專利名稱：一種竹蟶總科線粒體coiii基因的擴增引物的制作方法
技術領域：
本發明設計了竹経總科線粒體細胞色素c氧化酶亞基III (cytochrome c oxidaseIII ；C0III)基因的擴增引物。
背景技術：
竹経總科(Solenidea)隸屬于屬軟體動物門(Mollusca),雙殼綱(Bivalvia),異齒亞綱(Heterodonta)，在世界各地的海域均有分布。竹蟶總科中有許多我國重要的經濟貝類，例如縊蟶、大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶等，其均具有個體大、肉質鮮美、營養豐富等特點。近年來由于過度采捕、棲息地萎縮以及海洋環境的日益惡化，，這些經濟種類的資源量逐年下降，需要采取有效措施保護這些自然資源，因此近年來許多竹蟶總科重要經濟種類的人工 育苗研究已經開始進行。物種鑒定是種質資源保護和人工育苗工作的前提和基礎，然而由于竹蟶總科許多種類的貝殼外部形態的高度相似性，特別是在稚貝、幼貝階段單純憑借形態特征很難區分，這就需要借助分子手段對物種進行鑒定。近年來，利用分子技術對物種進行分類和系統發育分析已成為一種有效的方法，其中線粒體COIII基因由于具有較高的進化速率已成為區分物種和研究物種進化關系的一種理想基因。因此，利用COIII基因對竹蟶總科各種類進行物種鑒定和系統發育分析是一種很好的方法，但目前國際上沒有擴增竹蟶總科COIII基因通用引物的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種竹蟶總科線粒體COIII基因的擴增引物，它能滿足現有技術的上述需求。本發明根據竹蟶總科物種COIII基因序列變異度較高和非特異性擴增引物擴增效率低的特性，通過比對竹蟶總科不同物種COIII基因序列設計出兼并擴增引物。采用本發明的竹蟶總科線粒體COIII基因的擴增引物，可以有效的擴增出竹蟶總科不同物種的COIII基因序列，其中包括該總科中我國所有的重要經濟種類，填補了竹蟶總科COIII基因沒有通用擴增引物的空白，對于利用COIII基因序列研究竹蟶總科的物種分類、保護竹蟶總科種質資源、開展竹蟶總科各重要經濟貝類的人工育苗都具有重要意義。
具體實施例方式本發明的竹蟶總科物種COIII基因的擴增引物的篩選方法共分兩個步驟a、以先前測得的竹蟶總科三個物種的線粒體基因組全序列中COIII基因的序列為基礎，通過比對找出COIII基因相對保守的序列片段，設計兼并引物；b、將合成的兼并引物對竹蟶總科物種COIII基因進行擴增，檢測其在竹蟶總科中的通用性和擴增效率。下面結合實施例對本發明作進一步說明I.樣品采集于2008年 2012年，從中國沿海共采集竹蟶總科7個種類的210個個體。
2. DNA提取用苯酚-氯仿法對所采集樣品進行DNA提取。3.數據來源先前研究中獲得了竹蟶總科三個物種(縊蟶、大竹蟶、長竹蟶)的線粒體基因組全序列，并將數據上傳美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)。(Genbank 登錄號分別為纟益経 JN398366,大竹経 HQ703012,長竹経JN786377)。4.序列比對利用BioEdit軟件將三個物種的線粒體基因組全序列中COIII基因的序列進行比對，找出比較保守、堿基變異度最小的序列片段。5.引物合成根據上述的比對結果，利用引物設計軟件Primer5在堿基變異度最小的序列片段設計出I對兼并擴增引物。引物序列為C0III-600F
ATGTCffCGAACKGGffTATCAT 3’ ；C0III-600R :5’CCATGAAADCCAGTTATYACA 3’。6.引物擴增將上述擴增引物分別應用于PCR擴增所采集的竹蟶總科7個種類的 210個個體。設置PCR熱循環退火溫度范圍為40°C 60°C。7.擴增結果檢測擴增產物用I. 5倍的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果顯示，該引物可以有效地擴增竹蟶總科線粒體COIII基因，擴增效率達95%以上。利用此對引物擴增出的DNA片段長度約為600bp。8.特異性擴增引物擴增條件上述C0III-600F與C0III-600R擴增引物的10 μ LPCR反應體系為I μ L 10 X buffer, I μ L Mgcl2 (25mM), O. 8 μ L dNTP (2mM)，I μ L 引物C0III-600F(10yM)，lyI^|*C0III-600R(10yM)，0.05yL rTaq 酶(5u/ μ L), I μ L DNA模板(IOOng)，4. 15 μ L雙蒸水。PCR熱循環的退火溫度為50°C。
權利要求
1.一對用于竹蟶總科貝類線粒體部分COIII基因序列擴增的引物COIII-6OOF和C0III-600R, 其特征是用10 U I PCR體系在特定的PCR擴增條件下進行目標片段擴增。
2.如權利要求I所述的泥蚶線粒體部分COIII序列擴增的引物，其特征是 C0III-600F :5’ATGTCWCGAACKGGWTATCAT 3’ ；C0III-600R:5’ CCATGAAADCCAGTTATYACA 3’。
3.如權利要求I所述的10ill PCR體系，其特征為I ii L 10 X buffer, I u LMgcl2 (25mM) ,0. 8 u L dNTP (2. 5mM)，I y L 引物 C0III-600F (10 y M)，I y L 引物C0III-600R(10uM),0. 05 u L rTaq 酶(5u/ u L), I U L DNA 模板(IOOng) ,4. 15 y L 雙蒸水。
4.如權利要求I所述的特定的PCR擴增條件，其特征為94°C預變性3分鐘，94°C變性45秒，50°C退火溫度45秒，72°C延伸I分鐘，共35個循環，最后72°C延伸5分鐘。
全文摘要
一種竹蟶總科線粒體COIII基因的擴增引物，其特征是a、將三個竹蟶總科物種的線粒體基因組全序列中COIII基因的序列進行比對序列用BioEdit比對分析，確定其保守區域；b、在保守區域內用Primer Premier 5設計兼并引物并合成；c、提取竹蟶總科物種的DNA，將設計的引物在相應反應體系下進行PCR擴增；d、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測其擴增效率。采用本發明的竹蟶總科線粒體COIII基因的擴增引物，可以有效的擴增出竹蟶總科不同物種的COIII基因，對于利用COIII基因序列研究竹蟶總科的物種分類、保護竹蟶總科種質資源、開展竹蟶總科各重要經濟貝類的人工育苗都具有重要意義。
文檔編號C12N15/53GK102766622SQ20121019267
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者孔令鋒, 李琪, 遠洋 申請人:中國海洋大學