水仙bes-ssr標記引物tca9及鑒定水仙品種的方法
【專利摘要】本發明涉及水仙BES-SSR標記引物TCA9及鑒定水仙品種的方法，包括水仙BES-SSR標記引物TCA9的設計及合成、水仙基因組總DNA提取、PCR總反應體系建立、PCR擴增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴增產物的檢測鑒定。本發明采用水仙基因組BAC-末端序列開發的水仙BES-SSR標記，具有準確性高、容易判斷，重復性好，不受環境因素的影響，而且譜帶清晰等特點，是一種有效可靠的分子標記，用于水仙種質鑒定，具有取樣量小、操作方便、結果可靠等優點。水仙BES-SSR標記引物TCA9還可用于水仙品種指紋圖譜繪制、遺傳多樣性分析、群居遺傳結構研究和遺傳連鎖圖譜分析等【技術領域】。
【專利說明】水仙BES-SSR標記引物TCA9及鑒定水仙品種的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種BES-SSR標記引物及其用于作物品種鑒定的方法，具體涉及水仙BES-SSR標記引物TCA9及鑒定水仙品種的方法，屬于分子生物學領域。
【背景技術】
[0002]水仙為石蒜科水仙屬i^arcissus L.、多年生球根花丼,大多數原產于地中海沿岸及歐洲中部地區，約有40個原生種和許多變種，據英國皇家園藝學會統計，現約有I萬多個園藝品種，其花色、花姿十分豐富，且部分水仙具宜人的香味，已成為世界各國廣泛栽培的著名觀賞兼藥用花卉。然而，水仙具有夏季休眠特性，每年開花一次，從花型花色方面鑒定周期較長，耗時耗力，其鱗莖和葉型也十分相似，很難從生物學性狀上將其有效地區分開來，對水仙的品種選育及鑒定方面都有著嚴重的影響。
[0003]陳林姣等(2002年)，朱震霞(2003 年)，Tucci 等(2004 年)，Lu Gang 等(2007)，鄭琴芳等(2012年)利用第一代分子標記技術RAPD、ISSR、AFLP對中國水仙及水仙的遺傳多樣性及親緣關系進行了不同程度的分析；Hodgins等(2007年)以歐洲野生黃花水仙為材料，利用富集文庫篩選法得到8個微衛星標記，其操作較為復雜且費用較為昂貴；袁菊紅(2011年)利用得到的10對SSR標記引物對中國石蒜屬遺傳多樣性和親緣關系進行了分析，其實驗材料中涉及中國水仙且擴增出了帶型?，F有的基于水仙屬的分子標記數量了了可見，遠遠不能滿足水仙屬分子生物學的研究，這將嚴重制約了水仙種質資源遺傳多樣性分析的準確性和遺傳圖譜構建的精確性?？梢?，開發新的分子標記鑒定技術，對水仙種質資源遺傳多樣性進 行分析研究，為水仙新品種選育上提供有效的技術支持，在水仙育種及種質鑒定方面有著十分重要的意義。
[0004]但是，現有的第一代分子標記如:擴增的限制性內切酶片段長度多態性標記(amplified fragment length polymorphism, AFLP),第一步需要制備高分子量基因組DNA，然后酶切找到特異片段，實驗程序繁瑣，操作復雜；限制性內切酶片段長度多態性標記(restriction fragment length polymorphism, RFLP),技術難度大，操作復雜,所需 DNA質量高，要經過Southern雜交且需選用單拷貝探針，標記數量少且多態性較低；隨機擴增多態性DNA標記(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)和簡單序列重復標記(inter-simple sequence repeat, ISSR) 二者均為顯性,不能區分是純合還是雜合個體，且RAPD重復性較低，對DNA模板的質量要求很高，而水仙屬植物葉片和鱗莖中含有大量的多糖多酚類物質，這將對DNA提取增加了難度，所以此法不適用于水仙標記分析。
[0005]簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR) 或稱為微衛星DNA(microsatellite DNA),又稱為短串聯重復(short tandem repeats, STR)是指一類由幾個(多為1-6個)堿基組成的基序(motif)串聯而成的DNA序列，為第二代普遍認可的新型分子標記技術，其隨機廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，大約每隔10_50kb的DNA序列中就會出現一個SSR位點。SSR標記具有高度的多態性且分布于整個基因組中，用于檢測簡單易操作，實驗重復性高，所需模版DNA量少，僅需微量組織或者干組織樣品，便于數據比較分析，SSR遵循孟德爾共顯性遺傳模式，能夠區別純合顯性個體和雜合顯性個體等諸多有點。目前SSR標記技術已成為構成遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學、進行分子標記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測、目標性狀分子標記篩選和法醫鑒定的理想工具，已經廣泛應用于擬南芥、大豆、棉花、花生、葡萄、小麥、水稻、番茄、甜菜和油菜等多種植物上。
[0006]目前，開發的SSR標記主要有G-SSR (基因組SSR)和EST-SSR (表達序列標簽SSR)兩種，而現有的水仙EST數據庫中登錄的水仙EST序列還很少，開發SSR標記遠遠不夠，且利用EST序列開發獲得的SSR標記多態性較基因組SSR標記低，因此利用水仙基因組中獲取SSR位點信息，開發基于水仙基因組的SSR標記引物對水仙種質鑒定和遺傳多樣性分析等領域提供有效的標記技術，迫在眉睫。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供了一種水仙BES-SSR標記引物TCA9及鑒定水仙品種的方法。所述水仙BES-SSR標記引物TCA9，是利用水仙BAC-末端序列獲得水仙SSR位點信息TCA9，在其位點兩翼保守區設計特有的SSR標記引物。
[0008]實現本發明目的的技術方案如下:
本發明的水仙 BES-SSR標記引物TCA9，由上游引物TCA9 F和下游引物TCA9 R組成，其核苷酸序列如下:
TCA9 F: 5’-TTCATCACACGGTTCTCTT-3’
TCA9 R: 5’-TAGGGTTTACATTGGGTCAA-3’ 。
[0009]利用本發明的水仙BES-SSR標記引物TCA9鑒定水仙品種的方法，包括水仙基因組總DNA提取、PCR總反應體系建立、PCR擴增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴增產物的檢測鑒定，其特征在于:
1、水仙基因組總DNA提取:利用改良的CTAB法提取水仙基因組總DNA；
2、PCR總反應體系建立:水仙BES-SSR標記引物TCA9BES-SSR-PCR總反應體系20ul:供鑒定的水仙基因組總 DNA 50ng, 10XPCR Buffer 2ul, 10mmol/L dNTPs 0.5ul, lOmmol/L水仙TCA9上下游引物各1.0ul，5U/L Taq DNA聚合酶0.2ul，無菌ddH20 12.8ul ;所述供鑒定的水仙，本發明共提供24份水仙品種樣品；
3、PCR擴增程序:水仙BES-SSR標記引物TCA9BES-SSR-PCR擴增程序:94°C預變性4min，94°C變性 30s, 52°C退火 30s, 72°C 延伸 45s，共 35 個循環，72°C延伸 IOmin, 4°C保存；
4、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件=IXTBE電泳緩沖液，8%(v/v)的聚丙烯酰胺凝膠，在電壓400V,電流IOOmA下電泳3.0h后用銀染法染色，經ImageScanner III凝膠掃描儀掃描保存；所述8%(v/v)聚丙烯酰胺凝膠，即30%(29:1，w/v)丙烯酰胺/雙丙烯酰胺14ml，5 X TBE 10ml，ddH20 26ml, 10% (w/v)過硫酸銨 250ul，TEMED IOOul ;銀染法染色，即 10%(v/v)醋酸固定20min, ddH20沖洗IOmin, 0.2%(w/v)硝酸銀溶液染色30min, ddH20沖洗5s,用含100g/L無水碳酸鈉、2ml/L甲醒和8mg/L硫代硫酸鈉的顯影液顯影；
5、PCR擴增產物的檢測鑒定:利用水仙BES-SSR標記引物TCA9，對24份水仙的樣品進行品種鑒定，于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為238bp的位置出現DNA條帶，則該品種為中國多花水仙金盞銀臺；在分子量為139bp的位置出現DNA條帶，則該品種為中國多花水仙重瓣玉玲瓏；在分子量為237bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Replete ;在分子量為126bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Alltruist ;在分子量為233bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋多花水仙Jetf ire ;在分子量為202bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Tahiti ;在分子量為267bp的位置出現DNA條帶，貝U該品種為西洋裂冠水仙Orangerie ;在分子量為237bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness ;在分子量為270bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋紅口水仙Recurvus ;在分子量為151bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Erlicheer ;在分子量為179bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋三蕊水仙Thalia ;在分子量為130bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Mount Hood ;在分子量為217bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙WhiteFavourite ;在分子量為285bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋長壽花水仙SilverSmiles ;在分子量為127bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Pink Charm ;在分子量為200bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Johann Strauss ;在分子量為300bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Barret Browning ;在分子量為176bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Dutch Master ;在分子量為297bp的位置出現DNA條帶,貝U該品種為西洋大冠水仙Fortissimo ;在分子量為239bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Daydream ;在分子量為21 Ibp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Gay Tabor ;在分子量為141bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋仙客來水仙Tete-a-Tete ;在分子量為269bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Bella Vista ;在分子量為207bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Carlton。 [0010]本發明采用水仙基因組BAC-末端序列，設計獲得的水仙BES-SSR標記引物TCA9，具有重復性好，譜帶清晰，多態性高等特點；用于水仙品種鑒定，結果有效可靠；可以用于水仙種質鑒定、品種指紋圖譜繪制、遺傳多樣性分析、群居遺傳結構研究和遺傳連鎖圖譜分析。
[0011]綜上所述，本發明的水仙BES-SSR標記引物TCA9，具有如下有益效果:
O使用本發明的水仙BES-SSR標記引物TCA9，在水仙品種之間有很好的多態性，且譜帶清晰，穩定可靠；也可以將本發明的水仙BES-SSR標記引物TCA9用于更多的水仙屬植物的種質資源鑒定和遺傳多樣性分析。
[0012]2)本發明的水仙BES-SSR標記引物TCA9，是基于水仙基因組BAC-末端序列開發的，因此多態性更高，在對水仙的種質資源鑒定及遺傳多樣性分析方面可以提供更有效的技術支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是水仙BES-SSR標記引物TCA9對提供鑒定的24份水仙品種的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖。各泳道中，M代表分子量標準；1_24表示24份提供鑒定的水仙品種。
【具體實施方式】
[0014]為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合具體實施例加以說明。[0015]實施例1利用水仙BES-SSR標記引物TCA9鑒定水仙品種的方法
利用水仙BES-SSR標記引物TCA9鑒定水仙品種的方法，包括水仙BES-SSR標記引物TCA9設計及合成、水仙基因組總DNA提取、PCR總反應體系建立、PCR擴增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和水仙品種鑒定。
[0016]1.水仙BES-SSR標記引物TCA9設計及合成:根據水仙BES-SSR位點搜索的結果，設計合成水仙TCA9 BES-SSR的標記引物為:
TCA9 F: 5’-TTCATCACACGGTTCTCTT-3’
TCA9 R: 5’-TAGGGTTTACATTGGGTCAA-3’ 。
[0017]具體方法如下:依據水仙基因組BAC-末端序列，利用SSR Hunter分析軟件(微衛星檢索工具)搜索SSR位點信息，設定參數值:二、三、四、五和六核苷酸基序的最小重復次數分別為7、5、5、5和5次。根據得到的SSR位點信息及其側翼序列(上下游各150bp)篩選并剔除冗余序列。根據水仙BES-SSR位點搜索，篩選得到的水仙SSR位點及其側翼序列，利用Primer Premier 5.0設計每個SSR位點PCR擴增引物，引物設計參數要求:引物長度控制于18bp-24bp，最適長度21bp ;退火溫度48°C -56°C，最適52°C ;上下游引物退火溫度之差不高于3°C ;GC含量35%-60%，最適50% ;水仙BES-SSR-PCR擴增產物預期片段100_400bp。引物設計完成后，送上海鉬尚生物公司合成并得到水仙BES-SSR標記引物TCA9。
[0018]2.水仙基因組總DNA提取
(I)經采樣收集各地水仙共24個品種，每個品種隨機抽取5片靠鱗莖中部幼嫩葉片，用雙蒸水洗凈后剪碎混勻，經液氮處理后保存備用。
[0019](2)采用改良的CTAB法(Stewart等人，1993)提取經上述步驟處理的24份供試水仙品種總DNA，所述24個品種如表2所示。
[0020]表2 24份供鑒定水仙品種及編號
【權利要求】
1.一種水仙BES-SSR標記引物TCA9，由上游引物TCA9F和下游引物TCA9R組成，其特征在于核苷酸序列如下:
TCA9 F: 5’-TTCATCACACGGTTCTCTT-3’
TCA9 R: 5’-TAGGGTTTACATTGGGTCAA-3’ 。
2.利用如權利要求1所述的水仙BES-SSR標記引物TCA9鑒定水仙品種的方法，包括水仙基因組總DNA提取、PCR總反應體系建立、PCR擴增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴增產物的檢測鑒定，其特征在于: (1)水仙基因組總DNA提取:利用改良的CTAB法提取水仙基因組總DNA； (2)PCR總反應體系建立:總反應體系20ul:供鑒定的水仙基因組總DNA 50ng，IOXPCRBuffer 2ul, 10mmol/L dNTPs 0.5ul，lOmmol/L 水仙 TCA9 上下游引物各 1.0ul，5U/L TaqDNA聚合酶0.2ul，無菌ddH20 12.8ul ;所述供鑒定的水仙，本發明共提供24份水仙品種樣品; (3)PCR擴增程序:94°C預變性4min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共35個循環，72°C延伸10min，4°C保存； (4)聚丙烯酰胺凝膠電泳條件:1XTBE電泳緩沖液，體積比為8%的聚丙烯酰胺凝膠，在電壓400V,電流IO OmA下電泳3.0h后用銀染法染色,經ImageScanner III凝膠掃描儀掃描保存； (5)PCR擴增產物的檢測鑒定:利用水仙BES-SSR標記引物TCA9，對24份水仙的樣品進行品種鑒定，于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為238bp的位置出現DNA條帶，則該品種為中國多花水仙金盞銀臺；在分子量為139bp的位置出現DNA條帶，則該品種為中國多花水仙重瓣玉玲瓏；在分子量為237bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Replete ;在分子量為126bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Alltruist ;在分子量為233bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋多花水仙Jetf ire ;在分子量為202bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Tahiti ;在分子量為267bp的位置出現DNA條帶，貝U該品種為西洋裂冠水仙Orangerie ;在分子量為237bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness ;在分子量為270bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋紅口水仙Recurvus ;在分子量為151bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Erlicheer ;在分子量為179bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋三蕊水仙Thalia;在分子量為130bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Mount Hood ;在分子量為217bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙WhiteFavourite ;在分子量為285bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋長壽花水仙SilverSmiles ;在分子量為127bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Pink Charm ;在分子量為200bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Johann Strauss ;在分子量為300bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Barret Browning ;在分子量為176bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Dutch Master ;在分子量為297bp的位置出現DNA條帶,貝U該品種為西洋大冠水仙Fortissimo ;在分子量為239bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Daydream ;在分子量為21 Ibp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Gay Tabor ;在分子量為141bp的位置出現DNA條帶,則該品種為西洋仙客來水仙Tete-a-Tete ;在分子量為269bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Bella Vista ;在分子量為207bp的位置出現DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Carlton0`
【文檔編號】C12N15/11GK103555852SQ201310561995
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】林琳, 祁世明, 潘東明, 潘騰飛, 郭志雄 申請人:福建農林大學