， 120:821-826.)， 因此線粒體DNA可能在長壽的機制中起到重要的作用。更重要的是衰老相關的疾病多 表現為母系遺傳，這與線粒體DNA的遺傳方式非常相似。這樣，我們推測長壽人群是 遺傳了母親的線粒體DNA，而這些線粒體DNA的表達在功能上可以保護長壽人群不得 衰老相關疾病，從而延長了其壽命。這樣，線粒體DNA變異與衰老相關的退行性疾病 關系正在越來越受到研究者的關注。線粒體是細胞漿中的小細胞器，含有自己的雙 鏈環狀DNA編碼氧化磷酸化過程所需的蛋白及合成這些蛋白所需的tRNA和rRNA。每 一細胞含有數千個線粒體，每個線粒體中含有2-10個DNA，因此，每個細胞中含有數 萬個DNA拷貝。目前進行的與衰老相關的退行性疾病因研究多采用關聯分析方法，已 證明，以SNPs作為基因組標志是有效的。如在日本長壽群體中發現線粒體DNA編碼區 的SNP5178A與長壽相關(Tanaka， M. ， Gong, J. S. ， Zhang, J. ， Yoneda， M., and Yagi， K. Mitochondrial genotype associated with longevity. Lancet,1998:351， 185-186)。此后國內外的許多研究進一步證實了5178A這一突變位點與長壽相關。 隨后也發現了另一些與長壽相關的SNPs如9055A(Ross 0A， McCormack R， Curran MD et al: Mitochondrial DNA polymorphism: its role in longevity of the Irish population. Exp Gerontol 2001; 36: 1161- 1178.)。
SNP是指基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的頻率 需〉1%。 SNPs這種單堿基變化中有70. 1%為同型堿基之間的轉換如G/A或T/C， 29. 1% 為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C (胞嘧啶)是人類基因組中最易發生變化的位點， 因為大多數是甲基化胞嘧啶，能夠自發脫氨基轉換為T (胸腺嘧啶)，SNPs包含了已 知多態性的80-90%，是最常見的遺傳變異。由于生存的選擇壓力導致SNP在單一基因 和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總 數可達3百萬個(Brookes AJ. The essence of SNPs. Gene， 1999; 234: 177- 186.)。 SNPs以其密度高，平均每lkb就有l個；代表性強，位于基因內部的SNPs可能直接影 響蛋白質結構或表達水平；遺傳穩定性好，同微衛星多態性比較而言；易于自動化 分析，因SNPs在人群中為等位基因標記，可簡單以"+/-或1/0"直接分型，成為很好 的遺傳標志(Collins FS， Brooks LD， Chakravarti A. A DNA polymorphismdiscovery resource for research on human genetic variation. Genome Res，
1998;8: 1229-1231)。
服MA技術是基因分型的一種新方法，樣品在聚合酶鏈式反應(polymerase chain
reaction, PCR)擴增后直接進行HRMA ，實現了閉管操作。由于HRMA完全是基于
核酸的物理性質進行分析，無需序列特異性探針，因而HRMA檢測不受突變堿基位
點和種類的局限，所需要的只是在常規PCR基礎上增加一個飽和染料。所以，相比
定量探針法，簡化了操作時間和步驟，大大降低了使用成本。因而H鹿A越來越受
到關注，同時飽和熒光染料的使用也大大減少了非飽和熒光染料對PCR反應的抑制
作用。HRMA與以往分型方法中變性高壓液相色譜(denaturing highpressure liquid
chromatography ， dHPIX)禾口溫度梯度毛細管電泳(temperature-gradient capillary
electrophoresis, TGCE)相同。但是后兩者方法對于一些野生型和純合突變的很難
分型。盡管可以通過一個已知的純合樣本與未知樣本混合，從而形成異源鏈進行分
型，但是這樣會使實驗過程重復兩次，第一次區分雜和與純合變異，第二次將已知
的純合樣本與未知樣本混合，從而使工作更加繁瑣。同時，兩次操作也不能實現閉
管操作，增加PCR產物污染問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種與衰老相關的退行性疾病的線粒體ND3基因分子標
記及檢測該分子標記的方法。
本發明的另一目的在于提供檢測線粒體ND3位點為mtDNA 10310的單核苷酸多態
性的方法及特異性擴增引物。
本發明的再一目的在于提供檢測線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的試劑盒
及該試劑盒的應用。
為實現上述目的，本發明采用以下具體技術方案-
一種與衰老相關的退行性疾病線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記，其DNA序列 如SEQ ID No. l所示。
上述的一種與衰老相關的退行性疾病線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記，其
6中，所述SEQ ID No. 1中第10310位點存在一個分子標記SNP G10310A。
上述的分子標記，其中，所述SEQ ID No. l的第10310位點r為G或A。 本發明所述的一種檢測線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的方法，其特征在
于，其具體步驟如下
(1) 提取基因組DNA;
(2) 線粒體ND3基因單核苷酸多態性識別
制備混合液步驟(1)制備的基因組DNA溶液、PCR緩沖液、dNTP、 Taq DNA聚 合酶、引物、PLUS+飽和熒光染料、Cl寡核苷酸探針和純水；
PCR條件在95。C 5分鐘，95°C l分鐘，63. 5°C 30秒，72°C 10秒，72°C 7分鐘， 進行35個循環；反應完成后，將PCR產物再進行兩個變性和復性的循環，95'C變性30 秒，25。C復性2分鐘，共2個循環；
(3) 將步驟(2)制備的樣本進行高分辨熔解曲線分析。
將步驟(2)制備的樣本進行測序，識別和驗證高分辨熔解曲線分型結果。 該測序為常規方法，由上海生工生物工程技術服務公司提供。該測序結果證實了本 發明高分辨溶解曲線分析方法的準確性。
上述方法中提取基因組DNA的來源可以為離體的體液也可以為組織細胞，無具體限定。
上述的一種檢測線粒體ND3基因單核苷酸多態性的方法，其中所述的提取基因組 DNA的方法為將除去血清的人外周血加入細胞裂解液37'C孵育過夜；然后用Tris 飽和酚提取DNA2次；收集上層水項，加入氯仿和異丙醇混合液抽提l次；收集水項， 加入1/10體積冰醋酸和2. 5倍體積的冰無水乙醇，-2(TC過夜沉淀細胞DNA;然后離心， 加入冷70%乙醇離心1次；使這樣獲得的基因組DNA溶解于TE緩沖液中，然后定量測 定混合物在260nm的吸收率；DNA工作液濃度調整至30ng/ul，置-2(TC冰箱保存。
上述PCR引物為
堿基序歹iJ如SEQ ID No. 2所示的F1: 5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；
堿基序列如SEQ ID No.3所示的Rl: 5'-ttgtagtcactcataggccag-3，。 本發明上述的檢測方法可用于檢測ND3基因mtDNA 10310位點突變情況。 本發明還提供了一種用于檢測線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的特異性引物，其長度為21 23bp，堿基序列如SEQIDNo.2所示的
Fl :5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC- 3，；堿基序列如SEQ ID No.3所示的Rl: 5'-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3'。上述特異性引物可以準確擴增出含有mtDNA 10310 位點的ND3基因序列。
本發明所述的一種檢測上述的線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的方法，該 試劑盒由以下試劑組成、來源如下本發明試劑盒供10人份檢測應用，-2(TC保存
(1) 130ul純水(自制)；
(2) 20ul 10X PCR緩沖液(Takara);
(3) 4ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia);
(4) 20ul lunit/ul Taq DNA聚合酶(Takara);
(5) 2ul lpmol/ulFl引物(自制)；
(6) 2ul 10pmol/ulRl引物(自制)
(6) 20ul lXLCGreen PLUS+飽和熒光染料(Idaho);
(7) 探針2ul 10pmol/ul Cl(自制)；
其中引物F1堿基序列如SEQ ID No. 2所示，R1如SEQ ID No. 3所示;探針C1堿基 序列如SEQ ID No. 4所示。
探針中3'端需要被阻斷，避免其在PC財廣增中的延伸。而3'阻斷通常使用3'-磷 酸化，2'3'-雙脫氧核核苷酸，3'-脫氧核苷酸，3'-3個碳垸基。但3'-3個碳烷基，穩 定性較好。
本發明試劑盒的使用方法-
1) 通過PCR擴增ND3基因，先制備混合液，加入基因組DNA溶液2ul、 2ul 10XPCR 緩沖液、0. 4ul lOraM dNTP、 2 ul Taq DNA聚合酶、分別O. 2ul的Fl和Rl為正義引物 和反義引物，2ul LCGreen PLUS+飽和熒光染料，0.2ul的Cl探針。接著，加入純水， 使總體積為20ul。反應在95。C5分鐘，95。Cl分鐘，63.5。C30秒，72。C10秒，72°C7 分鐘，進行35個循環。
2) 反應完成后，將PCR產物再進行兩個變性和復性的循環，95'C變性30秒，25°C 復性2分鐘，共2個循環。然后將樣本在Lightscanner TM HR-1 96儀中進行熔解曲線 分析。通過儀器以0.3C/秒的速度從5(TC升溫到98'C，獲得樣品的熔解曲線。
83)多態性分型根據樣品的熔解曲線，如果為G，熒光信號隨溫度升高首先開 始下降，如果為A，熒光信號隨溫度升高而后開始下降。
上述的一種檢測線粒體ND3基因單核苷酸多態性的試劑盒可用于預測衰老相關 的退行性疾病的應用。當檢測結果基因型為A時，受試者與衰老相關的退行性疾病關
系不大；如果基因型為G時，受試者與衰老相關的退行性疾病可能有一定的遺傳關系，
可做進一步檢測或者適當注意改變不良的生活習慣。
上述與衰老相關的退行性疾病為中風、心血管疾病、2型糖尿病、帕金森病、 老年性癡呆和/或癌癥。
本發明引物設計是根據劍橋參考序列提供的人類線粒體基因組全序列(輕鏈)
Genbank: REFSEQ AC—000021.2 gi:115315570 (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi db=nucleotide&val=11531
5570)，在第10310位為G，其反義鏈為A的突變。
本發明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(如 血液、腹水和尿液)、組織細胞(如肝組織)等，通過提取和純化這些樣品可制備 基因組DNA。
從基因組DNA中，可擴增含ND3基因突變點的DNA片段，以獲得用于測定的大量 樣本。這種通過擴增含ND3基因突變點的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材 料。例如，可按PCR方法，使用引物進行擴增，此引物經合理設計以便僅擴增含ND3 基因多態性的部分。本發明特異性引物為本發明的發明點之一，該引物本領域技術 人員可經常規制備引物的方法制備。待擴增區的堿基長度不受限制。當按本發明所 述制備引物時，可獲得適宜的測定樣品，其作為擴增的DNA片段，并具有特異性長度。
冊MA技術的主要的原理主要是依據雜合異源雙鏈的形成。在PCR反應前加入飽 和熒光染料，在一定的溫度范圍內將PCR擴增產物進行變性，使DNA雙鏈逐漸解鏈， 此時熒光染料分子逐漸從DNA雙鏈上脫落，熒光信號會下降。如果某個體是雜合突變， 該個體的PCR產物中會形成雜合異源雙鏈及不配對的堿基對，那么該樣品在溫度逐漸 升高的時候會首先發生解鏈，其熒光信號首先開始下降，而此時的純合個體的樣品 由于解鏈溫度較高，熒光信號沒有下降或者下降的較慢，lightscanner儀器通過光學檢測熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據曲線準確區分野生型、雜合突變、
純和突變。
進行高分辨熔解曲線分析時，釆用未標記探針法即利用不等量的引物進行非對 稱PCR反應，在PCR產物中除了雙鏈DNA外，還存在一條與探針雜交的過量單鏈DNA， 通過在一定的溫度范圍內進行變性，使得與單鏈DNA不完全配對(形成異源雙鏈)的 探針先解鏈，完全配對的探針后解鏈的原理，進行探針區域的SNPs分型。這種方法 可以克服以往小擴增子法的局限性，將兩種純合子準確分型。此探針序列的3'端需 要加3個碳烷基修飾，以避免其在PCR反應中的延伸。
因此，本發明根據PCR方法擴增的所需DNA片段，通過上述合理引物，探針得以 設計。光學檢測熒光信號變化產生溫度熔解曲線證實，它們顯示不同的熔解曲線。 根據在上述方法中獲得的熔解曲線，可測定mtDNA G10310A單核苷酸多態性。
在進行本發明的分子標記檢測時，優選使用用于測定根據mtDNA G10310A單核 苷酸多態性的突變類型存在的試劑，檢測試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對 應于用于測定mtDNAG10310A單核苷酸多態性突變類型的方法。特定的試劑按采用的 測定方法來適當地選擇。試劑的特征是，組成測定由mtDNAG10310A單核苷酸多態性 定義的突變類型的手段是必要的，如，DNA片段或高分辨熔解曲線分析。試劑，例如 特定制備的用于PC財廣增步驟的引物，該步驟用于包含高分辨熔解曲線分析單核苷酸 多態性的突變點的特定擴增片段，不被認為是本發明診斷試劑的必要成分，它們也 包含于本發明的診斷試劑之中。
本發明的優點和有益效果是
本發明提出了一種新的線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記可以作為檢測與衰 老相關的退行性疾病應用。本發明所提供的檢測ND3的SNP方法，為一種生物學的檢 測方法，與現有檢測方法相比較，具有顯著的進步，如本發明方法對于樣本沒有特 殊的限制，無論是體液和組織細胞均可作為本發明檢測樣本，使得檢測方便簡捷； 本發明所設計的特異性引物對待擴增區的堿基長度無嚴格要求，通過本發明特異性 引物可獲得本發明所述的PCR產物并進行高分辨熔解曲線的分析；本發明在PCR反 應前加入飽和熒光染料，lightscanner儀器通過光學檢測熒光信號變化并繪制溫度 熔解曲線，根據曲線可以準確區分野生型、雜合突變、純和突變。本發明與現有技術相比操作簡便，檢測成本低廉，且檢測結果準確，具有很好的應用價值和市場價值。
本發明為一種生物學的基因位點檢測方法，與現有檢測方法比較有顯著的效 果，本發明檢測目的為得知mtDNAG10310A單核苷酸多態性，其檢測結果可以為與衰 老相關的退行性疾病預測提供中間信息，但并不能作為最終確定或者預測與衰老相 關的退行性疾病患病依據，因此本發明并不是疾病的診斷和治療方法。
上述內容已經充分的說明了本發明的技術方案和有益效果，下面結合附圖和具 體實施方式對本發明作進一步敘述，以使公眾對發明內容有更深入的了解，具體實 施方式的實施例均為最佳的技術方案，而并非對本發明的限制。


圖l為ratDNA G10310A的基因分型數據圖；圖中顯示不同的基因型隨溫度改變形 成不同熔解曲線，黑色曲線為基因型A，灰色的曲線為基因型G。
圖2為PCR-直接測序法所得的多核苷酸序列結果經生物信息學比對后識別線粒 體NDl基因mtDNA G10310A SNP標記。
圖3-l和3-2為本發明方法檢測結果由PCR-直接測序法驗證圖；線粒體ND3基因 mtDNA G10310A基因位點使用本專利試劑盒基因型分型結果與DNA測序結果一致。
具體實施例方式
用于下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下。
需要時，用高壓鍋(12(TC, 20分鐘)滅菌
EDTA:乙二胺四乙酸二鈉市售
SDS:十二烷基硫酸鈉市售
TE緩沖液30ug/mlRNaseA， lOmmol/LTris-HC1 p朋.0， lmmol/L EDTA 10PCR 緩沖液100mM Tris—HCl(pH8. 3)， 500mM KC1， 15mM氯化鎂(MgC12)0. 01% (W / V) 白明膠自制
dNTP:脫氧核苷三磷酸市售 實施例l:血液樣本收集和基因組DNA的提取 一、樣本選擇
入戶調査廣西巴馬地區的長壽老人，年齡》90歲。意識清楚，生活自立，能
11配合檢査，無心腦血管疾病，老年癡呆，帕金森氏癥，癌癥等衰老相關的退行性疾 病，共372例。記錄所有受試者的基本信息并由本人或親屬簽署知情同意。這一研究 也得到了本單位倫理委員會批準。 二、制備基因組DNA
在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5ml受試者外周血在2500rpm，離心分離30分鐘 除去血清。接著加入5ral細胞裂解液(含10mmol/L Tris-HCl pH8. 0， 10mmol/L EDTA pH8. 0， 15mmo1/ L Nacl， 0. 4 % SDS， 0. lmg/ml蛋白酶K) 37。C孵育過夜。然后用Tris 飽和酚(P朋.0)5ml提取DNA2次(12000r/min， 10min)。收集上層水項，加入5ml氯仿 和異丙醇(24: 1)混合液抽提l次(離心12000r/min， 10min)。收集水項，加入1/10 體積3M冰醋酸和2.5倍體積的冰無水乙醇，—2(TC過夜沉淀細胞DNA。然后離心 12000r/min， 30min，加入冷70%乙醇lml洗l次(離心12000r/min， 10min)。使這樣 獲得的基因組DNA溶解于TE緩沖液中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率。DNA 工作液濃度調整至30ng/ul，置-2(TC冰箱保存。 實施例2: SNP的識別確定
本發明采用朋MA和PCR測序技術同時對G10310A位點(其等位位點對為C/T)進行檢測。
一. 特異性引物如下
Fl: 5'-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；(SEQ ID NO. 2) Rl: 5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，(SEQ ID NO. 3)
二. 通過PC財廣增G10310A附近部分片段；制備混合液加入上述實施例l制備基因組 DNA溶液2ul、 2ul 10X PCR緩沖液、0. 4ul 10mM dNTP、 2 ul Taq DNA聚合酶、分別 0. 2ul的Fl和Rl為正義引物和反義引物，2ul LCGreen PLUS+飽和熒光染料，0. 2ul的 Cl探針。接著，加入純水，使總體積為20ul。反應在95"C5分鐘，95"C1分鐘，63. 5°C 30秒，72"C10秒，72'C7分鐘，進行35個循環。反應完成后，將PCR產物再進行兩個 變性和復性的循環，95。C變性30秒，25。C復性2分鐘，共2個循環。
三. 通過將樣本在Lightscanner TM服-I 96儀中進行熔解曲線分析。儀器以O. 3C/ 秒的速度從5CrC升溫到9『C,獲得樣品的熔解曲線。如圖1所示，圖l為mtDNAG10310A 的基因分型數據圖；根據樣品的熔解曲線，如果為G，熒光信號隨溫度升高首先開始下降，如果為A，熒光信號隨溫度升高而后開始下降。圖譜中黑色曲線代表mtDNA 10310A;灰色曲線代表為ratDNA 10310G。
上述實施例結果驗證
利用PCR-直接測序法將實施例1制備的樣本進行DNA測序，識別和驗證實施例2 高分辨熔解曲線分型結果。該測序為常規方法在此不贅述，該測序由上海生工生物 工程技術服務公司提供。該測序結果證實了本發明高分辨溶解曲線分析方法的準確 性。如圖2所示，為PCR-直接測序法所得的多核苷酸序列結果經生物信息學比對后識 別線粒體ND3基因mtDNA G10310A SNP標記；如圖3-l和3-2所示，圖3-l和3-2為本發 明方法檢測結果由PCR-直接測序法驗證圖；線粒體ND3基因mtDNA 10310基因位點使 用本專利試劑盒基因型分型結果與DNA測序結果一致。 實施例3: mtDNA 10310單核苷酸多態性與與衰老相關的退行性疾病的相關
一、 統計方法利用STATA8. O和SPSSll. O軟件中Pearson卡方檢驗計算mtDNA 10310 單核苷酸多態性的攜帶者頻率，進行連續校正和單側漸近概率分析，統計學的顯著 性水平設定為P〈0. 05。釆用單因素Logistic回歸分析計算長壽的風險OR值及其95yo 可信區間(CI)。
二. 結果
1. 健康人mtDNA 10310單核苷酸多態性分布
按實施例1和2的方法測定了384個健康人(年齡《60歲)的基因多態性。316人在第 10310位堿基有G多態性(82.3%) ， 68人有A的多態性(17.7%)。
2. 健康老人(無與衰老相關的退行性疾病者，年齡^90歲)mtDNA 10310單核苷酸多 態性分布
按實施例1和2的方法測定上述老人的基因多態性。282人在第10310位有G堿基多態性 (75.8%),發現90人有A堿基多態性(24.2%)。
3. 健康老人組和健康對照組比較
比較健康老人組和健康對照組mtDNA 10310單核苷酸多態性的頻率分布，詳見表l。
13表l mtDNA 10310單核苷酸多態性(SNP)頻率風險性在 健康老人組和健康對照組的比較
樣本數攜帶者基因型(％)
AG
長壽組 37290 (24.2)282(75.8)
對照組 38468(17.7)316 (82.3)
Yates X24.807
P0.028
OR1. 483
(95%CI)(1. 041-2. 112)
由表l可見，mtDNA第10310位的常見SNP位點的G等位位點，即在其DNA互補鏈上 為C等位位點，當突變為A時，在健康老人群體中的分布頻率大大高于對照群體中的 頻率，相差約6%，有顯著性差別(P=0.028)。而且OR值反映位點A的頻率在健康老 人人群中高出正常人1.483倍，95y。CI下限〉1，均表明這是與健康衰老相關的一個等 位基因。G10310A位于ND3基因，其表達產物為NADH脫氫酶(復合體I)亞單位3，該 突變為同義突變，該突變可能在功能上通過影響DNA的序列和空間結構，影響了DNA 的轉錄等，從而影響線粒體功能。
實施例4:檢測試劑盒
本發明試劑盒供10人份檢測應用，保存溫度為-2(TC，包括
130ul純水；
20ul 10X PCR緩沖液;
4ul 10mM dNTP混合液;
20ul lunit/ul Taq DNA聚合酶;
2ul lpmol/ulFl引物(SEQ ID No. 1);
2ul 10pmol/ulRl引物(SEQ ID No. 2);
20ul lXLCGreen PLUS+飽和熒光染料；
探針2ul 10pmol/ul Cl (SEQ ID No. 3)。引物序列為
Fl: 5,-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，； (SEQ ID NO. 2) Rl: 5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，(SEQ ID NO. 3) 探針序列為
CI: (SEQ ID NO: 4)
5 ， - AC A ACTA ACCTACCACTA ATAGTTATGTC ATCC-C3- 3 ， 本試劑盒經PCR-服MA檢測后，可輕易檢測出第10310位的G—A的SNP。 本發明具有實用性的例證
1. 本發明的mtDNA 10310單核苷酸多態性的檢測方法，可用于分析人線粒體的ND3 基因上的常見SNP的A等位位點，應用對個體是否與衰老相關的退行性疾病有關系進 行考察，以利于開展早期干預和生活習慣的改進。
2. 利用本發明闡述mtDNA 10310堿基變異，作為生物標志物之一，可用作藥物設 計的分子靶標的篩選，促進老年相關疾病新藥開發。
3. 本發明建立的檢測mtDNA 10310單核苷酸多態性的核酸序列和相關位點，可高 靈敏度，特異性地應用于長壽基因檢測用的試劑盒。
如上所述，得出結論，mtDNA單核苷酸多態性在第10310位堿基的多態性與衰老 相關的退行性疾病有顯著相關性。
本發明敘述了與衰老相關的退行性疾病相關的新突變點，并提供了一種測定 mtDNA 10310單核苷酸多態性的方法。而且，根據本發明，只需要少量DNA樣品就足 以測定mtDNA 10310單核苷酸多態性的多態性。
按照1990年前后死亡水平的估算表明，80歲老人活到100歲以上高壽的平均概率 分別為0.65%。如此稀少的人有可能活到100歲高壽，充分說明，與一般人群相比， 長壽老人比較有可能攜帶有利于老齡健康的基因，根據概率計算可知本實驗所抽樣 結果代表約6萬群體的抽樣結果，具有可行性和準確性，符合統計學標準，可用于其 他地區其他人群的檢測。序列表
<110>衛生部北京醫院
〈120〉與衰老相關退行性疾病的線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記、檢測方法及
試劑盒
〈130> G60> 4
<170> Patentln version 3. 5
〈210> 1 <211> 133 〈212> DNA <213>人工序列 〈400〉 1
atttgatcta gaaattgccc tccttttacc cctaccatga gccctacaaa caactaacct 60 rccactaata gttatgtcat ccctcttatt aatcatcatc ctagccctaa gtctggccta 120 tgagtgacta caa 133
<210〉 2 〈211〉 23 〈212〉 DNA 〈213〉 人工序列 <400〉 2
atttgatcta gaaattgccc tcc 23
〈210〉 3 <211〉 21 <212〉 DNA
16<213〉人工序列 <400〉 3
ttgtagtcac tcataggcca g 21
〈210〉 4 <211〉 33 <212> DNA <213> 人工序列 〈400〉 4
acaactaacc taccactaat agttatgtca tcc 3權利要求
1、一種與衰老相關的退行性疾病線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記，其特征在于，DNA序列如SEQ ID No.1所示。
2、 根據權利要求1所述的與衰老相關的退行性疾病線粒體ND3基因SNP G10310A 分子標記，其特征在于，所述SEQ ID No. 1中第10310位點存在一個分子標記SNP G103亂
3、 根據權利要求2所述的與衰老相關的退行性疾病線粒體ND3基因SNP G10310A 分子標記，其特征在于，所述SEQ ID No. 1的第10310位點為G或A。
4、 一種檢測權利要求2所述的線粒體ND3基因SNPG10310A分子標記的方法，其特 征在于，其具體步驟如下(1) 提取基因組DNA;(2) 線粒體ND3基因單核苷酸多態性識別制備混合液步驟(1)制備的基因組DNA溶液、PCR緩沖液、dNTP、 Taq DNA聚 合酶、PCR引物、PLUS+飽和熒光染料、寡核苷酸探針和純水；PCR條件在95。C 5分鐘，95°C l分鐘，63. 5°C 30秒，72°C 10秒，72°C 7分鐘， 進行35個循環；反應完成后，將PCR產物再進行兩個變性和復性的循環，95'C變性30 秒，25r復性2分鐘，共2個循環；(3) 將步驟(2)制備的樣本進行高分辨熔解曲線分析。
5、 根據權利要求4所述的一種檢測權利要求2所述的線粒體ND3基因SNP G10310A 分子標記的方法，其特征在于，所述PCR引物為堿基序列如SEQ ID No. 2所示F1:5 ，- ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3';堿基序列如SEQ ID No. 3所示的R1: 5 ，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3'。
6、 一種檢測權利要求2所述的線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的特異性引 物，其特征在于，其長度為21 23bp，堿基序列如SEQ ID No.2所示的F1:5 ， - ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3';堿基序列如SEQ ID No. 3所示的R1: 5 ， 一 TTGTAGTCACTCA丁AGGCCAG—3 ，。
7、 根據權利要求6所述的特異性引物，其特征在于，所述的特異性引物可以擴 增出含有mtDNA10310位點的ND3基因序列。
8、 一種檢測權利要求2所述的線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的試劑盒， 其特征在于，該試劑盒由以下試劑組成(1) 130ul純水；(2) 20ul 10X PCR緩沖液;(3) 4ul 10mM dNTP混合液；(4) 20ul lunit/ul Taq DNA聚合酶;(5) 2ul lpmol/ul Fl引物；(6) 2ul 10pmol/ul Rl引物；(7) 20ul lXLCGreen PLUS+飽和熒光染料，(8) 探針2ul 10pmol/ul Cl;其中引物F1堿基序列如SEQ ID No.2所示，R1如SEQ ID No. 3所示；探針C1堿基 序列如SEQ ID No. 4所示。
9、 權利要求8所述的檢測線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的試劑盒用于預 測衰老相關的退行性疾病的應用。
10、 根據權利要求9所述的檢測線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記的試劑盒 的應用，其特征在于，所述衰老相關的退行性疾病為中風、心血管疾病、2型糖尿 病、帕金森病和/或老年性癡呆。
全文摘要
本發明公開了一種與衰老相關的退行性疾病線粒體ND3基因SNP G10310A分子標記，其特征在于，DNA序列如SEQ ID No.1所示。及該分子標記的檢測方法以及檢測該位點SNP的試劑盒和該試劑盒的應用。本發明方法對于樣本沒有特殊的限制，無論是體液和組織細胞均可作為本發明檢測樣本，使得檢測方便簡捷；本發明所設計的特異性引物對待擴增區的堿基長度無嚴格要求，通過本發明特異性引物可獲得本發明所述的PCR產物并進行高分辨熔解曲線的分析；在PCR反應前加入飽和熒光染料，lightscanner儀器通過光學檢測熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據曲線可以準確區分野生型、雜合突變、純和突變。本發明操作簡便，檢測成本低廉，且檢測結果準確，具有很好的應用價值和市場價值。
文檔編號C12Q1/68GK101532058SQ20091008237
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月15日 優先權日2009年4月15日
發明者鋼 萬, 潔 馮, 雷 唐, 放 孔, 張建佚, 澤 楊, 靜 陳, 齊科研 申請人:衛生部北京醫院