專利名稱：在脈沖磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高磁性固定化酶酶活和利用率的方法，特別涉及一種在脈沖磁
場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法。
背景技術：
目前，大分子高粘度物質(例如天然殼聚糖大分子物系)降解方法主要有化學法、物理法和酶解法等在內的多種方法。由于酶法降解具有可特異性地、選擇性、易于控制，及對環境基本不造成污染等優點，因此，酶解法是較理想的方法。 而在固定化酶工程中，由于小顆粒具有較高的固定化比表面積，因此，小顆粒常常被用來作為固定化酶載體。但是，對于普通的固定化酶反應器——固定化床反應器來說，小顆粒載體通常主要會造成固定化床過高的壓力降、且小顆粒還會帶來流動性和穩定性問題。 一般而言，上述問題可以通過使用流化床酶反應器解決，在流化床反應器中使用磁性小顆粒作為固定化酶載體，并運用磁場來解決流動性和穩定性等問題。在包含有磁性載體的流化床中應用磁場，微粒降受到磁場的影響，流化床的流動特性也將隨著磁場強度和粒子特性而改變，而對于固定化酶反應體系而言，這些新的特性帶來一定益處，如可以提高酶的使用率。 然而，在這樣的體系中，酶的活性不可避免地將受到影B向。特別是由于酶的價格比較貴，專一性酶的價格更是昂貴，因而大大增加了生產成本。因此，尋求一種能夠降低生產成本，即提高酶活或提高酶重復利用率的方法成為研究的熱點。 而目前關于在三相流化床中施加脈沖磁場對酶活力變化方面的研究國內外鮮見報導。而磁場對酶活的影響，在酶反應體系中是非常重要的參數，因此，有必要對該反應體系做詳細研究，為固定化酶工程的發展提供參考價值。目前，常用的固定化酶反應器中存在著酶使用率低、并且不利于酶的回收等問題。
發明內容
為了克服現有的流化床酶反應器中固定化酶酶活低、酶重復利用率低以及酶回收困難的不足和缺陷，本發明的首要目的在于提供一種在脈沖磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法。該方法通過使用磁場三相(氣、液、固)流化床酶解反應器(見申請日為2007年12月14日、專利號為200720061568. X、名稱為"磁場三相流化床酶解反應器"的實用新型專利)來提高固定化酶酶活和酶的重復利用率。磁場的施加可以使得磁性固定化酶在一定區域內運動，而通入的氣體對大分子底物粘稠物系起著類似攪拌的作用及氣體對物系表觀粘度的具有降低作用。 本發明的目的通過下述技術方案實現一種在脈沖磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法，包括如下步驟將磁性固定化纖維素酶加入到磁場三相流化床酶解反應器中，施加磁場強度為0. 5 2. 5kA/m的脈沖磁場，再將流速1 10mL/min氣體鼓入磁場三相流化床酶解反應器，同時，將流速為1 10mL/min的反應溶液通入磁場三相流 化床反應器，反應200 400min結束反應；使用后的磁性固定化纖維素酶回收后用去離子 水沖洗至少3次，冷凍干燥，置于4t:保存，備用。 所述的反應溶液為含有可被所述磁性固定化纖維素酶降解的底物的緩沖溶液；底 物的分子量為60000 100000 ;
所述的底物優選為殼聚糖； 所述的緩沖溶液優選為乙酸溶液；所述的反應溶液優選為pH為4. 0 5. 0、濃度為30 50mg/mL的殼聚糖乙酸溶 液；其中溶質是殼聚糖，溶劑是體積百分比為0. 1 1%的乙酸溶液；
所述磁性固定化纖維素酶的加入量優選為50 250g ;
所述的磁性固定化纖維素酶通過以下步驟制備得到
(1)殼聚糖乙酸溶液的配制用體積百分比為0. 1 1%的乙酸溶液與殼聚糖溶液配置30 50mg/mL的殼聚糖 乙酸溶液，用堿調pH為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液；
(2)磁性殼聚糖微球的制備在200 300mL殼聚糖乙酸溶液中加入3. 5 5. Og Fe304粉末，攪拌混合均勻，加 入10 20mL Span-80(司班-80) 、300 400mL石蠟，待分散均勻后，在40 60。C條件下 加入10 20mL戊二醛，攪拌反應3 5h，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，沖洗磁性微球， 用磁場收集磁性微球，于60 65t:干燥篩分，得到磁性殼聚糖微球；
(3)磁性固定化纖維素酶的制備將5. 0 7. Og磁性殼聚糖微球加入250 300mL的0. 2 0. 5mol/L磷酸鈉緩沖
液中溶脹1 2小時，再加入100 200mL的2. Omg/mL纖維素酶液，于15 20°C以50
100rpm的速度振蕩，讓磁性殼聚糖微球吸附纖維素酶，6 16h后，在磁場作用下，將磁性殼
聚糖微球沉淀，去上清液，用0. 2 0. 5mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至
洗液中檢測不到蛋白為止，即得到磁性固定化纖維素酶。 所述的磁性固定化纖維素酶更優選通過以下步驟制備得到 (1)殼聚糖乙酸溶液的配制 用體積百分比為0. 1 0. 8%的乙酸溶液與殼聚糖溶液配置40 50mg/mL的殼聚 糖乙酸溶液，用堿調pH為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液；
(2)磁性殼聚糖微球的制備 在200 250mL殼聚糖乙酸溶液中加入4. 0 5. Og Fe304粉末，攪拌混合均勻，加 入12 20mL Span-80(司班-80) 、320 400mL石蠟，待分散均勻后，在40 55。C條件下 加入10 20mL戊二醛，攪拌反應3 5h，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，沖洗磁性微球， 用磁場收集磁性微球，于60 65t:干燥篩分，得到磁性殼聚糖微球；
(3)磁性固定化纖維素酶的制備 將5. 5 7. Og磁性殼聚糖微球加入260 300mL的0. 2 0. 4mol/L磷酸鈉緩沖 液中溶脹1 1. 5小時，再加入100 200mL的2. Omg/mL纖維素酶液，于15 18°C以50 90rpm的速度振蕩，讓磁性殼聚糖微球吸附纖維素酶，6 16h后，在磁場作用下，將磁性殼 聚糖微球沉淀，去上清液，用0. 2 0. 4mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中檢測不到蛋白為止，即得到磁性固定化纖維素酶。
步驟(1)中所述的堿優選為磷酸氫二鈉； 步驟(2)中所述沖洗磁性微球是用石油醚、無水乙醇依次沖洗磁性微球。
本發明的原理在脈沖磁場作用下，脈沖磁場對酶先是產生激活作用，緊接著磁場產生瞬間停頓，可使酶分子結構向更有利于提高酶活的構象伸展，如此反復，激活了酶的活性中心；同時，脈沖磁場對反應體系中物質如此反復的作用也可產生類似振動的現象，仍促進了酶與底物的接觸機會，增加了傳質速率。另外，通入的氣體對大分子底物粘稠物系起著類似攪拌的作用及氣體對物系表觀粘度的具有降低作用，降低了傳質阻力，增大了底物、固定化酶和產物之間的傳質速率，宏觀表現則是增大了酶活。在包含有磁性載體的流化床中應用磁場，磁性固定化纖維素酶有規則地分布在脈沖磁場三相流化床中以及易于回收，有效地提高磁性固定化纖維素酶的利用率。 本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果 (1)本發明操作簡單，通過調控磁場三相流化床中的磁場強度、磁場作用時間、氣體流速和液體流速等參數即可有效地提高磁性固定化纖維素酶的酶活力和利用率。
(2)通過本發明所述方法使用的磁性固定化纖維素酶穩定性好，回收后可以重復使用，重復利用9次，酶活回收率> 42% (如圖4所示)。 (3)本發明由于可以提高磁性固定化纖維素酶的酶活和利用率，有效地降低了成本，同時可以提高高分子物質的降解率，為高分子、粘稠物質實現連續化降解提供了理論依據。
圖1為磁場強度(H)對磁性固定化纖維素酶酶活力的影響圖。 圖2為非磁場三相流化床條件下，磁場對磁性固定化纖維素酶活的影響圖。 圖3為氣速(Ug)對磁性固定化纖維素酶酶活力的影響圖。 圖4為磁性固定化纖維素酶酶活回收率變化圖。 圖5為液速(U》對磁性固定化纖維素酶酶活力的影響圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。 實施例1 (1)殼聚糖乙酸溶液的配制 用體積百分比為O. 1%的乙酸溶液與殼聚糖溶液(殼聚糖分子量為10萬)配制30mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用Na2HP04調pH值為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液；
(2)磁性殼聚糖微球的制備 在1000mL燒瓶中加入200mL殼聚糖乙酸溶液中，再加入3. 5g FeA粉末，攪拌混合均勻，加入10mL司班-80、300mL石蠟，待分散均勻后，在4(TC條件下加入5. OmL戊二醛，攪拌反應lh后，再滴加5. OmL戊二醛，繼續反應3h后，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，用石油醚、無水乙醇依次沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于6(TC烘箱烘干、篩分，得到干燥的磁性殼聚糖微球。
(3)磁性固定化纖維素酶的制備 將5. 0g磁性殼聚糖微球加入250mL 0. 2mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1小時，加入
lOOmL的2. Omg/mL纖維素酶液，在15°C 、50rpm的恒溫振蕩器上反應制備磁性固定化纖維素
酶，6h后，在磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，用0. 2mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性
殼聚糖微球，直至洗液中用凱氏定氮法檢測不到蛋白為止；得到磁性固定化纖維素酶，將磁
性固定化纖維素酶冷凍干燥。 (4)提高磁性固定化纖維素酶的酶活 在磁場三相流化床酶解反應器中加入50g磁性固定化纖維素酶，連接好實驗裝 置，在O. 2MPa操作壓力下，分別施加H = O，O. 5， 1. 0， 1. 5，2. 5kA/m的脈沖磁場，再將流速為 5mL/min的氣體鼓入磁場三相流化床酶解反應器，同時，將流速為5mL/min(U》的步驟(1) 制備的殼聚糖乙酸溶液通入磁場三相流化床反應器中，反應200min。將不同磁場強度條件 下反應得到的產物(即低聚殼聚糖)用DNS法測定還原糖含量計算磁性固定化纖維素酶酶 活力的變化。酶活力單位指lg固體纖維素酶，lmin水解反應溶液(如殼聚糖乙酸溶液)底 物，產生出liimoL還原糖量為l個酶活力單位，以IU/g表示。 如圖1所示，在實驗磁場強度范圍內，施加脈沖的磁場三相流化床反應器中，磁場 的作用有助于提高酶的活性。隨著磁場強度的增加，磁性固定化纖維素酶酶活力呈現快速 增加的變化趨勢，當H = 1. 5kA. m—1時，酶活力比初始值增大了將近70% 。分析認為，在脈 沖磁場作用下，脈沖磁場對酶先是產生激活作用，緊接著磁場產生瞬間停頓，可使酶分子結 構向更有利于提高酶活的構象伸展，如此反復，激活了酶的活性中心；同時，脈沖磁場對反 應體系中物質如此反復的作用也可產生類似振動的現象，仍促進了酶與底物的接觸機會， 增加了傳質速率。兩種作用的結果表現為脈沖磁場條件下，酶活快速增長。而同時在非磁 場三相流化床條件下，考察了磁場對磁性固定化纖維素酶酶活力影響，結果如圖2所示，發 現隨著磁場強度的增加，磁性固定化纖維素酶酶活力呈下降趨勢。這說明，磁場三相流化床 有助于提高磁性固定化纖維素酶酶活力。
實施例2 (1)殼聚糖乙酸溶液的配制 用體積百分比濃度1%的乙酸溶液與殼聚糖溶液(殼聚糖分子量為10萬)配制 50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用Na2HP04調pH為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液。 [OOM] (2)磁性殼聚糖微球的制備 在1000mL燒瓶中加入300mL殼聚糖乙酸溶液中，再加入5. Og FeA粉末，攪拌混 合均勻，加入20mL司班-80、400mL石蠟，待分散均勻后，在4(TC條件下加入10. OmL戊二醛， 攪拌反應lh后，升溫至6(TC再滴加10. OmL戊二醛，繼續反應4h后，得到磁性微球，靜置冷 卻至室溫，用石油醚、無水乙醇依次沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于65t:烘箱烘干、 篩分，得到干燥的磁性殼聚糖微球。
(3)磁性固定化纖維素酶的制備 將7. Og磁性殼聚糖微球加入300mL 0. 2mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹2小時，加入 200mL的2. Omg/mL纖維素酶液，在20°C 、 100rpm的恒溫振蕩器上反應制備磁性固定化纖維 素酶，12h后，在磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，用0. 5mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗
7磁性殼聚糖微球，直至洗液中用凱氏定氮法檢測不到蛋白為止；得到磁性固定化纖維素酶，
將磁性固定化纖維素酶冷凍干燥。
(4)提高磁性固定化纖維素酶的酶活 在磁場三相流化床酶解反應器中加入250g磁性固定化纖維素酶，連接好實驗裝置，在0. 2MPa操作壓力下，施加2. 5kA/m的脈沖磁場，分別將流速Ug = 0， 3， 4， 5， 6， 10mL/min氣體鼓入磁場三相流化床酶解反應器，同時，將流速為8mL/min(U》的殼聚糖乙酸溶液通入磁場三相流化床反應器中，反應400min。將不同磁場強度條件下反應得到的產物(即低聚殼聚糖)用DNS法測定還原糖含量計算磁性固定化纖維素酶酶活力的變化。如圖3所示，在適宜的操作范圍內，隨著氣速的增加，固定化酶酶活力也呈上升趨勢變化。這是因為，隨著氣速的增加，高分子底物的湍流強調增加，減少了邊界層(Nernst層)厚度，降低了傳質阻力，增大了底物、固定化酶和產物之間的傳質速率，宏觀表現則是增大了酶活。即氣體的引入起到了類似"攪拌"的作用，增強了床層的混合程度，Nernst層厚度變薄，增加了殼聚
糖底物、產物和固定化酶顆粒的傳質速度，即提高了酶活力。
實施例3 (1)殼聚糖乙酸溶液的配制 用體積百分比濃度O. 5%的乙酸溶液與殼聚糖溶液(殼聚糖分子量為IO萬)配置40mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用Na2HP04調pH為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液。
(2)磁性殼聚糖微球的制備 在1000mL燒瓶中加入300mL殼聚糖乙酸溶液中，再加入4. Og FeA粉末，攪拌混
合均勻，加入15mL司班-80、350mL石蠟，待分散均勻后，在4(TC條件下加入8. OmL戊二醛，
攪拌反應lh后，再滴加5. OmL戊二醛，繼續反應4h后，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，用
石油醚、無水乙醇依次沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于6(TC烘箱烘干、篩分，得到干
燥的磁性殼聚糖微球。 (3)磁性固定化纖維素酶的制備 將6. Og磁性殼聚糖微球加入250mL 0. 5mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1. 5小時，加入150mL的2. Omg/mL纖維素酶液，在15°C、80r/min的恒溫振蕩器上反應制備磁性固定化纖維素酶，16h后，在磁場強度50 100kA/m的磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，用0. 3mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中用凱氏定氮法檢測不到蛋白為止；得到磁性固定化纖維素酶，將磁性固定化纖維素酶冷凍干燥。
(4)提高磁性固定化纖維素酶的酶活和利用率 在磁場三相流化床酶解反應器中加入80g磁性固定化纖維素酶，連接好實驗裝置，在0. 15MPa操作壓力下，分別施加1. OkA/m的脈沖磁場，再將流速8mL/min氣體鼓入磁場三相流化床酶解反應器，同時，將流速為6mL/min(U》的反應溶液(如殼聚糖乙酸溶液)通入磁場三相流化床反應器中，反應240min。將不同磁場強度條件下反應得到的產物(如低聚殼聚糖)用DNS法測定還原糖含量計算磁性固定化纖維素酶酶活力的變化。將使用后的磁性固定化纖維素酶重復使用，磁性固定化纖維素酶使用后用去離子水反復沖洗，經冷凍干燥于4t:冰箱即可再次使用，每次使用后都如此操作。重復使用后，測定酶活力，計算酶
活力回收率。
8酶活力回收率(％):磁細謹,力X薩
游離纖維素酶酶活力 如圖4所示，磁性固定化纖維素酶經重復使用9次后，酶活力回收率>42%。同 時，由圖4可以看出，使用5次后酶活力仍大于磁性固定化酶酶活力的50%，說明本方法制 備的磁性固定化酶穩定性較好，可以重復使用，從而達到降低成本的目的。
實施例4 (1)殼聚糖乙酸溶液的配制 用體積百分比濃度0. 8%的乙酸溶液與殼聚糖溶液(殼聚糖分子量為6萬)配制 50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用Na2HP04調pH為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液。
(2)磁性殼聚糖微球的制備 在1000mL燒瓶中加入250mL殼聚糖乙酸溶液中，再加入4. 0g FeA粉末，攪拌混
合均勻，加入12mL司班-80、320mL石蠟，待分散均勻后，在55t:條件下加入10. OmL戊二醛，
攪拌反應lh后，再滴加10. OmL戊二醛，繼續反應2h后，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，用
石油醚、無水乙醇依次沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于65t:烘箱烘干、篩分，得到干
燥的磁性殼聚糖微球。 (3)磁性固定化纖維素酶的制備 將5. 5g磁性殼聚糖微球加入260mL 0. 4mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1. 5小時，加
入200mL的2. Omg/mL纖維素酶液，在18°C、90rpm的恒溫振蕩器上反應制備磁性固定化纖
維素酶，15h后，在磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，用0. 4mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖
洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中用凱氏定氮法檢測不到蛋白為止；得到磁性固定化纖維素
酶，將磁性固定化纖維素酶冷凍干燥。 (4)提高磁性固定化纖維素酶的酶活 在磁場三相流化床酶解反應器中加入100g磁性固定化纖維素酶，連接好實驗裝
置，在O. 2MPa操作壓力下，施加1. 5kA/m的脈沖磁場，分別將流速(U》為3， 4， 5， 6， 10mL/min
的殼聚糖乙酸溶液通入磁場三相流化床反應器，同時，將5mL/min流速氣體鼓入磁場三相
流化床酶解反應器中，反應400min。將不同流速的殼聚糖乙酸溶液下反應得到的產物(即
低聚殼聚糖)用DNS法測定還原糖含量計算磁性固定化纖維素酶酶活力的變化。 如圖5所示，實驗結果表明，隨著仏的增大，磁性固定化纖維素酶酶活力升高得越
來越快。分析認為，加速了液相的湍流強度，減少了邊界層(Nernst層)厚度，加速了殼聚
糖底物與固定化酶的傳質速率，同時產物由固定化酶微環境到達溶液主體的速度亦將隨著
^的增加而加快，從而降低了底物和產物的擴散限制效應。這意味著，在一定范圍內，增大
^可以加速固定化酶表面底物和產物的傳質速率，宏觀表現則是酶活的增加。 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的
限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，
均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
一種在脈沖磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法，其特征在于包括如下步驟將磁性固定化纖維素酶加入到磁場三相流化床酶解反應器中，施加磁場強度為0.5～2.5kA/m的脈沖磁場，再將流速1～10mL/min氣體鼓入磁場三相流化床酶解反應器，同時，將流速為1～10mL/min的反應溶液通入磁場三相流化床反應器，反應200～400min結束反應；使用后的磁性固定化纖維素酶回收后用去離子水沖洗至少3次，冷凍干燥，置于4℃保存；所述的反應溶液為含有可被所述磁性固定化纖維素酶降解的底物的緩沖溶液；所述底物的分子量為60000～100000；所述的磁性固定化纖維素酶通過以下步驟制備得到(1)殼聚糖乙酸溶液的配制用體積百分比為0.1～1％的乙酸溶液與殼聚糖溶液配置30～50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用堿調pH為4.0～5.0，得到殼聚糖乙酸溶液；(2)磁性殼聚糖微球的制備在200～300mL殼聚糖乙酸溶液中加入3.5～5.0g Fe3O4粉末，攪拌混合均勻，加入10～20mL司班-80、300～400mL石蠟，待分散均勻后，在40～60℃條件下加入10～20mL戊二醛，攪拌反應3～5h，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于60～65℃干燥篩分，得到磁性殼聚糖微球；(3)磁性固定化纖維素酶的制備將5.0～7.0g磁性殼聚糖微球加入250～300mL的0.2～0.5mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1～2小時，再加入100～200mL的2.0mg/mL纖維素酶液，于15～20℃以50～100rpm的速度振蕩，讓磁性殼聚糖微球吸附纖維素酶，6～16h后，在磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，去上清液，用0.2～0.5mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中檢測不到蛋白為止，即得到磁性固定化纖維素酶。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的磁性固定化纖維素酶通過以下步驟制備得到(1) 殼聚糖乙酸溶液的配制用體積百分比為0. 1 0. 8%的乙酸溶液與殼聚糖溶液配置40 50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用堿調pH為4. 0 5. O，得到殼聚糖乙酸溶液；(2) 磁性殼聚糖微球的制備在200 250mL殼聚糖乙酸溶液中加入4. 0 5. Og Fe304粉末，攪拌混合均勻，加入12 20mL司班-80、320 400mL石蠟，待分散均勻后，在40 55。C條件下加入10 20mL戊二醛，攪拌反應3 5h，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于60 65t:干燥篩分，得到磁性殼聚糖微球；(3) 磁性固定化纖維素酶的制備將5. 5 7. 0g磁性殼聚糖微球加入260 300mL的0. 2 0. 4mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1 1. 5小時，再加入100 200mL的2. Omg/mL纖維素酶液，于15 18°C以50 90rpm的速度振蕩，讓磁性殼聚糖微球吸附纖維素酶，6 16h后，在磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，去上清液，用0. 2 0. 4mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中檢測不到蛋白為止，即得到磁性固定化纖維素酶。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的底物為殼聚糖。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的緩沖溶液為乙酸溶液。
5. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的反應溶液為pH值為4. 0 5. 0、濃度為30 50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液；其 中溶質是殼聚糖，溶劑是體積百分比為0. 1 1%的乙酸溶液。
6. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述磁性固定化纖維素酶的加入量 為50 250g。
7. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的堿為磷酸氫二鈉。
8. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述沖洗磁性微球是用石油醚、無水 乙醇依次沖洗磁性微球。
全文摘要
本發明提供了一種在脈沖磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法。本發明通過在磁場三相流化床中應用脈沖磁場，調控脈沖磁場的磁場強度、磁場作用時間、氣體流速和液體流速等參數即可有效地提高磁性固定化纖維素酶的酶活力和利用率。通過本發明所述方法使用的磁性固定化纖維素酶穩定性好，回收后可以重復使用，重復利用9次，酶活回收率＞42％。本發明由于可以提高磁性固定化纖維素酶的酶活和利用率，有效地降低了成本，同時可以提高高分子物質的降解率，為實現連續化生產提供了依據。
文檔編號C12P19/00GK101696438SQ20091019343
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月29日 優先權日2009年10月29日
發明者寇靈梅, 李冰, 李琳, 郭祀遠, 陳玲 申請人:華南理工大學;