專利名稱：薺菜CBF途徑關鍵基因CbCBF的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、植物基因工程技術領域。具體涉及植物逆境誘導啟動子
的克隆及其應用。通過鑒定、克隆一個薺菜受低溫誘導的、能調控冷誘導基因的轉錄因子基 因的啟動子，將其應用于植物逆境基因特別是用于植物抗寒基因的遺傳轉化，達到提高植 物抗寒性的目的。
背景技術：
植物對環境變遷及不良環境有足夠的適應性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統進 化的遺傳基因型控制，又受個體發育中的生理生態因素制約。溫度作為重要的環境因子之 一，限制植物的分布及生長和產量，對植物生長發育起著決定性作用(Viswanathan C， Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold—regulated gene transcription.Philos Trans R Soc Lond B BiolSci. 2002， 357 (1423) :877-886.)。隨著轉基因技術的日益成熟，人們已 從植物中分離了大批抗寒相關基因(藺忠龍，李維薇，白現廣，呂廣磊，程在全.植物抗凍基 因最新研究進展，北方園藝，2009(1) :119-123)用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相關基 因進行轉基因抗寒植物培育時均發現在獲得優良低溫抗性植株的同時，普遍出現不同程度 的生長延滯(retardation)現象。主要是利用抗寒相關基因進行的轉基因植物都是在組成 性啟動子CaMv(cauliflowermosaic virus) 35S驅動下產生的。這種基因的組成性表達對植 物的生長造成了一定的影響。為了克服轉基因植物出現的生長延滯現象，人們開始利用冷 誘導特異性啟動子代替組成性啟動子。冷誘導基因RD29A(來源于擬南芥C0R78基因)啟 動子驅動的轉基因植株的研究表明，轉基因植株的生長延滯比CaMV35S啟動子驅動的轉基 因植株所表現出來要輕微得多(Kasuga M， Miura S， Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene an dstress—inducible RD29A promoter improved drought and low_temperature stress tolerance intobacco by gene transfer. Plant Cell Ph siol，2004，45 :346-350)。利用特異性的誘導型啟動子避免外源基因在宿主植物中非特異 性的持續、高效表達已經得到廣泛共識，但是真正能應用于生產實際的特異性啟動子不多， 而冷誘導型特異啟動子更少。目前特異啟動子的克隆及其結構功能的研究是轉基因植物研 究中的一個熱點，也是一個生發點。這一領域的研究成果將極大推動轉基因植物基礎研究 的進展，加速轉基因植物的產業化。 薺菜(C即sella bursa-pastoris)是一種1年或2年野生的草本植物，平鋪地面， 喜陰，在南方是隨處可見的一種可食用的蔬菜，屬于十字花科、薺菜屬C即sella Medik，在 低溫條件下能夠正常生長發育并結實。以前的研究證實薺菜中存有CBF抗逆應答機制，薺 菜中的CBF基因(GenBank登錄號AY391121)的全長cDNA序列1034bp，包括一個雙向的核 定位序列(NLS)結構域， 一個推定的60個氨基酸基元的AP2結構域和一個ALA-Rich結構 域。冷適應分析表明薺菜中的CBF基因的表達受冷誘導調節(Wang X， Liu S， Liu X， Chen Z， Liu X， Pang Y， S皿X， Tang K. Molecular Cloning and Characterization of a CBF Genefrom Capsella bursa-pastoris. DNA sequence. 2004， 15 (3) :180-187)。本發明所涉及的薺菜CBF途徑關鍵基因CbCBF基因的啟動子是從薺菜葉片的總DNA中克隆到的。目前 尚未發現利用薺菜CBF途徑關鍵基因CbCBF基因啟動子用于培育耐寒植物的相關報道。

發明內容
本發明的目的是克隆、鑒定一個低溫強烈誘導表達的植物內源啟動子，并利用該 啟動子構建抗寒相關基因表達載體，通過遺傳轉化方法達到提高植物的抗寒性，最終獲得 抗(耐)寒能力明顯增強的優良植物品種。 本發明首先分離得到低溫強烈誘導表達的啟動子，所提供的低溫強烈誘導表達的 啟動子來源于薺菜。該啟動子控制的薺菜內源基因為編碼受低溫誘導的、能調控冷誘導基 因的轉錄因子CBF(CRT/DRE binding factor)家族的一個成員，被命名為CbCBF，故該啟動 子記為CbCBFP(CbCBF Promoter) 。 CbCBFP啟動子是具有序列表SEQ ID NO:l中的堿基第 1-1623位的序列。CbCBFP啟動子控制的CbCBF基因是具有序列表SEQ ID NO. 1中堿基第 1624-2283位的編碼序列或含有與其編碼的蛋白質同源性至少在80%以上具有相同功能 的序列。 本發明所提供的CbCBFP啟動子區域含有兩個ABRE順式作用元件，三個MYCB順 式作用元件(附圖l)，前者能特異性地對低溫和ABA起應答反應，后者是上游調控因子 ICE(inducer of CBF expression)基因的冷調控元件ICE盒，是ICE基因的結合位點。
本發明利用CbCBFP啟動子構建了誘導性表達載體，該表達載體可以在植物受到 低溫脅迫時強烈地誘導報告基因GUS的表達。 利用本發明所提供的CBFP啟動子構建的植物表達載體轉化模式植物煙草，檢測 轉基因煙草的抗寒的生理指標，顯示植株耐寒性能有了顯著提高。
本發明進一步詳細描述如下 —種分離出的薺菜DNA分子，它的核苷酸序列如序列SEQ ID NO. l所示，其中薺菜 CbCBF基因及其啟動子CbCBFP包含序列表SEQ ID NO. 1所示序列中的2283位堿基的核酸 序列，該核酸序列編碼一個受低溫誘導的、能調控冷誘導基因的轉錄因子。
所述薺菜啟動子CbCBFP區包含兩個串聯排列的ABRE順式作用元件ACGTGGC和 CACGTG，和三個MYCRE順式作用元件CANNTG。 所述的啟動子CbCBFP全部或部分序列構建的植物表達載體。 所述的啟動子CbCBFP全部或部分序列構建的植物表達載體，通過遺傳轉化培育 抗寒植物的方法。 所述的啟動子CbCBFP全部或部分序列構建的植物表達載體，通過遺傳轉化培育 抗寒植物材料。所述的抗寒植物材料是指植株、種子或無性細胞系。 按照以上的技術方案，很顯然，人們可以利用本發明所提供的CbCBFP啟動子構建 抗寒相關基因的表達載體轉化植物以提高植物的抗寒性。受體植物主要包括水稻、小麥、玉 米等在內的禾谷類作物，當然也包括其他一些重要的經濟作物，例如棉花、油菜或番茄作物 上的應用。 序列表SEQ ID NO. 1，為本發明克隆的包含啟動子序列CbCBFP的薺菜冷誘導轉錄 因子CbCBF基因序列全長和引物的序列。序列表SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 4，為本發明用于克隆薺菜CbCBF基因啟動子CbCBFP序列的引物序列。 序列表SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6，為本發明用于克隆薺菜CbCBF基因序列的引物 序列。


圖1顯示的是CbCBF基因啟動子區順式作用元件。斜體標注序列為開放閱讀框 (ORF);兩個ABRE元件用和三個MYCRE順式作用元件加文本框表示；灰色背景顯示的是基 本啟動子元件序列。雙下劃線為擴增CbCBF基因所用的引物序列；單下劃線序列為擴增 CbCBF基因啟動子所用的引物序列。 圖2顯示的CbCBF基因的誘導表達。結果表明只有在低溫誘導條件下(4°C for 8h) ， CbCBF基因才出現表達條帶。
具體實施例方式
下面結合具體的試驗數據和實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常 按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1薺菜CBFP啟動子的分離和鑒定
1.薺菜幼苗的培養 薺菜種子來源于上海市種子公司，薺菜種子經過消毒處理后，播種于含有MS。培養 基的培養罐內，置于25t:下培養4周，其中光照周期為16h光照，8h黑暗。
2.啟動子序列的克隆 采用Genome walking技術擴增薺菜CbCBF基因的啟動子序列。實驗操作按照 UniversalGenomeWalker Kit (CLONTECH)的使用手冊進行。薺菜的Genome walking庫建 好后，根據CBF基因(GenBank Accession No. :AY391121)的cDNA序列的開放閱讀框(ORF) 設計2條引物5' -TCCGACGAACTCCTC TGTAAAC TGG-3'(記為SEQ ID NO. 2)和5' -CGGG TCTCACGAMCTTCTTCCTAC-3'(記為SEQ ID NO. 3)，與試劑盒中的2個接頭引物配合，進行兩 輪PCR反應，同時電泳檢測兩輪PCR擴增產物。挑選第二輪中的特異條帶進行克隆、測序。 根據測序結果，進一步設計1條引物(5' -AAGGCTGTTACTCACTCATTGTC-3')(記為SEQ ID NO. 4)，與試劑盒中的接頭引物2配合，進行第3輪PCR反應，電泳檢測并克隆、測序。
測序顯示克隆到的CbCBF基因的啟動子序列全長1623bp(記為SEQ ID NO. 1)。薺 菜CbCBF基因編碼框的第一個起始密碼子在(1624-1626bp)處，第一個起始密碼子ATG前 的1623個堿基為CbCBF基因的5'側翼序列，命名為CBFP。
實施例2薺菜CBF途徑關鍵基因CbCBF基因的誘導表達 通過半定量RT-PCR驗證CbcbfmRNA的表達受低溫誘導。以野生型薺菜為材料， 依次按照三種不同的低溫誘導條件處理材料28°C 4d;4°C 8h;28°C 4d。依次提取三個不 同階段的三種薺菜葉片總RNA，電泳檢測并測定所抽提RNA的OD，值。使用One St印PCR Kit(Takara)進行半定量RT-PCR。 RT-PCR反應條件為50°C 30min，隨之94°C lmin，60。C lmin和72t: 2min進行30個循環。未誘導的RNA被抽提用于ubiquitin基因(約250nt)的擴增(AY189972)，用作對照便于更好的比較分析。 結果表明只有在低溫誘導條件下(4°C for 8h)， CbCBF基因才出現表達條帶(圖 2)。這說明CbCBF基因的轉錄是受低溫條件觸發的，并且當解除誘導條件時，其轉錄不能維 持很長的時間。該結果證明CbCBF基因的確與冷適應過程相關。
實施例3薺菜CBFP啟動子低溫誘導活性分析 在該實施例中，將克隆得的薺菜CBFP啟動子序列連至pCAMBA1301載體上 (由澳大禾U亞CAMBIA[the Center of the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture， Australia]提供)，構建一個驅動GUS基因的植物表達載體。 瞬時表達實驗表明，在單子葉和雙子葉植物中，薺菜CBFP啟動子均在低溫誘導下能增強 GUS基因的表達。因此，薺菜CBFP啟動子在作物抗寒基因工程中具有較好的應用前景。
瞬時表達載體的構建 在本實施方案中，構建成瞬時表達載體pCAMBA1301-CBFP-GUS 切除商品化的植物表達載體pCAMBA1301自帶的CaMV35S啟動子，連入薺菜CBFP
啟動子，調控GUS基因的表達。用商品化的植物表達載體pCAMBA1301，作為薺菜CBFP的啟
動子在單子葉和雙子葉植物中瞬時表達實驗的對照。 基因槍法轉化玉米胚性愈傷組織和煙草幼葉 以1300psi系統壓力和28時滎柱真空度，在Bio-Rad公司DuPont PDS1000/He型 基因槍上，分別轉化玉米胚性愈傷組織和煙草幼葉，每槍1 P g質粒DNA。玉米胚性愈傷組織 在N6培養基上誘導培養，煙草幼葉在1/2MS培養基上培養。用薺菜CBFP啟動子啟動的誘 導型表達載體pCAMBA1301-CBFP-GUS轉化，以組成型表達載體pCAMBA1301為對照，各轉化 玉米胚性愈傷組織150塊和煙草幼葉90片。
低溫逆境處理和GUS組織化學染色 轉化后將1/2玉米愈傷組織轉移至Ne培養基上，27t:黑暗培養；l/2煙草幼葉轉移 至1/2MS培養基上，24t:條件下，每天16h光照培養，作為正常生長條件的對照。同時將另
外1/2玉米愈傷組織或煙草幼葉在原培養基上于4t:低溫培養。 處理3d以后，用GUS反應液(0. lmol/LNaH2P04緩沖液，pH 7. 0 ; 10mmol/LEDTA， pH 7. 0 ;5mmol/L鐵氰化鉀；5mmol/L亞鐵氰化鉀；1. Ommol/L X-gluc ;0. 1% Triton X-100)浸 泡上述各處理的玉米愈傷組織或煙草幼葉，抽真空(200Mbar，重復2次，每次30s) ，37。C溫 育16h，用蒸餾水清洗。玉米愈傷組織無色素干擾，直接在顯微鏡下觀察拍照。煙草幼葉有 色素干擾，用固定液(無水乙醇冰乙酸=3 : 1)固定lh，25% _95%乙醇逐級脫色脫水， 蒸餾水清洗，然后觀察拍照。 GUS基因的表達產物，可將反應液中的X-Gluc水解成藍色物質，使組織呈現藍色， 藍色的深淺及斑點數量，能在一定程度上反應GUS基因的表達水平。在低溫和對照條件下， 用組成型表達載體pCAMBA1304轉化的玉米愈傷組織和煙草幼葉，正常顯現藍色斑點。用冷 誘導表達質粒pCAMBA1304-CBFP-GUS轉化的玉米愈傷組織和煙草葉片，在正常培養條件下 檢測不到藍色斑點，無法鑒別陽性克隆，但在高鹽和低溫條件下，玉米愈傷組織和煙草幼葉 均顯現藍色斑點，斑點的面積和著色強度均高于用組成型表達載體轉化的對應處理。由此 說明，薺菜CBFP啟動子在單子葉和雙子葉植物中，均可受低溫誘導，啟動結構基因的表達。
實施例4利用薺菜CBFP啟動子控制CBF基因轉化煙草提高抗寒性
植物表達載體的構建 構建植物表達載體pCAMBA2301-CBFP-CbCBF。 在本實施方案中，CbCBF基因被置于CBFP啟動子之后，再連至pCAMBA2301 ，構建一
個植物表達載體，用于植物的轉化。 農桿菌介導法對煙草的轉化 1.農桿菌的培養挑取單菌落，在2ml農桿菌液體培養基中，28t:培養過夜；取 lmL以上培養物，加入50mL農桿菌液體培養基中，28t:培養至0D6。。 = 0. 6_1. 0 ;8000rpm離 心10min，收集菌體，用MS。重懸，使0D6。。 = 1. 0。 2.共培養取煙草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0.8cmX0.8cm 左右的葉盤，放在MS工培養基上，防止葉盤脫水；將葉盤放入農桿菌培養液中，190rpm，28t: 搖床上浸染10min ;用藥勺撈出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸干葉盤上的多余菌液；將吸 干的葉盤平放在加蓋一層濾紙的MS工培養基上，25t:左右，于暗處共培養約2d。
3.誘導叢生芽共培養后，按以下步驟將葉盤表面的農桿菌洗掉，其間不時搖動， 使葉盤充分接觸下列溶液無菌水，15min ;無菌水+羧芐青霉素(500mg/L) ， 15min ;MS。+羧 芐青霉素(500mg/L)，20min。用藥勺撈出葉盤，放在吸水紙上，吸干多余水分；將葉盤放在 MS2培養基上，葉盤邊緣輕壓入培養基中；25t:左右，16h光照培養。 4.誘導生根在MS2培養基上誘導約4周后，將葉緣長出的幼芽從基部與葉盤切 開，將幼芽插入MS3培養基中誘導生根，25t:左右，16h光照培養。
轉基因煙草微暈DNA提取及PCR檢測篩選 1.取少量轉基因植株葉片，剪碎，置研缽中，加入lmL提取緩沖液(10Ommol/L Tris ClpH 8.0，20mmol/L EDTA， 500mmol/L NaCl，1.5% SDS)，石開磨成槳。
2.吸入1. 5mL EP管中，劇烈搖動混勻。
3. 60。C水浴保溫30-60min，不時顛倒混勻。
4.室溫下10000rpm離心5min。 5.小心吸取上清于新的離心管中，加入等體積氯仿，劇烈震動。
6.室溫下10000rpm離心5min。
7.小心將上清吸入新的離心管中。 8.加入1倍體積異丙醇，室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉淀。8000rpm離心 5min，棄掉上清；75%酒精洗一次，晾干沉淀。9.加入5 ii L RNaseA(lO y g/ y L) ， 37°C 10min，除去RNA。
10.加50-100 ii L水融解，-20。C貯存。 11.以提取出的DNA為模板，用表達載體自帶HYG基因引物及CbCBF基因特異性引 物分別進行PCR反應，鑒定目的基因在轉基因煙草基因組中的表達狀況。
轉基因煙草的DNA提取Southern blot檢測 煙草葉片DNA的提取取煙草葉片100mg，加入500 y 1提取緩沖液[1倍體積的 DNA提取緩沖液[(63. 77g/L山梨糖醇，12. lg/L Tris-HCl pH8. 2， 1. 861g/L EDTA-NaJ); 1倍體積的核酸裂解緩沖液(200ml 1M Tris-HCl pH 7. 5， 200ml 0. 25M EDTA， 400ml 5M NaCl，20gCTAB，200ml MQ Water) ;0. 4倍體積的5% SDS ;使用前加入亞硫酸氫納(終濃度為 0. 02M)]，65。C水浴放置30min后，加750iil氯仿:異丙醇(24 : 1)，離心(12000rpm) 5min，移取上清液到一新離心管中，加入同體積的冷異戊醇，搖動，直到DNA沉淀出現。離心 (12000rpm) 10min，棄去上清液。用70%乙醇洗沉淀，干燥后溶于適量的TE中。
應用分光光度法定量分析DNA或RNA，具體操作步驟如下用TE或蒸餾水對待測 樣品做適量的稀釋。用TE或蒸餾水作為空白，在波長為260nm，280nm及310nm處調節紫外 分光光度儀讀數至零，加入樣品溶液于三處波長處讀取OD值，記錄OD值，并通過計算確定 DNA或RNA的濃度和純度。 探針的制備我們設計了用于克隆薺菜的CBF的核苷酸序列的引物 (5' -ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT-3'和5' -CTACTTGGTGGCATCCTTAG-3')(分別記為SEQID N0.5和記為SEQ ID N0.6)，獲得擴增片段長度為660bp(CbCBF基因)作為雜交探針的模板， 采用PCR法對探針實行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP) (PCR DIGProbe Synthesis Kit, Roche)標記。于冰水上在2個標號的500 y L E卯endorf管中分別加入CbCBF的膠 回收產物0. 1 ii L， 10XPCR buffer (with MgCl2) 5 ii L， 10XPCR Dig Mix 5iiL，10XdNTP stock solution 5 u L， 10 u mol/L弓l物11 u L， 10 u mol/L弓l物21 u L， Enzyme mix, Expand High Fidelity 0. 75 ii L(2. 6單位)，ddH20 32. 15 ii L，總體積50 ii L。混勻后轉到已預熱到 94°C的PCR儀上進行擴增，擴增程序為94。C ， 2min — (94°C ， 30sec — 60°C ， 30sec — 72°C ， 40sec) X30cycles — 72。C，10min。每管取5 y L PCR產物經瓊脂糖/溴乙錠/1 X TAE凝膠 電泳和紫外檢測后，判斷探針是否標記上及濃度。 酶切選取探針序列中不具有識別位點的限制性內切酶EcoRI和HindIII分別對 薺菜基因組DNA進行酶切，在2只500 ii L E卯endorf管中分別加入以下成分成分EcoRI組HindiII組10X buffer15ii L NEBuffer215ii L NEBuffer2DNA40ii "30ii g)40ii "30ii g)酶(10imits/u UEcoRI 12ii LHindIII 12iiL去離子H2083ii L83ii L 輕輕混勻后于37t:溫育24h以上，酶切3h后輕輕混勻一次，酶切24h后每管取 5 L于0. 5%瓊脂糖/溴乙錠/1 X TAE凝膠電泳，直至確認酶切已基本徹底后轉入下一步。 Southern凝膠電泳向每管酶切產物中加入355 ii L ddH2(^P 500 ii L酚氯仿 異戊醇，顛倒混勻lOmin ; 1. 12000rpm離心lOmin ; 2.吸上清，加入1000 ii L-2(TC預冷的無水乙醇，混勻； 3. 12000rpm離心lOmin ; 4.棄上清，稍干燥后用30 ii L TE (pH 8. 0)溶解沉淀； 5.配制0.8%瓊脂糖/1 X TAE凝膠; 6.凝膠冷后向每管DNA酶切產物中加入5 ii L6X上樣buffer,上樣； 7.常溫下于1. Ov cm—1電泳12小時左右至溴酚蘭遷移至凝膠的五分之三距離。 Southern凝膠轉膜和固定 1.電泳完畢后取出凝膠，切去多余的膠體，切下左上角作為標記，沒于變性液中振
總體積
150 ii L
150 ii L蕩變性45min ; 2.棄去變性液，用ddH20稍事清洗后于中和液中振蕩中和2X 15min。 3.架好毛細管轉膜的平臺，倒入500mL 20 X SSC于鋁盒中，鋪好雙層3匪濾紙橋并
潤濕； 4.將凝膠孔口一面向下置于平臺上，趕去氣泡； 5.切一張與凝膠一樣大小的HyboncHT尼龍膜，潤濕后鋪于凝膠上，趕去氣泡；
6.用Parafilm圍住凝膠的四邊，以防短路； 7.切取與尼龍膜一樣大小的兩層3匪濾紙鋪于尼龍膜上，趕去氣泡； 8.壓上一疊與尼龍膜相同面積的吸水紙，頂上均勻壓一 500g左右的法碼盒，轉膜
24h以上； 9.轉膜完成后，取下凝膠用溴乙錠染色10min，并進行紫外檢測，檢查轉膜效率； 10.同時用6 X SSC漂洗尼龍膜2 X 5min ; 11.將尼龍膜置于吸水紙上于室溫晾干30min ; 12.用3匪濾紙裹住尼龍膜于80°C固定2h ; 13.將尼龍膜包裹于錫泊紙中，室溫保存備用。 探針與尼龍膜的Southern雜交和檢測 1.將尼龍膜取出浸入2XSSC中5min， DNA面向上鋪于雜交管中； 2.加入20mL DIG Easy Hyb (Roche)，于Shake <n， Stack雜交爐(Hybaid)中于
42。C轉動預雜交30min ; 3.倒出預雜交液，加入12mL新鮮的DIG Easy Hyb，繼續于42"轉動預雜交；
4.將適當數量的檢測已標好的探針液于沸水浴中水浴變性5min，冰水中急冷 3min ; 5.將探針迅速加入到熱的DIG Easy Hyb中，42。C轉動雜交16h ;6.雜交時間到后取出尼龍膜，溫室下于2XSSC、0. 1% SDS洗2X5min ; 7.68。C下于0. 1XSSC、0. 1% SDS中洗滌尼龍膜2X 15min ;8.室溫下于100mL Washing Buffer (Roche)中振蕩漂洗膜2min ; 9.室溫下將膜于lOOmL Blocking Solution中振蕩阻斷lh ; 10.室溫下將膜于20mL AP Solution(DIG Luminescent Detection Kit, Roche)
中振蕩平衡30min ; 11.室溫下于lOOmL Washing Buffer中振蕩漂洗尼龍膜2 X 15min ; 12.室溫下將尼龍膜與20mL Detection Buffer加G Luminescent Detection
Kit, Roche)平衡3min ; 13.將膜于雜交袋中，DNA —面向上并均勻鋪上lmL CSPD(DIG LuminescentDetection Kit, Roche)，封閉均勻，于37。C預熱lOmin ;
14.于暗室中壓上一張Fuji X光片，37t:保溫10min左右； 15.顯影、停影和定影。定影完成后用大量自來水沖洗膠片，晾干后按編號對應在 膠片上標出編號和三個標記點的位置，剪下每張膜對應的膠片。
轉基因煙草的總RNA提取及Nouthern blot檢測
轉基因煙草的總RNA提取
探針的制備 采用southern blot設計的兩對引物，以薺菜總RNA為 模板，分別克隆薺菜CBF的cDNA序歹lj (5 ' -ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT-3 ' 和 5' -CTACTTGGTGGCATCCTTAG-3')(見記為SEQ ID NO. 5和記為SEQ ID NO. 6)，獲得擴增 片段長度分別為660bp(CbCBF基因)作為雜交探針的模板，配制瓊脂糖甲醛變性凝膠于一 支18(TC干烤2h的三角瓶中加入DEPC處理過的水37. 5mL ;10XM0PS 7. 5mL ;RNase-free 的低熔點瓊脂糖0. 55g ;總體積45mL。于微波爐中化膠，冷至60°C時加入10mL甲醛，混勻 后待冷至45t:左右倒膠，插上3mm梳子，凝膠冷后備用。 RNA變性樣品的制備和電泳取30株轉基因煙草植株的葉片和4tH秀導的轉基因煙 草植株的總RNA。事先采用乙醇沉淀法將RNA樣品濃縮至3 i！ g/ i！ L以上，并計算出每個樣 品所需RNA的y L數，準備相應數量的RNase-free的500 y L E卯endorf管，編號后分別加 入總RNA 30iig;甲醛7iiL;去離子甲酰胺20iiL;10XM0PS 2ii L ;DEPC處理過的水補足 至40 ii L混勻后于65。C變性10min，冰上急冷，加入微量溴乙錠和6 y L RNase-free的上樣 buffer,立即上樣，在1XM0PS緩沖液中于lv/cm電泳，待溴酚蘭遷移至凝膠的一半距離時 轉膜。 Northern凝膠轉膜、固定和雜交檢測電泳完畢后取出凝膠，切去多余的膠體，切下 左上角作為標記；凝膠用DEPC處理過的水稍事清洗；采用DEPC處理過的20XSSC轉膜；在 RNase-free的環境下預雜交、雜交(均在50°C )和洗片。雜交過程均同Southern雜交和 檢測。 轉基因煙草的耐寒性試驗 將生根兩周的轉基因苗與同時期栽培生長狀況類似的野生型煙草苗置于4t:光照
培養，冷適應3d，之后置于-151:處理暗l-2h，記錄存活苗數量。實驗設置三組重復，通過 t-檢驗評價轉基因組與野生型對照組差異的統計學意義。 通過低溫處理檢測煙草苗存活率可見，-15t:處理lh后，Cbcbf轉基因植株存活率
顯著高于野生型對照；2h后Cbcbf存活率降低，依然明顯高于野生型植株。三組重復實驗
數據根據t-檢驗證明P < 0. 05，符合統計學意義。提示薺菜基因Cbcbf的啟動子及其編碼
蛋白在植物耐寒性和抗凍性提高方面有重要作用。 薺菜抗寒基因啟動子核苷酸序列表 SEQ ID NO. 1 〈110>復旦大學 〈120〉薺菜CbCBF基因的編碼序列 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>2283
〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris)
〈400〉 1 CGACGGCCCG GGCTGGTCTG MGACMGAG GATTGTAAGA GTCTMGAGA AATGTGGTGG 60
TCGTTGMCT TGAAGGGAAG MGAGMGAG GATCGTAAGA GAAAGGTGGT GGTTGAAGGA 1209/11頁6570 75GGAACT TTCCCT ACGGCC GAG ATG GCT GCT CGT GCT CAC GAC GTC GCC1908GlyThr PhePro ThrAla Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala808590 95GCTATA GCCCTC CGTGGC AGG TCA GCC TGT CTC MT TTC GCT GAC TCT1956Alalie AlaLeu ArgGly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser100105 110GCTTGG CGGCTA CGGATC CCC GAG TCA ACA GGC GCC MG GM ATC CAG2004AlaTrp ArgLeu Arglie Pro Glu Ser Thr Gly Ala Lys Glu lie Gin115120 125MGGCG GCGGCT GMGCT GCG CTG GCC TTT CAG GAT GAG ATG ATG ATG2052LysAla AlaAla GluAla Ala Leu Ala Phe Gin Asp Glu Met Met Met130135 140AGCGAT ACCACG ACGACG GAT CAT GGC TTT GAC ATG GAG GM ACG TTT2100SerAsp ThrThr ThrThr Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Phe145150 155GTGGAA GCAATT GTGACG GCG GM CAG AGC GCT TCG TTA TAT ATA GAC2148ValGlu Alalie ValThr Ala Glu Gin Ser Ala Ser Leu Tyr lie Asp160165 170 175GAAGAG GACATG TTCGGT ATG CCG AGT TTG ATG GCT AGT ATG GCC GM2196GluGlu AspMet PheGly Met Pro Ser Leu Met Ala Ser Met Ala Glu180185 190GGTATG CTTTTG CCTCTG CCG TCC GTA CM TGG AAC CAC MC TAT GAC2244GlyMet LeuLeu ProLeu Pro Ser Val Gin Trp Asn His Asn Tyr Asp195200 205ATCGAC GGCGAT GATGAC GTC TCG CTA TGG AGT TAT TAA2283lieAsp GlyAsp AspAsp Val Ser Leu Trp Ser Tyr210215SEQID NO. 2〈211>25〈212>DNA〈213〉薺菜(C即sellabursa-pastoris)TCCGACGAACTCCTCTGTAAACTGGSEQID NO. 3〈211>25〈212>DNA〈213>養菜(C即sella bursa-pastoris)CGGGTCTCACGAAACTTCTTCCTACSEQID NO. 4
〈211>23 〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris) AAGGCTGTTACTCACTCATTGTC SEQ ID NO. 5 〈211>20 〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris) ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT SEQ ID NO. 6 〈211>20 〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris) CTACTTGGTGGCATCCTTAG
權利要求
一種分離的具有低溫誘導表達特性的薺菜啟動子，其特征在于該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO1中堿基第1-1623位的序列所示，記為CbCBFP。
2. 根據權利要求1所述的薺菜啟動子，其特征在于該啟動子區包含兩個串聯排列的 ABRE順式作用元件ACGTGGC和CACGTG，和三個MYCRE順式作用元件CANNTG。
3. 如權利要求1所述的薺菜啟動子CbCBFP的植物表達載體，其特征在于CbCBF基因置 于薺菜啟動子CbCBFP之后，再連至pCAMBA2301，記為pCAMBA2301_CBFP_CbCBF。
4. 如權利要求1所述的薺菜啟動子CbCBFP在培育抗寒作物中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種薺菜CBF途徑關鍵基因CbCBF的啟動子CBFP及其應用。該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其中CbCBF基因及其啟動子包含序列表SEQ ID NO1所示序列中的2283位堿基的核酸序列，該核酸序列編碼一個受低溫誘導的、能調控冷誘導基因的轉錄因子。啟動子區域包含兩個串聯排列的ABRE順式作用元件，能特異地對低溫和ABA起應答反應，和三個MYCRE順式作用元件CANNTG，能與上游調控因子ICE(inducer of CBF expression)基因結合。利用該基因啟動子構建的誘導性表達載體可以在植物受到低溫脅迫時強烈地誘導目標基因的表達。本發明還提供上述啟動子在培育抗寒植物中的應用，實現農作物品種的改良。
文檔編號C12N15/11GK101693891SQ20091019752
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月22日 優先權日2009年10月22日
發明者吳麗華, 周明琦, 林娟 申請人:復旦大學;