專利名稱：一種由西洋參果實發酵培養制備皂甙類化合物的方法
一種由西洋參果實發酵培養制備皂甙類化合物的方法
一背景技術：
本發明涉及一種細胞發酵培養方法，具體地說是一種利用西洋參果實汁液細胞發酵培養 制備皂甙類化合物的方法。
二背景技術：
人類對植物次生代謝物質的利用有著悠久的歷史，當今對植物次生代謝物質的研究更是 如火如荼。但植物次生代謝物質的產量受植物產量和次生代謝物含量的限制，有些次生代謝 物質在自然界的含量甚微，從而局限了植物次生代謝物質的廣泛應用。隨著生物技術長足進 步，人們把目光聚集在如何利用生物技術以獲取植物次生代謝物質的研究方法上來。為此， 相關研究領域的科學家們開始不懈的探索和試驗，經過近幾十年的研究發現，通過植物細胞 的規模培養可以實現植物次生代謝物質高效生產。
通過植物細胞的大規模培養，生產植物次生代謝物較從天然植物中提取，及人工仿生合 成的化合物，更具有其獨特的優點-
(一) 不破壞自然資源。
(二) 不受地域、季節、土壤、病蟲害等自然條件限制。
(二)與人工合成相比，細胞培養工藝、設備簡單；節約能源；產業投資少；生產過程中 兒乎沒有環境污染，對生產者安全性高。
(四) 與利用植物體提取生物活性物質相比，細胞培養方法，生產周期短、細胞個體差異 小、生長過程可以人工控制、代謝過程可以人為合理調節，有利于降低成本、提高效率。
(五) 對于某些天然產物經修飾后，可以產生藥效更好的物質，也可以通過此技術獲得結 構復雜的修飾物前體。
(六) 對于分泌到胞外培養液中的生物活性物質，規模生產更方便。規模化生產在這方面 的研究及成果應用比較多，如，我國學者羅士韋采用液體懸浮培養人參細胞，產率可日增一 倍，而培養物中總人參皂甙含量高達10.5%，超過人工栽培人參的皂甙含量(9.6%)，每立方 米培養液可獲干參13. 98公斤。日本Uitsui公司通過對紫草細胞培養生產出尚無法人工合 成的紫草素，培養細胞的產率為天然細胞產率的1000倍，現在日本紫草來源主要是細胞組 織培養。另外，紫杉醇、長春花堿等許多植物次生代謝產物在生產上均已取得較大的成績， 有的培養規模可達萬噸以上。這些實驗及實踐證明，親本植株能合成的次生代謝物質都可以 通過植物細胞的培養方式來生產，因而，被認為這是一條利用生物技術生產次生代謝物質(如藥物、天然色素、香料、天然調味品)的新的有效途徑。
西洋參(尸awox《wz'"gweyb/iwm Zi"". 英文名American Ginseng)屬五力口禾斗(Jra/z'aceae)
人參屬(尸a"ox)多年生草本，和中國人參(尸朋ax G/"^rg C. A Me"r)屬同一祖先不同 的新種及變種。西洋參又稱花旗參，美國參，原產于北美洲的加拿大南部的安大略(Ontario), 魁北克(Quebec),蒙塔利爾(Montreal)及美國北部的威斯康星洲(Wisconsin),生長在茂 密的原始森林中。人們(尤其是亞洲人)對西洋參的喜愛主要是原于它的藥用和保健作用， 是我國的傳統中藥。其中，西洋參皂甙是被公認為人參和西洋參的主要活性成分。在我國傳 統醫藥中主要有鎮定、安神、止驚、解熱等多種藥理作用。在增強免疫、改善記憶、抑制癌 細胞生長、雙向免疫調節和調節內分泌等多種活性作用。現代藥理研究證明，西洋參全身所 有器官中均含有皂甙類化合物。傳統藥用主要是根部，而葉、莖、花、果實作為"廢棄物"。 目前國內對皂甙類化合物研究比較深入，少數單體在抗腫瘤方面具有特殊作用。并且， 在醫藥上已經廣泛應用，在功能食品開發方面越來越受到重視。除了利用它的生理活性外， 也把它作為功能食品的添加劑。目前，市場對皂甙類化合物需求量增長迅速，而目前的生產 方式又不能滿足市場的需求。
發明內容
本發明旨在為人們提供--種可供藥用的西洋參皂甙，所要解決的技術問題是利用西洋參 果實汁液細胞中原有皂甙，在酶的誘導下實現規模化制備皂甙類化合物。
本發明的技術方案以西洋參果實為原料，包括培養基的配置、殺菌、種子培養、發酵培 養以及分離和提取，所述的培養基配制就是將西洋參果實汁液600 800ml、葡萄糖60 80g、 硫酸銨l 3g，稀釋至1升的培養液并調pH值3 4作為培養基；所述的種子培養就是將葡 萄酒酵母菌接種到上述培養基中誘導培養母種，使母種酵母菌數》107個/1111;所述的發酵培 養就是將母種接到上述培養基中發酵培養，培養結束后分離、提取皂甙類化合物；種子培養 和發酵培養的工藝條件是暗培養，溫度26 29'C、時間不少于6天，培養系統能通透C02 氣體。
優選每升培養基中含西洋參果實汁液650 700ml、葡萄糖65 70g、硫酸銨1 3g、單 寧含量低于lg/L， pH值3.2 3.5。
本發明以西洋參果實為原始材料，獲取西洋參果汁，并且調配適宜的營養成分作為酵母 培養基；同時，選擇優良葡萄酒酵母菌進行擴大培養，從而建立生產皂甙類化合物的培養體 系。設計了相應的生長、生產培養基配方。該方法有培養周期短、效率高、對環境無污染等 特點。本發明較已有技術相比具有如下優點
(1) 生產過程完全可控，不受自然環境的影響
(2) 無農藥及重金屬殘留；
(3) 提取工藝簡單；
(4) 低成本，節約大量耕地，提高資源利用率和西洋參的綜合經濟價值。
(5) 生產效率高每1000ml培養液中，含干物質70-97g，可提取分離西洋參總皂甙6-9g。
四

附圖所示是西洋參總皂甙薄層層析分析圖。
圖中1、標準樣品；2、果實；3、發酵液；4、西洋參莖梗
五具體實施例方式
現以實驗室培養為例，非限定實施例敘述如下
1、 培養基的配制、殺菌
取充分成熟西洋果實，破碎，去除種子，連同果肉、果皮及汁液650 700ml，葡萄糖 65 70g、硫酸銨1 3g、然后用蒸餾水稀釋至1升。用檸檬酸調pH值到3. 2 3. 5。
用亞硫酸或S02殺菌。采用滴加、攪拌方法，使得亞硫酸或S02加入果汁后均勻一致， 達到殺菌效果。
2、 種子培養
將葡萄酒酵母菌接種到培養基中，于27 28t:下暗培養誘導培養母種，直至母種酵母 菌數達到>107個/1111，培養系統能通透C02氣體。
3、 發酵培養
將母種接到培養基中進行發酵培養，溫度27 28'C、暗培養不少于6天，培養系統能 通透C02氣體。培養結束后分離、提取皂甙類化合物。
4、 分離提取西洋參皂甙
發酵原液首先用50-70%乙醇提取，提取液脫溶回收乙醇后用水飽和的正丁醇萃取，萃 取液脫溶回收正丁醇后用丙酮沉淀，低溫下沉淀完全后過濾，用水溶解，上大孔樹脂柱層析 柱分離，用50-70%乙醇洗脫，洗脫液回收乙醇得到分離物經干燥后分析測定西洋參皂甙。
權利要求
1、一種西洋參果實發酵培養制備皂甙類化合物的方法，包括配制培養基、殺菌、種子培養、發酵培養以及分離和提取，其特征在于所述的種子培養是將葡萄酒酵母接種到液體培養基中培養誘導酵母菌形成母種，母種酵母菌數≥107個/ml，然后將母種接種到液體培養基中進行發酵培養；種子培養和發酵培養均為暗培養，溫度26～29℃、時間不少于6天；所述的液體培養基為每升培養基中含西洋參果實汁液600～800ml、葡萄糖60～80g、硫酸銨1～3g、pH值3～4。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的液體培養為每升培基中含西 洋參果實汁液650 700ml、葡萄糖65 70g、硫酸銨1 3g、單寧含量低于lg/L， pH值3. 2 3.5。
全文摘要
一種西洋參果實發酵培養制備皂甙類化合物的方法，包括配制培養基、殺菌、種子培養、發酵培養以及分離和提取，其特征是首先將葡萄酒酵母接種到液體培養基中培養誘導酵母菌形成母種，母種酵母菌數≥10⁷個/ml，然后將母種接種到液體培養基中進行發酵培養；種子培養和發酵培養均為暗培養，溫度26～29℃、時間不少于6天；所述的液體培養基為每升培養基中含西洋參果實汁液600～800ml、葡萄糖60～80g、硫酸銨1～3g、pH值3～4。本方法建立了生產皂類化合物培養體系，而且周期短、效率高、對環境無污染。
文檔編號C12P33/20GK101619340SQ20091014450
公開日2010年1月6日 申請日期2009年8月13日 優先權日2009年8月13日
發明者丁之恩, 平 嚴 申請人:安徽農業大學