專利名稱：一種游離酶與固定化酶聯合水解制備蠶蛹肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種游離酶與固定化酶聯合水解制備蠶蛹肽的方法，屬于酶工程和農產品加工技術領域。
背景技術：
蠶蛹是繅絲業的副產物，我國每年鮮蛹產量高達30萬噸以上。蠶蛹中蛋白質含量高達55%，脫除脂肪后得到的脫脂蠶蛹中蛋白質含量高達70%，且氨基酸種類齊全，配比均衡，必需氨基酸含量豐富，是一種優質蛋白。但蠶蛹蛋白水溶性差，含有異味物質與色素，特別是經水溶脹后，異味和色澤更為嚴重，阻礙其在食品工業中的應用。采用酶制劑對蠶蛹蛋白進行水解生產的蠶蛹肽具有溶解度高、粘性低、保濕性能好、易消化吸收等優點，以及比蠶蛹蛋白更好的加工性能和營養價值，已在食品、醫藥、日用化工等領域中顯示出廣闊的應用前景。目前，蠶蛹肽的生產主要采用酶法，但所用蛋白酶均為游離酶。游離酶水解法的缺點是食品級蛋白酶價格高、用量大，但無法回收與重復使用，生產成本高。此外，采用一種蛋白酶水解時水解度較低，而采用多種蛋白酶復合水解時，雖然可提高水解度，但不同蛋白酶分子之間存在相互分解的現象，導致酶活力下降迅速，影響酶解效果，增加生產成本。與游離酶相比，固定化酶穩定性強，不溶于水，可以方便的從液態反應體系中回收后重復使用，從而可以降低生產成本；但脫脂蠶蛹粉不能直接采用固定化蛋白酶進行水解，其原因是脫脂蠶蛹粉不溶于水，在水中呈粘稠漿狀，不能進入固定化酶內部，酶與底物接觸機率低，水解速度慢，且水解后剩余固體殘渣與固定化酶混在一起，分離困難，固定化蛋白酶無法回收利用。本發明所述游離酶與固定化酶聯合水解的方法，可以解決上述難題。目前國內外尚無游離酶與固定化酶聯合水 解脫脂蠶蛹制備蠶蛹肽的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種游離蛋白酶與固定化蛋白酶聯合水解脫脂蠶蛹粉制備蠶蛹肽的方法。該方法首先采用游離蛋白酶水解脫脂蠶蛹粉，使不溶性的蠶蛹蛋白初步水解后轉移至水相，再采用固定化蛋白酶將其繼續水解至分子量2000Da以下的小肽。固定化蛋白酶可以方便的回收后進行重復利用5 8次，減少了蛋白酶的消耗量，降低了生產成本。本發明的技術方案是:將脫脂蠶蛹粉與水按一定比例配制成漿液，首先采用游離的堿性蛋白酶進行水解，使不溶性的蠶蛹蛋白初步分解，溶解性增加，轉移至水相，濾除殘渣后，再將澄清的水解液轉入固定化蛋白酶反應器繼續水解；酶解液再經精濾、超濾、真空濃縮和噴霧干燥后，得到蠶蛹肽粉。具體步驟如下:
一種游離酶與固定化酶聯合水解制備蠶蛹肽的方法，包括如下步驟:(1)將脫脂蠶蛹配成料液，將料液中的蛋白變性，然后加入堿性蛋白酶酶解，濾去殘渣，得到澄清酶解液I;
(2)將酶解液I轉入固定化酶反應器中，加入固定化蛋白酶進行酶解，得到酶解液II；
(3)酶解液II進一步過濾、干燥，得到蠶蛹肽粉。 步驟(I)的具體操作為:將脫脂蠶蛹粉配成8 10% (w/w)的料液，85 90°C加熱8 12min，使蛋白變性，冷卻后，加入堿性蛋白酶酶解，濾除殘渣，得到澄清的酶解液。所述堿性蛋白酶的用量為1600 2400u/g脫脂蠶蛹，酶解條件為pH8.0 8.5，50 55°C酶解 1.5 2.0h。步驟(2)所述固定化蛋白酶為固定化的中性蛋白酶或/和風味蛋白酶。優選的，所述固定化蛋白酶為固定化的中性蛋白酶和風味蛋白酶，中性蛋白酶的用量為2000 3000u/g脫脂蠶·蛹，風味蛋白酶的用量為4 6 LAPU/g脫脂蠶蛹。進一步優選的，所述固定化蛋白酶中，中性蛋白酶和風味蛋白酶的比例為400 600 u:1 LAPU。所述固定化蛋白酶的制備方法如下:將蛋白酶以10 15%(w/w)的濃度溶于水中，濾去殘渣，再加入10 15% (v/v)的保護劑，然后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積混均，再逐滴滴入2.5 3.5%(w/w)的氯化鈣溶液中，凝結成微球；或者將不同的蛋白酶分別固定化后，再混合使用。所述保護劑為甘露醇。步驟(3)所述過濾的具體操作為:酶解液II經精濾除去渾濁物，采用截斷分子量為2000Da的超濾膜進行超濾，透過液濃縮干燥，獲得分子量2000Da以內的蠶蛹肽粉。本發明的有益效果是:
I)本發明聯合使用游離堿性蛋白酶與固定化中性蛋白酶和風味蛋白酶水解脫脂蠶蛹粉制備蠶蛹肽，固定化的中性蛋白酶與風味蛋白酶可從反應體系中回收后重復使用5 8次，降低了生產成本。2)采用游離的堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹進行初步分解，可以將不溶性的蠶蛹蛋白轉移至水相，濾除固態殘渣后再轉入固定化酶反應器繼續水解，可以避免固態殘渣損傷固定化酶顆粒、堵塞液流通道、降低流速。如果脫脂蠶蛹粉不經堿性蛋白酶初步分解而直接采用固定化酶進行水解，不僅水解速度慢、產品收率低，而且殘渣與固定化酶分離困難，固定化酶無法回收后重復使用。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例所用到的脫脂蠶蛹來自山東泰安絲綢集團有限公司，所用中性蛋白酶購自泰安市信得利生物工程公司；風味蛋白酶購自諾維信(中國)生物技術有限公司，產品型號為Flavourzyme 5OOMG ;堿性蛋白酶購自泰安市信得利生物工程公司。實施例1
(I)稱取中性蛋白酶(1 X 1O5 u/g) IOg,溶于80 IOOml水中，充分攪拌，濾去殘渣，再加入8 IOml甘露醇,混合均勻,然后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積混合均勻,用螺動泵將混合液于5 1Ocm高度逐滴滴入3%(w/w)的氯化鈣溶液中，得到顆粒均勻、形狀規則的海藻酸鈉微球，即為固定化中性蛋白酶。(2)稱取風味蛋白酶(500 LAPU/g)5g，溶于40 50ml水中，充分攪拌，濾去殘渣，留取酶液，再加入4 5ml甘露醇，混合均勻，然后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積混合均勻，用螺動泵將混合液于IOcm高度逐滴滴入3% (w/w)的氯化I丐溶液中,得到顆粒均勻、形狀規則的海藻酸鈉微球，即為固定化風味蛋白酶。(3)上述蠕動泵的乳膠管終端所接噴淋頭上的小孔內徑0.8 1.0mm。(4)稱取500g脫脂蠶蛹粉，置于IOL的酶解罐中，加入5000ml去離子水，攪拌均勻；向夾套中通入蒸汽升溫至85 90°C，維持8 12min使蛋白質適度變性，然后冷卻至50 55°C，調節pH值至ρΗ8.0。(5)加入5.0g的堿性蛋白酶(2Χ 105u/g,游離酶),于50 55°C恒溫水解Ih,其作用是將不溶于水的蠶蛹蛋白初步分解，使其溶于水中，轉入水相。(6)采用布氏漏斗進行真空抽濾，獲得澄清的酶解液I。所用布氏漏斗中鋪2層中速濾紙，并預鋪5 IOmm厚的娃藻土濾層。(7 )將酶解液I轉入IOL攪拌罐式固定化酶反應器中，加入(I)與(2 )所制備的固定化中性蛋白酶與風味蛋白酶，30 40rpm攪拌下于45 55°C酶解4h。(8)酶解結束后，將酶解液從固定化酶反應器中放出，固定化酶被截留在反應器中重復使用。所放出的酶解液再采用預鋪有5 IOmm厚的硅藻土濾層的布氏漏斗進行抽濾，除去少許渾濁物，得到澄清的酶解液II。(9)酶解液II采用截斷分子量為2000Da的超濾膜經行超濾，截留液返回固定化酶反應器繼續酶解，透過液于70 85°C進行真空濃縮，真空為度0.06 0.08MPa，濃縮溫度為70 80°C，濃縮倍數為 3 5倍。(10)濃縮液于料溫55 65°C，進口溫度180 200°C，出口溫度70 80°C的條件下米用噴霧干燥機進行噴霧干燥，獲得分子量2000Da以內的蠶蛹肽粉260 275g,肽含量為70 71%。實施例2
(I)稱取中性蛋白酶(I X IO5 u/g) IOg,溶于80 IOOml水中，充分攪拌，濾去殘渣，再加入8 IOml甘露醇,混合均勻,然后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積混合均勻,用螺動泵將混合液于5 IOcm高度逐滴滴入3%(w/w)的氯化鈣溶液中，得到顆粒均勻、形狀規則的海藻酸鈉微球，即為固定化中性蛋白酶。(2)稱取風味蛋白酶(500 LAPU/g)4g，溶于40 50ml水中，充分攪拌，濾去殘渣，留取酶液，再加入4 5ml甘露醇，混合均勻，然后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積混合均勻，用螺動泵將混合液于IOcm高度逐滴滴入3% (w/w)的氯化I丐溶液中,得到顆粒均勻、形狀規則的海藻酸鈉微球，即為固定化風味蛋白酶。(3)上述蠕動泵的乳膠管終端所接噴淋頭上的小孔內徑0.8 1.0mm。(4)稱取400g脫脂蠶蛹粉，置于IOL的酶解罐中，加入4500ml去離子水，攪拌均勻；向夾套中通入蒸汽升溫至85 90°C，維持8 12min使蛋白質適度變性，然后冷卻至50 55°C，調節pH值至ρΗ8.0。(5)加入4.5g的堿性蛋白酶(2X 105u/g,游離酶),于50 55°C恒溫水解2h,其作用是將不溶于水的蠶蛹蛋白初步分解，使其溶于水中，轉入水相。
(6)采用布氏漏斗進行真空抽濾，獲得澄清的酶解液I。所用布氏漏斗中鋪2層中速濾紙，并預鋪5 IOmm厚的娃藻土濾層。(7 )將酶解液I轉入IOL攪拌罐式固定化酶反應器中，加入(I)與(2 )所制備的固定化中性蛋白酶與風味蛋白酶，30 40rpm攪拌下于45 55°C酶解4h。(8)酶解結束后，將酶解液從固定化酶反應器中放出，固定化酶被截留在反應器中重復使用。所放出的酶解液再采用預鋪有5 IOmm厚的硅藻土濾層的布氏漏斗進行抽濾，除去少許渾濁物，得到澄清的酶解液II。(9)酶解液II采用截斷分子量為2000Da的超濾膜經行超濾，截留液返回固定化酶反應器繼續酶解，透過液于70 85°C進行真空濃縮，真空為度0.06 0.08MPa，濃縮溫度為70 80°C，濃縮倍數為3 5倍。(10)濃縮液于料溫55 65°C，進口溫度180 200°C，出口溫度70-80°C的條件下米用噴霧干燥機進行噴霧干燥，獲得分子量2000Da以內的蠶蛹肽粉220 230g,肽含量為71 72%。

實施例3
(I)將中性蛋白酶(I X IO5 u/g)與風味蛋白酶(500 LAPU/g)按2.5:1 (w/w)的比例混配成復合蛋白酶。(2)稱取14g復合蛋白酶，以10 15%的濃度溶于水中，充分攪拌，濾除殘渣，留取酶液，加入10 15% (v/v)的甘露醇,混合均勻后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積充分混合，用螺動泵于IOcm高度逐滴滴入2.5 3.5% (w/w)的氯化I丐溶液中，得到顆粒均勻、形狀規則的海藻酸鈉微球，即為形固定化復合蛋白酶。(3)上述蠕動泵的乳膠管終端所接噴淋頭上的小孔直徑0.8 1.0mm。(4)稱取500g脫脂蠶蛹粉，置于IOL的酶解罐中，加入5000ml去離子水，攪拌均勻，向夾套中通入蒸汽升溫至85 90°C，維持8 12min，使蛋白質適度變性，然后冷卻至50 55°C，調節pH值至ρΗ8.0。(5)加入5.0g的堿性蛋白酶(2Χ IO5 u/g),于50 55°C恒溫水解1.5h，其作用是將不溶于水的蠶蛹蛋白初步分解，轉入水相。(6)米用離心機進行固液分離,轉速4000 5000印111,時間15 30min,棄去沉洛，
留取上清液。(7)將上清液轉入攪拌IOL罐式固定化酶反應器，加入(2)所制備的固定化復合蛋白酶，30 40rpm攬祥下于45 55°C酶解5h。(8)酶解結束后,將酶解液從固定化酶反應器中放出，固定化酶被截留在固定化酶反應器中，重復使用。(9)酶解液采用鋪有5 IOmm厚硅藻土濾層的布氏漏斗進行抽濾，除去少許渾濁物，得到澄清的濾液，再采用截斷分子量為2000Da的超濾膜經行超濾，截留液返回固定化酶反應器繼續酶解，透過液于70 85°C進行真空濃縮，真空為度0.06 0.08MPa，濃縮溫度為70 80°C，濃縮倍數為3 5倍。(10)濃縮液于料溫55 65°C，進口溫度180 200°C，出口溫度70-80°C的條件下米用噴霧干燥機進行噴霧干燥，獲得分子量2000Da以內的蠶蛹肽粉260 275g,肽含量為70 71%。
實施例4
(I)將中性蛋白酶(I X IO5 u/g)與風味蛋白酶(500 LAPU/g)按3:1 (w/w)的比例混配成復合蛋白酶。(2)稱取16g復合蛋白酶，以10 15%的濃度溶于水中，充分攪拌，濾除殘渣，留取酶液，加入10 15% (v/v)的甘露醇,混合均勻后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積充分混合，用螺動泵于IOcm高度逐滴滴入2.5 3.5% (w/w)的氯化I丐溶液中，得到顆粒均勻、形狀規則的海藻酸鈉微球，即為形固定化復合蛋白酶。(3)上述蠕動泵的乳膠管終端所接噴淋頭上的小孔直徑0.8 1.0mm。(4)稱取400g脫脂蠶蛹粉，置于IOL的酶解罐中，加入4500ml去離子水，攪拌均勻，向夾套中通入蒸汽升溫至85 90°C，維持8 12min，使蛋白質適度變性，然后冷卻至50 55°C，調節pH值至ρΗ8.0。(5)加入4.5g的堿性蛋白酶(2X IO5 u/g),于50 55°C恒溫水解2h，其作用是將不溶于水的蠶蛹蛋白初步分解，轉入水相。(6)米用離心機進行固液分離,轉速4000 5000印111,時間15 30min,棄去沉洛，
留取上清液。(7)將上清液轉入攪拌IOL罐式固定化酶反應器，加入(2)所制備的固定化復合蛋白酶，30 40rpm攬祥下于45 55°C酶解3h。(8)酶解結束后,將酶解液從固定化酶反應器中放出，固定化酶被截留在固定化酶反應器中，重復使用。(9)酶解液采用鋪有5 IOmm厚硅藻土濾層的布氏漏斗進行抽濾，除去少許渾濁物，得到澄清的濾液，再采用截斷分子量為2000Da的超濾膜經行超濾，截留液返回固定化酶反應器繼續酶解，透過液于70 85°C進行真空濃縮，真空為度0.06 0.08MPa,濃縮溫度為70 80°C，濃縮倍數為3 5倍。(10)濃縮液于料溫55 65°C，進口溫度180 200°C，出口溫度70-80°C的條件下米用噴霧干燥機進行噴霧干燥，獲得分子量2000Da以內的蠶蛹肽粉220 230g,肽含量為71 72%。以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對 于本領域技術人員來說，在不背離本發明精神的范圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。
權利要求
1.一種游離酶與固定化酶聯合水解制備蠶蛹肽的方法，包括如下步驟: (1)將脫脂蠶蛹配成料液，將料液中的蛋白變性，然后加入堿性蛋白酶酶解，濾去殘渣，得到澄清酶解液I; (2)將酶解液I轉入固定化酶反應器中，加入固定化蛋白酶進行酶解，得到酶解液II； (3)酶解液II進一步過濾、干燥，得到蠶蛹肽粉。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)的具體操作為:將脫脂蠶蛹粉配成8 10% (w/w)的料液，85 90°C加熱8 12min，使蛋白變性，冷卻后，加入堿性蛋白酶酶解，濾除殘渣，得到澄清的酶解液。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述堿性蛋白酶的用量為1600 2400u/g脫脂蠶蛹，酶解條件為ρΗ8.0 8.5，50 55°C酶解1.5 2.0h。
4.根據權利要求1所 述的方法，其特征在于，步驟(2)所述固定化蛋白酶為固定化的中性蛋白酶或/和風味蛋白酶。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述固定化蛋白酶為固定化的中性蛋白酶和風味蛋白酶，中性蛋白酶的用量為2000 3000u/g脫脂蠶蛹，風味蛋白酶的用量為4.0 6.0LAPU/g脫脂蠶蛹，酶解條件為45 55°C酶解3 5h。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定化蛋白酶中，中性蛋白酶和風味蛋白酶的比例為400 600 u:1 LAPU0
7.根據權利要求1、4 6任一項所述的方法，其特征在于，固定化蛋白酶的制備方法如下:將蛋白酶以10 15%(w/w)的濃度溶于水中，濾去殘渣，再加入10 15% (v/v)的保護齊U，然后與5 7%(w/w)海藻酸鈉溶液等體積混均，再逐滴滴入2.5 3.5%(w/w)的氯化鈣溶液中，凝結成微球；或者將不同的蛋白酶分別固定化后，再混合使用。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述保護劑為甘露醇。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述過濾的具體操作為:酶解液II經精濾除去渾濁物，采用截斷分子量為2000Da的超濾膜進行超濾，透過液濃縮干燥，獲得分子量2000Da以內的蠶蛹肽粉。
全文摘要
本發明公開了一種游離酶與固定化酶聯合水解制備蠶蛹肽的方法，步驟如下將脫脂蠶蛹配成料液，加入堿性蛋白酶酶解，得到酶解液Ⅰ；將酶解液Ⅰ轉入固定化酶反應器中，加入固定化蛋白酶進行酶解，得到酶解液Ⅱ；酶解液Ⅱ進一步過濾、干燥，得到蠶蛹肽粉。本發明聯合使用游離堿性蛋白酶與固定化蛋白酶水解脫脂蠶蛹粉制備蠶蛹肽，游離的堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹進行初步分解，可以將不溶性的蠶蛹蛋白轉移至水相，濾除固態殘渣后再轉入固定化酶反應器繼續水解，可以避免固態殘渣損傷固定化酶顆粒、堵塞液流通道、降低流速；固定化的蛋白酶可從反應體系中回收后重復使用5～8次，降低了生產成本。
文檔編號C12P21/06GK103103243SQ201310022919
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者方佳茂, 孫中濤, 陳偉濱 申請人:廣東環西生物科技股份有限公司