專利名稱：：一種平菇多糖的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種平菇多糖的制備方法，尤其是一種采用發酵法生產平菇多糖的方法。
背景技術：
：平菇側耳屬一類真菌的總稱,是古今中外著名的保健食用菌之一。平菇多糖是從平菇中提取、分離、純化的^種多糖，能促進蛋白質、核酸的合成，提高機體生物免疫力。目前平菇多糖主要從子實體中提取，人工栽培平菇周期長，從中提取多糖工藝不容易控制，且成本高、產量低。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡便、設備投入小的平菇多糖的制備方法，使其生產胞外多糖時，在發酵罐內實現連續發酵，延長發酵時間，簡化操作流程，提高多糖得率。為解決上述技術問題，本發明采用下列技術方案(1)斜面菌種活化將平菇菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24'C恒溫培養5-10天；馬鈴薯汁綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，馬鈴薯汁20%，瓊脂2.0%。培養天數優選為8天。(2)搖瓶種子培養三角瓶內裝種子培養基，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養4-6天；搖瓶種子培養基的配方為玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%,酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.0051搖瓶種子培養的條件為25'C下，搖床轉速150r/min，搖瓶裝液量為三角燒瓶總容量的2/5,培養液初始pH值為6.0-7.0。(3)液體深層發酵將搖瓶種子接入裝有培養基的發酵罐發酵，接種量1-10%,發酵溫度為28-3(TC，發酵時進行通氣攪拌；液體深層培養基的配方為玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素Bl和維生素B2各0.005%。液體深層發酵的條件為pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1，v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至發酵結束，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。(4)連續發酵液體深層發酵60-75小時后將發酵液強制循環，通過0.2ym的微孔濾膜，濾過速度控制在1個發酵罐體積/小時，在穩態下連續排放濾液，母液回流至發酵罐重復使用，同時以泵連續輸入新鮮液體培養基，保持發酵罐內物料的體積恒定，維持罐內的發酵條件，整個過程維持30小時，結束發酵，收集所有濾液，發酵罐內殘余的發酵液離心后收集上清液與上述濾液合并，即得總發酵液；(5)超濾膜分離并濃縮將上述總發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/8-1/3;(6)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4。C靜置12-24小時，收集沉淀，洗滌干燥，即得。與從子實體中提取多糖工藝相比，從深層發酵液中提取平菇多糖具有縮短生產周期，減少生產占地面積，嚴格控制生產條件，生產過程受自然條件影響少等優點。在發酵后期，罐內多糖存在反饋抑制現象當濃度升高到一定程度，生物體多糖的合成與外排將受到抑制；同時，發酵液中己經生成的多糖^K會被生物體消耗。這時，將發酵液在密閉穩態的條件下通過膜分離裝置，固體菌絲體被截流在反應器內繼續利用，而多糖則隨著發酵液被排出，在濾過的同時補充新鮮培養液到反應器內，這樣就降低了發酵液中多糖的濃度，打破反應平衡，促進生物體的發育和代謝產物的轉化，實現連續發酵，延長發酵時間，同時減少反應后期生物體對多糖的消耗，提高代謝物的產率。連續發酵生產與間歇發酵生產相比的優勢通過下述試驗體現試驗例1連續發酵與間歇式發酵多糖產量的比較1、試驗方法1.1單級發酵工藝(1)斜面菌種活化將平恭菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24'C恒溫培養8天。所選馬鈴薯綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀O.1%,硫酸鎂O.05%，馬鈴薯汁20%,瓊脂2.0%。(2)搖瓶種子培養50ml三角瓶內裝種子培養基20ml，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養5天；種子培養基配方玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。搖瓶種子培養的條件為25'C下，搖床轉速150r/min，培養液初始pH值為6.0-7.0。(3)單級發酵培養5L發酵罐培養將搖瓶種子接入裝有2L培養基的發酵罐發酵，接種量為1%，發酵的條件為發酵溫度為28-3(TC;pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h,通氣量為1:1，v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至放罐前，通氣量控制在1.2:1，v/v/m,攪拌速度為180r/m。培養基配比玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%,維生素Bl和維生素B2各0.005%。放罐標準:菌絲球上浮1/3，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌，共發酵時間70小時。發酵結束后，將發酵液離心，收集上清液。(4)超濾膜分離并濃縮將上述發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/5。(5)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4'C靜置18小時，收集沉淀，洗滌干燥，稱重。1.2多級間歇式發酵工藝(1)斜面菌種活化將平菇菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24'C恒溫培養8天。所選馬鈴薯綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂O.05%，馬鈴薯汁20%，瓊脂2.0%。(2)搖瓶種子培養50ml三角瓶內裝種子培養基20ml，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養5天；種子培養基配方玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。4搖瓶種子培養的條件為25'C下，搖床轉速150r/min，培養液初始pH值為6.0-7.0。(3)二級發酵培養5L發酵罐培養將搖瓶種子接入裝有2L培養基的發酵罐發酵，接種量為1%，發酵的條件為發酵溫度為28-3(TC;pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1，v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至轉罐前，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。培養基配比玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%，維生素Bl和維生素B2各0.005%。放罐標準菌絲球上浮1/3，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌，共發酵時間70小時。50L發酵罐發酵培養將種子接入裝有20L培養基的發酵罐發酵，接種量為10%,發酵的條件為發酵溫度為28-30°C;PH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為l:1，v/v/m,攪拌速度為150r/m;24h至放罐前，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。培養基配比玉米粉3%，淀粉1%,麩皮IV酵母1%,磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。放罐標準發酵時間40小時，菌絲球上浮1/2，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌。發酵結束后，將發酵液離心，收集上清液。(4)超濾膜分離并濃縮將上述發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/5。(5)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4'C靜置18小時，收集沉淀，洗漆干燥，稱重。2.1.3連續發酵工藝(1)斜面菌種活化將平菇菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24'C恒溫培養8天。所選馬鈴薯綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀O.1%,硫酸鎂O.05%，馬鈴薯汁2(m，瓊脂2.0%。(2)搖瓶種子培養50ml三角瓶內裝種子培養基20ml，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養5天；~種子培養基配方玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。搖瓶種子培養的條件為25'C下，搖床轉速150r/min，培養液初始pH值為6.0-7.0。(3)液體深層培養將搖瓶種子接入裝有2L培養基的發酵罐發酵，接種量為1%,發酵的條件為發酵溫度為28-30°C;pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1，v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至轉罐前，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。培養基配比玉米粉3%，淀粉1%,麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。(4)連續發酵液體深層發酵70小時后將發酵液強制循環，通過0.2ym的微孔濾膜，濾過速度控制在1個發酵罐體積/小時，在穩態下連續排放濾液，母液回流至發酵罐重復使用，同時以泵連續輸入新鮮液體培養基，保持發酵罐內物料的體積恒定，維持罐內的發酵條件，整個過程維持30小時，結束發酵，收集所有濾液，發酵罐內殘余的發酵液離心后收集上清液與上述濾液合并，即得總發酵液；(5)超濾膜分離并濃縮將上述總發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/5。(5)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4'C靜置18小時，收集沉淀，洗滌干燥，稱重。2.2試驗結果試驗結果見表2表2三種發酵方式發酵時間和產量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>試驗結果表明，采用連續發酵生產平菇多糖,可延長在單級發酵罐內的發酵時間，產量約是同等條件下單級發酵的6倍；在總發酵時間少于間歇式發酵時間的情況下，產量高于后者,可以減少設備投入，簡化工藝流程，降低生產成本。下面將結合具體實施方式對本發明做進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。具體實施方式實施例1(1)斜面菌種活化將平菇菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24X:恒溫培養8天。所選馬鈴薯綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀O.1%,硫酸鎂O.05%,馬鈴薯汁20%，瓊脂2.0%。(2)搖瓶種子培養50ml三角瓶內裝種子培養基20ml，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養5天；種子培養基配方玉米粉3%,淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。搖瓶種子培養的條件為25。C下，搖床轉速150r/min，搖瓶裝液量為三角燒瓶總容量的2/5，培養液初始pH值為6.5。(3)液體深層培養將搖瓶種子接入裝有2L培養基的5L發酵罐發酵，接種量為1%，發酵的條件為發酵溫度為28-30'C;pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1,v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至結束，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。培養基配比玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%,酵母W，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。(4)連續發酵液體深層發酵70小吋后將發酵液強制循環，通過0.2nm的微孔濾膜，濾過速度控制在1個發酵罐體積/小時，在穩態下連續排放濾液，母液回流至發酵罐重復使用，同時以泵連續輸入新鮮液體培養基，保持發酵罐內物料的體積恒定，維持罐內的發酵條件，整個過程維持30小時，結束發酵，收集所有濾液，發酵罐內殘余的發酵液離心后收集上清液與上述濾液合并，即得總發酵液；(5)超濾膜分離并濃縮將上述總發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/5。(6)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4'C靜置1R小時，收集沉淀，冼滏于燥，即得244.6g平菇多糖。實施例2(1)斜面菌種活化將平燕菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24t:恒溫培養5天。所選馬鈴薯綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%,磷酸二氫鉀O.1%,硫酸鎂O.05%，馬鈴薯汁20%，瓊脂2.0%。(2)搖瓶種子培養-50ml三角瓶內裝種子培養基20ni1,滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養4天；種子培養基配方玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。搖瓶種子培養的條件為25'C下，搖床轉速150r/min，搖瓶裝液量為三角燒瓶總容量的2/5，培養液初始pH值為6.0。(3)液體深層培養將搖瓶種子接入裝有2L培養基的5L發酵罐發酵，接種量為10%，發酵的條件為發酵溫度為28-30°C;pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1，v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至結束，通氣量控制在1.2:1，v/v/m,攪拌速度為180r/m。培養基配比..玉米粉3%,淀粉1%，麩皮1%，酵母1%,磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。(4)連續發酵液體深層發酵60小時后將發酵液強制循環，通過0.2ym的微孔濾膜，濾過速度控制在1個發酵罐體積/小時，在穩態下連續排放濾液，母液回流至發酵罐重復使用，同時以泵連續輸入新鮮液體培養基，保持發酵罐內物料的體積恒定，維持罐內的發酵條件，整個過程維持30小時，結束發酵，收集所有濾液，發酵罐內殘余的發酵液離心后收集上清液與上述濾液合并，即得總發酵液；(5)超濾膜分離并濃縮將上述總發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/3。(6)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4'C靜置12小時，收集沉淀，洗漆干燥，即得144.4g平菇多糖。實施例3(1)斜面菌種活化將平菇菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24'C恒溫培養10天。所選馬鈴薯綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂O.05%，馬鈴薯汁20%，瓊脂2.0%。(2)搖瓶種子培養50ml三角瓶內裝種子培養基20ml，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養6天；種子培養基配方玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%,酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。搖瓶種子培養的條件為25。C下，搖床轉速150r/min，搖瓶裝液量為三角燒瓶總容量的2/5,培養液初始pH值為7.0。(3)液體深層培養將搖瓶種子接入裝有2L培養基的5L發酵罐發酵，接種量為5%，發酵的條件為發酵溫度為28-30'C;pH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1，v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至結束，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。培養基配比玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。(4)連續發酵液體深層發酵75小時后將發酵液強制循環，通過0.2um的微孔濾膜，濾過速度控制在1個發酵罐體積/小時，在穩態下連續排放濾液，母液回流至發酵罐重復使用，同時以泵連續輸入新鮮液體培養基，保持發酵罐內物料的體積恒定，維持罐內的發酵條件，整個過程維持30小時，結束發酵，收集所有濾液，發酵罐內殘余的發酵液離心后收集上清液與上述濾液合并，即得總發酵液；(5)超濾膜分離并濃縮將上述總發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/8。(6)醇沉加入3倍體積量的95%乙醇至上述濃縮液，0-4。C靜置24小時，收集沉淀，洗滌干燥，即得153.5g平菇多糖。8權利要求1、一種平菇多糖的制備方法，其特征在于所述的方法包含下列步驟(1)斜面菌種活化將平菇菌種移接至馬鈴薯汁綜合培養基斜面上，24℃恒溫培養5-10天；(2)搖瓶種子培養三角瓶內裝種子培養基，滅菌，冷卻后接斜面母種，振蕩培養，共培養4-6天；(3)液體深層發酵將搖瓶種子接入裝有培養基的發酵罐發酵，接種量1-10％，發酵溫度為28-30℃，發酵時進行通氣攪拌；(4)連續發酵液體深層發酵60-75小時后將發酵液強制循環，通過0.2μm的微孔濾膜，濾過速度控制在1個發酵罐體積/小時，在穩態下連續排放濾液，母液回流至發酵罐重復使用，同時以泵連續輸入新鮮液體培養基，保持發酵罐內物料的體積恒定，維持罐內的發酵條件，整個過程維持30小時，結束發酵，收集所有濾液，發酵罐內殘余的發酵液離心后收集上清液與上述濾液合并，即得總發酵液；(5)超濾膜分離并濃縮將上述總發酵液通過分子量截留值為4000的超濾膜進行超濾，排除濾液，循環操作，直至濃縮液的體積降至原來的1/8-1/3；(6)醇沉加入3倍體積量的95％乙醇至上述濃縮液，0-4℃靜置12-24小時，收集沉淀，洗滌干燥，即得。2、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的馬鈴薯汁綜合培養基含有下列重量體積百分比的物質葡萄糖2.()%，磷酸二氫鉀O.1%，硫酸鎂0.05%，馬鈴薯汁20%，瓊脂2.0%。3、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的斜面菌種活化恒溫培養的時間為8天。4、根據權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述的搖瓶種子培養基和液體深層培養基含有下列重量體積百分比的物質玉米粉3%，淀粉1%，麩皮1%，酵母1%，磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%，維生素B1和維生素B2各0.005%。5、根據權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述的搖瓶種子培養的條件為25'C下，搖床轉速150r/min，搖瓶裝液量為三角燒瓶總容量的2/5，培養液初始pH值為6.0-7.0。6、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的液體深層發酵的條件為PH變化范圍在5.5-7.0;培養前期24h，通氣量為1:1,v/v/m，攪拌速度為150r/m;24h至發酵結束，通氣量控制在1.2:1，v/v/m，攪拌速度為180r/m。全文摘要本發明涉及一種操作簡便、設備投入小的平菇多糖的制備方法，工藝步驟包括斜面菌種活化、搖瓶種子培養、液體深層發酵、連續發酵、超濾膜分離并濃縮、醇沉。采用本發明制備平菇多糖，可在發酵罐內實現連續發酵，延長發酵時間，簡化操作流程，提高多糖得率。文檔編號C12P19/00GK101492705SQ20091011621公開日2009年7月29日申請日期2009年2月19日優先權日2009年2月19日發明者范淦彬,高廣印申請人:亳州市亳廣中藥飲片有限公司