專利名稱：：利用sts引物鑒定人參品種的方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用序列標簽位點(SequenceTaggedSite,STS)引物鑒定人參品種的方法，更詳細地，本發明涉及用于鑒定天豐、連豐、高豐、金豐和仙豐5個人參品種的STS核酸標記因子的開發，還涉及基于人參的堿基序列信息來制備STS引物、而后使用這些引物分析品種間的顯性遺傳從而明確區分各人參品種的方法。
背景技術：
：已報道的世界人參屬的植物有約12種以上，其中人參(尸fl"oxg/"^"gC.A.Meyer(Orientalginseng))、西洋參(/!—"i^/b/Z菌L.(Americanginseng))和三七"otog/rae"g(Burkill)RH.Chen(Sanchi))這3種主要作為中藥材來使用。人參在韓國、中國、日本、俄羅斯等地種植，西洋參在美國、加拿大、中國等地種植，三七主要在中國種植，很早以前人參就被用于預防和治療各種疾病，最近隨著人參的抗氧化作用、抗疲勞、抗癌等多種功能不斷被報道，人參的種植不僅存在于人參的主產地亞洲和北美洲，而且在歐洲和大洋洲也在種植人參。在韓國，人參的種植主要依靠地域傳統品種紫莖人參，但是KT&G(舊韓國人參煙草研究院)開發了體形優秀、數量或者人參皂苷含量高、抗病蟲害的天豐、連豐、高豐、金豐、仙豐等人參品種，并且這些人參的種植以最先的農戶為中心呈擴大的趨勢。這些被開發的品種可以由育種專家根據地上部分的形態特征(果實顏色、莖的顏色、出芽期等)來區別，但是不可能區分作為主要利用部位的根，因此可能會引起由外國產原參及制品冒充國產人參而導致的流通市場混亂、以及由人參種植時品種間混雜而導致的純度下降4等國內外深刻的社會問題。最近在國外，對于國家主要關心作物(黃瓜、西紅柿、油菜、小麥等)，以品種區分、穩定性檢測及品種保護為目的，正在開發核酸標記因子；在韓國也在稻子等主要作物、辣椒等蔬菜作物、菌類、牛等各種領域里進行著關于核酸標記因子開發的研究；但是目前為止，韓國僅將依靠分子技術的蘑菇的顯性遺傳認定為品種審査的法定程序DUS(distinctness,uniformity,stability)(區別性、一致性、穩定性)測試的特性項目。作為鑒定人參品種的手段，在DNA水平上進行了開發標記物的研究，主要利用隨機擴增多態性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、簡單序列重復間區(intersimplesequencerepeat,ISSR)、內轉錄間隔區(internaltranscribedspacer,ITS)等的任意的引物試圖區分在韓國培育的品種，但是這些技術在品種間區分上顯示出了局限性。本發明人報道的文獻[In&Kimetal(2005)，GeneticrelationshipsofspeciesbyRAPDandISSRanalyses,KoreanJournalofMedicinalCropScience,13，249-253]中，雖然也以人參品種天豐、連豐、高豐、仙豐、金豐和國內外收集品種紫莖人參、黃果人參、mimaki(辦t色)、石柱參、竹節參(iVapom'cus)、西洋參為對象，利用RAPD和ISSR技術分析了它們之間的遺傳關系及顯性遺傳，但是利用這些技術區分人參品種很困難。這些技術是利用任意引物，實驗結果的重現性低，即使能尋找到種間多態性，也在遺傳信息的獲得上有缺陷，因此不適合用于需要保證區別性、一致性和穩定性的品種鑒定。另一文獻[Yangetal(2001)，ComparisonofITSand5.8SrDNAsequencesamongvarietiesandcultivarsingzVwe"g，JournalofPhotoscience,8，55-60]中，比較分析了人參品種天豐、連豐和收集品種紫莖人參、青莖人參、黃果人參的ITS和5.8SrDNA堿基序列，黃果人參顯示了區別于其它品種的單核苷酸多態性(Singlenucleotidepolymorphidm)。另外，本發明人的文獻[Kim&Bangetal(2007)，Molecularauthenticationofginsengcultivarsbycomparisonofinternaltranscribedspacerand5.8SrDNAsequences,PlantBiotechnologyReport,1,163-167]中報道了，經能識別人參品種天豐、連豐、高豐、仙豐、金豐和國內外收集品種紫莖人參、黃果人參、mimakiCl叫"l)、石柱參、竹節參、西洋參的ITS和5.8SrDNA堿基序列的單核苷酸多態性部位的限制性內切酶TaqI處理后，比較分析它們的顯性遺傳，只有高豐和金豐能區分于其它人參品種及國內外收集品種。但是，僅用這些方法的缺點是難以明確區分開發的人參品種。韓國特許登錄第10-0215084號公開了根據RAPD標記的人參產地的鑒定方法以及此方法中使用的引物，韓國特許公開第2004-0034331號公開了利用單核苷酸多態性來鑒定山參和種植人參的方法，韓國特許登錄第10-0610312號公開了人參的種間基因鑒定試劑盒，但是這些方法中使用的引物對與本發明的引物對不同。
發明內容本發明的目的是為了解決利用任意引物的RAPD、ISSR技術和分析堿基序列保守的rDNA區域的ITS技術所具有的區別性和一致性不好的問題，以人參標準品種(連豐)的DNA為對象，利用基因克隆和轉化方法構建基因組DNA文庫，選取特定克隆；并以這些克隆為對象進行堿基序列分析，再以這些遺傳信息為基礎制備STS引物；以不同品種人參的樣品為模板，用所述引物進行PCR，結合瓊脂糖凝膠電泳顯示的遺傳模式來區分包括天豐在內的5個主要人參品種，從而提供穩定性和一致性高的品種鑒定系統。為了實現上述目的，本發明提供用于人參品種鑒定的STS(序列標簽位點，SequenceTaggedSite)引物對，該引物對包含選自SEQIDNO:l至8所示的4對引物的一個以上的引物對。并且，本發明提供包含上述引物對的用于鑒定人參品種的試劑盒。并且，本發明提供利用上述引物對來鑒定人參品種的方法。根據本發明，可以利用開發的4種STS引物對將天豐、連豐、高豐、金豐、仙豐5個人參品種通過它們的顯性遺傳而明確區分，因此所述STS引物對能夠作為用以確認品種的核酸標記因子來應用，此種應用將非常有助于國內優秀品種開發者和普及者行使對外知識產權。而且，本發明的方法可以作為基礎技術用于整頓由種植人參時混種和制造加工品時外國產原參冒充國產等引起的流通市場混亂，并且利用本發明的方法可以在培育人參時提高品種的遺傳穩定性(純度)、防止品種混雜，因此本發明的方法也可以應用于向農戶普及高純度種子的工作中。圖1是利用STS引物KGY+0130A，以天豐、連豐、高豐、金豐、和仙豐5個人參品種為對象進行PCR，在瓊脂糖凝膠上確認品種間多態性的電泳圖。泳道M:1Kbp+100bpDNA梯狀分子量標記(ElpisBiotech),泳道1:天豐(Chunpoong)，泳道2:連豐(Yunpoong)，泳道3:高豐(Gopoong)，泳道4:金豐(Kumpoong)，泳道5:仙豐(Sunpoong)。圖2是利用STS引物KGY+0183A，以天豐、連豐、高豐、金豐、和仙豐5個人參品種為對象進行PCR,在瓊脂糖凝膠上確認品種間多態性的電泳圖。泳道M:1Kbp+100bpDNA梯狀分子量標記(ElpisBiotech)，泳道l:天豐(Chunpoong)，泳道2:連豐(Yunpoong),泳道3:高豐(Gopoong)，泳道4:金豐(Kumpoong)，泳道5:仙豐(Sunpoong)。圖3是利用STS引物KGY+0110A，以天豐、連豐、高豐、金豐、和仙豐5個人參品種為對象進行PCR，然后用限制性內切酶HinfI處理PCR產7物，在瓊脂糖凝膠上確認品種間多態性的電泳圖。泳道M:1Kbp+100bpDNA梯狀分子量標記(ElpisBiotech),泳道l:天豐(Chunpoong)，泳道2:連豐(Yunpoong),泳道3:高豐(Gopoong)，泳道4:金豐(Kumpoong)，泳道5:仙豐(Sunpoong)。圖4是利用STS引物KGY-0074，以天豐、連豐、高豐、金豐、和仙豐5個人參品種為對象進行PCR，然后用限制性內切酶HinfI處理PCR產物，在瓊脂糖凝膠上確認品種間多態性的電泳圖。泳道M:1Kbp+100bpDNA梯狀分子量標記(ElpisBiotech),泳道1:天豐(Chunpoong)，泳道2:連豐(Yunpoong)，泳道3:高豐(Gopoong)，泳道4:金豐(Kumpoong)，泳道5:仙豐(Sunpoong)。圖5是判斷在圖1至4中確認的等位基因的差異，從而綜合表示5個品種的顯性遺傳的圖。具體實施例方式為了達到本發明的目的，本發明提供用于人參品種鑒定的STS(序列標簽位點，SequenceTaggedSite)寡核苷酸引物對，該寡核苷酸引物對包含選自SEQIDNO:l至8所示的4對引物的一個以上的引物對。。上述寡核苷酸引物對可以分別是由SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的序列內的16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上的連續核苷酸的片段組成的寡核苷酸。并且，上述寡核苷酸引物對可以分別是由SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的序列內的16個以上、17個以上、18個以上、19個以上的連續核苷酸的片段組成的寡核苷酸。并且，上述寡核苷酸引物對可以分別是由SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的序列內的16個以上、17個以上、18個以上、19個以上的連續核苷酸的片段組成的寡核苷酸。并且，上述寡核苷酸引物對可以分別是由SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的序列內的16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上、21個以上的連續核苷酸的片段組成的寡核苷酸。根據本發明的一個實施例的寡核苷酸引物對是用于人參品種鑒定的STS(序列標簽位點)引物對，該引物對選自由SEQIDNO:l和2所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO:3和4所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO:5和6所示的寡核苷酸引物對、及SEQIDNO:7和8所示的寡核苷酸引物對組成的組中。根據本發明的一個實施例的寡核苷酸引物對是用于人參品種鑒定的STS引物對，該引物對優選包括SEQIDNO:為1和2所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO:為3和4所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO:為5和6所示的寡核苷酸引物對、以及SEQIDNO:為7和8所示的寡核苷酸引物對。如果同時利用4個引物對就可以較容易和正確地辨別人參品種。上述人參品禾中可以為天豐(Chunpoong)、連豐(Yunpoong)、高豐(Gopoong)、金豐(Kumpoong)、仙豐(Sunpoong)。本發明的用于人參品種鑒定的STS引物對可以來源于人參(尸a"axg/"M"gC.A.Meyer)。本發明的引物對以標準品種(連豐)為對象，利用基因克隆方法構建基因組(Genomic)DNA文庫，選取特定克隆，并以這些克隆為對象進行堿基序列分析，再以這些遺傳信息為基礎制備STS引物。如上所述，構建了所謂"活性基因組區域富集的半基因組DNA文庫(activegenomeregion-enrichedsemi-genomicDNAlibrary)"，通過該過程選取了特定大小(0.61.3kb)的克隆，基于分析克隆的堿基序列得到的遺傳信息制備了多種STS引物。本發明首次公開了根據上述方法提供的STS引物。利用制備的引物以不同品種人參的樣品為模板進行PCR，然后觀察在瓊脂糖凝膠電泳上顯示的遺傳多態性，由此選出了顯示品種間多態性的2種STS引物對(KGY+0130A，KGY+0183A)。而且以上述PCR產物為對象，經6種限制性內切酶處理來確認品種間多態性，由此利用另外2種STS引物對(KGY+0110A,KGY-0074)觀察到了品種間多態性。如上所述，利用根據本發明的4種STS核酸標記因子就能明確地區分出迄今為止無法區分的韓國的5個人參品種，因此本發明的方法可作為品種鑒定的基礎技術來應用。本發明中，"引物，，指與需要復制的核酸鏈互補的單鏈寡核苷酸序列，引物可以作為合成延伸產物的起始點。上述引物的長度和序列應該能起始延伸產物的合成。引物的具體長度和序列不僅依賴于所要互補的DNA或RNA標記的復雜度(complexity),還依賴于溫度和離子強度等引物使用條件。本說明書中，作為引物使用的寡核苷酸還可以包含核苷酸類似物(analogue),例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、烷基硫代磷酸酯或者肽核酸(peptidenucleicacid)，或者包含嵌入齊U(intercalatingagent)。為了達到本發明的另一個目的，本發明提供用于鑒定人參品種的試劑盒，該試劑盒包含根據本發明的一個以上的寡核苷酸引物對和進行擴增反應的試劑。上述人參品種可以是天豐(Chunpoong)、連豐(Yunpoong)、高豐(Gopoong)、金豐(Kumpoong)、仙豐(Sunpoong)。本發明的試劑盒中，用于進行上述擴增反應的試劑可以包括DNA聚合酶、dNTPs、緩沖溶液等。并且，本發明的試劑盒可以進一步包含記載最佳反應條件的使用說明書。為了達到本發明的另一目的，本發明提供一種鑒定人參品種的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟從人參樣品中分離基因組DNA;以上述分離的基因組DNA為模板，利用本發明的寡核苷酸引物對進行擴增反應以擴增標記序列；以及檢測上述擴增的產物。本發明的人參品種鑒定方法更具體地涉及天豐等5個主要人參品種的鑒定方法，其特征在于，該方法包括以標準品種(連豐)為對象，利用基因克隆方法構建基因組(Genomic)DNA文庫，選取特定克隆，并分析這些克隆的堿基序列，再以這些遺傳信息為基礎制備STS引物的步驟；使用制備的引物以不同品種人參的DNA樣品為模板進行PCR，將產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳后分析種間遺傳多態性的步驟；使用制備的引物以不同品種人參的DNA樣品為模板進行PCR，并將產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后在用多態性條帶(monomorphicband)確認的情況下，經Alul等共6個限制性內切酶處理，酶切產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳以分析種間遺傳多態性的步驟；以及從上述遺傳分析步驟的結果綜合判斷種間等位基因來鑒別5個人參品種的步驟。本發明的方法包括從人參樣品中分離基因組DNA的步驟。從上述樣品中分離基因組DNA的方法可以利用本領域公知的方法，例如，可以利用CTAB方法，也可以利用WizardPrep試劑盒(Promega公司)。以上述分離的基因組DNA為模板，可以將根據本發明的一實施例的一個以上的寡核苷酸引物對用作引物進行擴增反應，來擴增標記序列。擴增標記核酸的方法有聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(ligasechainreaction)、基于核酸序列的擴增(nucleicacidsequence-basedamplification)、基于轉錄的擴增系纟充(transcription-basedamplificationsystem)、鏈置換矛廣增(stranddisplacementamplification)、或者通過Q|3復制酶(replicase)進行的擴增、或者本領域公知的擴增核酸分子的任意的其他適當的方法。其中，PCR是指利用聚合酶通過與標記核酸特異性結合的引物對來擴增標記核酸的方法。這樣的PCR方法在本領域內眾所周知，也可以使用商購的試劑盒。本發明的方法中，上述人參品種可以為天豐(Chunpoong)、連豐(Yunpoong)、高豐(Gopoong)、金豐(Kumpoong)、仙豐(Sunpoong)。本發明的方法中，上述擴增的標記序列可以用可檢測的標記物來標記。在一個實施例中，上述標記物可以是具有熒光、磷光或者放射性的物質，但是不限于此。優選上述標記物為Cy-5或者Cy-3。進行PCR擴增標記序列時，在引物的5'-端標記Cy-5或者Cy-3，擴增產物就能夠被可檢測的熒光標記物標記。并且也可以利用放射性物質進行標記，在進行PCR時將P"或者S35等放射性同位素添加到PCR反應液中，在合成產物的時候放射性同位素就會混入擴增產物中使擴增產物標記上放射性。為了擴增標記序列，利用如上所述的一個以上的寡核苷酸引物對。本發明的方法包括檢測上述擴增產物的步驟。上述擴增產物可以通過DNA芯片、凝膠電泳、放射性檢測、熒光檢測或者磷光檢測等方法進行檢測，但是不限于此。凝膠電泳可以作為一種檢測擴增產物的方法。進行凝膠電泳時，可以根據擴增產物的大小而使用瓊脂糖凝膠或者丙烯酰胺凝膠電泳。對于熒光檢測方法，如果進行PCR時在引物的5'-端標記Cy-5或者Cy-3，擴增產物就能夠被可檢測的熒光標記物標記，這樣被標記的擴增產物可以利用熒光檢測器進行測定。并且，對于放射性檢測方法，在進行PCR時將P32或者S"等放射性同位素添加到PCR反應液中標記擴增產物后，可以利用放射性檢測器(例如蓋格計數器(Geigercounter)或者液體閃爍計數器(liquidscintillationcounter))來檢測擴增產物的放射性。以下，通過實施例詳細說明本發明。但是，下述實施例只是舉例說明本發明，而不是限制本發明的內容。實施例實施例1將從農村振興廳作物科學院人參藥草研究所的人參圃場種植的標準品種連風的嫩葉中提取的DNA(l嗎)用對甲基化不敏感的限制性內切酶SpeI切害U。將切割產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用PCR產物回收試劑盒(Qiagen)回收DNA后，與準備好的pGEM—7zf(Promega)連接。將連接的混合物通過電穿孔轉化到具備野生型McrA和BC基因的大腸桿菌(Stratagene)中，構建了所謂"活性基因組區域富集的半基因組DNA文庫(activegenomeregion-enrichedsemi-genomicDNAlibrary)",由此得到了共2,039個克隆。實施例2委托Solgent(舎^且)株式會社對得到的克隆進行堿基序列分析。以分析的堿基序列為基礎合成STS引物，上述得到的克隆大小為0.6kb1.3kb，共343個克隆，由此制備了共262對STS引物對。實施例3為了觀察人參品種間多態性而進行的PCR反應的混合物(50^1)的組成如下人參的基因組DNA20ng、各引物0.4|iM、dNTPs250(iM、10xPCR反應緩沖溶液(75mMTris-HCl(pH9.0)、2.5mMMgCl2、15mM(NH4)2S04、BSA100pg/ml)、0.5單位DNA聚合酶、剩余為蒸餾水。為了有效利用合成的STS引物對，并抑制非特異性擴增產物的過度出現，在5565'C的退火溫度范圍內進行PCR后測定了合理的引物Tm值。結果確定PCR反應條件為使模板DNA在95'C預變性5分鐘；然后，在95'C變性30秒、在65'C退火30秒、以及在72。C延伸1分鐘，反復進行共40個循環；最后，在72"C延伸5分鐘，得到特異性擴增產物。利用制備的STS引物以天豐、連豐、高豐、金豐和仙豐5個人參品種的DNA為模板進行PCR后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認品種間多態性。另外，如果進行PCR后觀察到了多態性DNA條帶，那么為了確認多態性，經AluI13等共6個限制性內切酶處理后進行電泳，通過lOObp大小的分子量標記來確定切割產物的大小，并記錄，使用限制性內切酶之前預先指定擴增產物中的"靶條帶(targetband)"。只有切割產物的大小之和與該靶條帶完全一致時，才進行分析，從而與缺乏重現性的切割次要條帶(minorband)而顯示的多態性加以區分。實驗結果，選取了能夠鑒定5個人參品種的4個STS引物對(KGY+0130A、KGY+0183A、KGY+0110A、KGY-0074)，其中2個引物對(KGY+0130A、KGY+0183A)進行PCR后再進行瓊脂糖凝膠電泳，結果經確認觀察到了品種間多態性，其余2個引物對(KGY+0110A、KGY-0074)，在用HinfI限制性內切酶處理PCR產物的多態性條帶(monomorphicband)時顯示了多態性。由圖1可知，利用KGY+0130A引物進行PCR時，在約370bp大小處有天豐、高豐、金豐的DNA擴增產物，將此表示為顯性遺傳A，在約320bp大小處有連豐和仙豐的DNA擴增產物，將此表示為另一顯性遺傳B，顯示了多態性。在圖2中，利用KGY+0183A引物進行PCR時，在約250bp大小處有天豐的DNA擴增產物，將此表示為顯性遺傳A，在約280bp大小處有連豐和仙豐的DNA擴增產物，將此表示為顯性遺傳B，在約220bp大小處有高豐的DNA擴增產物，將此表示為顯性遺傳C，在約300bp大小處有金豐的DNA擴增產物，將此表示為顯性遺傳D，顯示了多態性。此外，在圖3中，用Hinfl限制性內切酶處理PCR產物時，由于天豐和高豐具有HinfI限制性內切酶識別位點，因此觀察到420bp和80bp大小的被切割的兩個DNA條帶，表示為顯性遺傳A，由于連豐、金豐、仙豐中沒有該限制性內切酶的識別位點，因此觀察到了500bp大小的DNA條帶，將此表示為顯性遺傳B，顯示了多態性。在圖4中，用HinfI限制性內切酶處理PCR產物時，由于天豐和仙豐沒有HinfI限制性內切酶識別位點，因此觀察到90bp大小的DNA條帶，表示為顯性遺傳A，由于連豐、高豐、金豐中具有該限制性內切酶的識別位點，因此觀察到了50bp和40bp大小的被切割的兩個DNA條帶，表示為顯性遺傳B，顯示了多態性。綜合上述內容如圖5表示，天豐的顯性遺傳為AAAA、連豐的顯性遺傳為BBBB、高豐的顯性遺傳為ACAB、金豐的顯性遺傳為ADBB、仙豐的顯性遺傳為BBBA，顯示了多態性。，關于此4種選取的引物的堿基序列和Tm值的信息在表1中記載，結論為通過利用共4種STS引物對得到的顯性遺傳，能夠確切區分天豐等5個人參品種。表1.本發明的STS引物對<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>F:正向引物，bR:反向引物產業實用性2007年韓國的人參種植面積為17，831公頃，生產量為21,819噸，其中新品種約為l，OOO公頃，以小面積種植，其原因是2002年登記了人參新品種天豐，增殖率為10倍，與其他作物相比很低。但是，最近隨著與傳統品種相比新品種的優秀性得到證明，目前新品種的種植面積逐漸增加，預計將來新品種的種植面積會進一步擴大。人參新品種是通過從傳統品種紫莖人參和黃果人參的抽樣對象中選拔培育而成的，遺傳上類似度高，不容易區分，同時通過一貫的識別方法不可能區別新品種，因此目前情況是鑒定技術達不到實用化。為了解決這些問題而開發的4種用于鑒定人參品種的STS核酸標記因子，由于實驗結果的重現性和穩定性高，能明確區分天豐等5個人參新品種，并且本發明的方法是利用PCR和瓊脂糖凝膠電泳可以簡單地區別品種間遺傳的方法，因此本發明的技術轉讓也容易。這樣的鑒定技術能夠馬上應用于以人參為主要作物進行研究的各個農業技術院及農業技術中心，因此可以應用于在農戶中構筑保障純度的人參新品種的早期普及體系。另外，在產業上，本發明在鑒定紅參等原料的正確性的用途方面也有充分的市場性，因此認為本發明還可以作為基礎技術應用于建立由消費者對制品的信賴增加所引起的流通市場秩序。序列表<110>韓國農村振興廳<120>利用STS引物鑒定人參品種的方法<130>I11415KRO<150>KR10-2008-0080459<151>2008-08-18<160>8<170>Kopatentln1.71<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>1ggaaagcgttcagctcttacg21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400〉2taaatgctgtcaagcccagag21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>17<223>正向引物<400>3gaattgaccctttgcctttg<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>4aaagcctacgttagcgcatc<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>5agtccc肌cggaatttcatc<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>6gttttccgcttatgttgcag<210>7<211>22說明書第15/16頁202020<213>人工序列<220><223>正向引物<400>7gcgaatttcacagaattagacg<210>8<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>反向引物<400>8acaggtctcgaaacaattgaag權利要求1.一種用于人參品種鑒定的序列標簽位點引物對，其特征在于，該引物對選自由SEQIDNO1和2所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO3和4所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO5和6所示的寡核苷酸引物對、以及SEQIDNO7和8所示的寡核苷酸引物對所組成的組中。2.根據權利要求1所述的用于人參品種鑒定的序列標簽位點引物對，其中，該引物對包括SEQIDNO:l和2所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO:3和4所示的寡核苷酸引物對、SEQIDNO:5和6所示的寡核苷酸引物對以及SEQIDNO:7和8所示的寡核苷酸引物對。3.根據權利要求1所述的用于人參品種鑒定的序列標簽位點引物對，其中，所述人參品種為天豐、連豐、高豐、金豐、或仙豐。4.根據權利要求1所述的用于人參品種鑒定的序列標簽位點引物對，其中，該引物對來源于人參(尸a"oxg/rae"gC.A.Meyer)。5.—種用于鑒定人參品種的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括權利要求1-4的任意一項中所述的寡核苷酸引物對中的一個以上的引物對，以及用于進行擴增反應的試劑。6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中，所述人參品種為天豐、連豐、高豐、金豐、或仙豐。7.—種鑒定人參品種的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟從人參樣品中分離基因組DNA;以所述分離的基因組DNA為模板，利用權利要求1-4的任意一項中所述的寡核苷酸引物對進行擴增反應，以擴增標記序列；以及檢測所述擴增的產物。8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述人參品種為天豐、連豐、高豐、金豐、或仙豐。9.根據權利要求7所述的方法，其中，通過DNA芯片、凝膠電泳、放射性檢測、熒光檢測、或者磷光檢測來進行所述擴增的產物的檢測。全文摘要本發明涉及一種用于人參品種鑒定的STS(序列標簽位點，SequenceTaggedSite)引物對，包含上述引物對的用于鑒定人參品種的試劑盒，以及利用上述引物對鑒定人參品種的方法。所述用于人參品種鑒定的STS引物對包含選自SEQIDNO1至8所示的4對引物對中的一個以上的引物對。根據本發明，利用4種STS核酸標記因子可以確切地區分人參的5個品種，因此所述核酸標記因子可以作為標記物應用于以品種的知識產權保護為目的的品種確認。文檔編號C12Q1/68GK101654709SQ20091015014公開日2010年2月24日申請日期2009年7月7日優先權日2008年8月18日發明者丁智雄,方景煥,李濟完,車善佑,金永昌,金玉泰申請人:韓國農村振興廳