專利名稱：一種凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子。
背景技術：
凡納濱對蝦俗稱南美白對蝦，是世界上最重要的三種經濟對蝦之一，也是我國重要的海水養殖種類，目前可占我國對蝦總產量的80%以上。然而，當前凡納濱對蝦的養殖業存在著種質退化、病害頻發的難題，特別是對蝦白班綜合征病毒(WSSV)的大規模爆發嚴重 制約了我國凡納濱對蝦養殖業的健康發展。轉基因是物種種質改良的重要手段，其一般指將人工構建的基因功能元件導入到生物體基因組中，達到改變生物體的性狀的目的。當前，轉基因技術在經濟動植物的性狀改良中表現出了巨大的潛在應用價值，如轉抗病害基因農作物，轉生長因子鮭魚以及可以在乳腺中分泌藥物的轉基因動物(生物反應器)等。轉基因技術在凡納濱對蝦中也有著廣闊的應用前景，如將抗病基因導入對蝦中，產生抗病品系，將有可能從根本上解決當前對蝦養殖業中WSSV頻發的頑疾；將生長因子類的基因導入對蝦中，有希望培育出高產、低生長周期的品系，縮小養殖成本，增加養殖效益。當前，在凡納濱對蝦中尚無轉基因的應用。除導入及整合方法的限制外，可用基因元件(包括對蝦源啟動子和功能基因)的缺乏也是重要的限制因素之一。啟動子是人工構建轉基因載體的不可或缺的重要組成成份，它決定了所轉入的基因的表達情況，如表達時間、部位、強度等等。熱休克蛋白HSC70是一種重要的生物活性蛋白，參與了生物體內眾多的生理過程。Hsc70基因表達的一個重要特征是呈組成型表達，而在高溫或病原刺激下又能呈上調表達趨勢；而這種表達特征主要取決于hsc70基因的啟動子組成。將hsc70基因的啟動子元件應用于轉基因研究中，可以通過控制溫度的高低方便地調控導入基因的表達量，使生物體的性狀按照人類的意志進行改變，有重要的應用價值。此外，由于該啟動子來自于凡納濱對蝦本身，不存在病毒啟動子可能引起的生物安全問題，安全高效。該專利對凡納濱對蝦hsc70基因啟動子的發現和其功能的闡明與應用，將有助于凡納濱對蝦轉基因育種技術的研究及經濟性狀的改良。

發明內容
本發明目的在于提供一種凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子為下述任一項(I)凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子為序列表中SEQ ID NO. I堿基序列；(2)與序列表中SEQ ID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列；(3)是序列表中SEQ ID NO. I的片段、遺傳變體或缺失體，且能控制下游基因轉錄的DNA分子。
所述啟動子作為啟動海洋生物組織特異性地表達目標基因的啟動子的用途。所述啟動子與與之進行可操作的有效基因連接，而后插入載體中構成表達載體。所述有效基因包括如免疫相關基因LGBP、hsp70、lectin、toll等，生長相關基因如myostatin、actin、tubulin、EGF 等，其它重要生理基因如 vasa、SOX、BMP、NOTCH 等；載體為表達載體如 pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等。而后以可表達的方式將有效基因與所述的啟動子連接，得重組片段；將上述重組片段插入載體中；用該載體轉化宿主細胞，培養該細胞表達有效基因。本發明具有如下優點I.本發明獲得凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子，其采用BAC克隆全測序及啟動 子預測方法，比傳統的染色體步移方法更簡單快捷。2.本發明將凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子用于轉基因載體構建的優勢在于(I)熱休克蛋白hsc70是一種組成型表達的基因，并且其基因啟動子在熱刺激后表現出表達量增加的現象。其在轉基因后即可源源不斷地表達目的基因，而且可以利用熱激法使目的基因有更聞水平的表達，從而控制目的基因表達量的聞低。另外，熱休克蛋白參與了對蝦體內多種生理過程，必定為一個高效表達的調控元件；用熱休克蛋白基因啟動子構建轉基因載體，所攜帶的外源基因表達效率很可能會大大提高。(2)在對蝦轉基因實驗中使用對蝦自身啟動子，不會帶入病毒等其他生物的核酸序列，具有更高的生物安全性，有利于將來轉基因對蝦進入市場。3.本發明使用EGFP基因為報告基因構建轉基因載體的優點在于EGFP是加強型綠色熒光蛋白，容易觀察和檢測，能極大地提高轉基因動物的篩選效率，有利于對蝦轉基因技
術的建立。


圖I為凡納濱對蝦轉基因表達載體pLvHscPl-EGFP構建示意圖。圖2為凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子表達載體pLvHscPl-EGFP轉染昆蟲細胞sf9的熒光觀察結果。圖中Al為熱激后3h熒光表達情況，A2為未熱激組；B1為熱激后6h熒光表達情況，B2為未熱激組。
具體實施例方式本發明利用BAC克隆篩選技術、啟動子預測技術、DNA擴增及測序技術克隆了凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子；在此基礎上利用載體構建技術將所克隆的啟動子與攜帶加強型綠色突光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的質粒結合，構建了攜帶凡納濱對蝦自源啟動子和EGFP報告基因的表達載體。它可以在昆蟲細胞中啟動基因的表達，且表達量可以經熱激后上調。實施例I含凡納濱對蝦熱休克蛋白基因hsc70的BAC克隆的篩選凡納濱對蝦BAC文庫克隆池的構建，包括以下步驟(I)板池的構建以一個384孔板為單位，將384個克隆等量混合，得到的混合克隆為一個板池。
(2)行池和列池的構建384孔板每一行的24個克隆等量混合，得到的混合克隆為一個行池，每一列的16個克隆等量混合，得到的混合克隆為一個列池。(3)超級池的構建將板池按一定順序排列到96孔板中，再對這些排放于96孔板上的板池進行行池和列池的構建。含凡納濱對蝦熱休克蛋白基因的陽性克隆的篩選根據凡納濱對奸hsc70基因序列(GenBank No. EF495128)設計正向引物5' -CCCTTCACCATCATCAACGAGA -3'及反向引物 5' -TCCAAGGTGCCACGGAACAGAT-3'。以構建的各克隆池為模板，用PCR方法篩選陽性克隆。首先以超級池為模板確定陽性克隆所在的384孔板，再以該板的行池和列池為模板，確定陽性克隆在板上的位置。以陽性克隆菌液為模板，進行PCR擴增。將PCR產物測序，證實確為扇貝熱休克蛋白基因hsp70序列。對確定含有柿孔扇貝熱休克蛋白基因序列的BAC克隆進行全測序。
凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子，如SEQ ID NO I.所示序列I TATGCGTCAGTGCGAGTGTGTGCATAAGTGCATGAAGAAACGTGATCATAGAGATTTTAC 6061 ATGAAACGTATAGAAGGATGAATGTATGAATGTATGAATGTATGCTATGTATGAAAATCC 120121 TGTAACGGTTAATGGTTAAATCAAATGAACGTACTAGACATCAGAGGCCATACAAAAACA 180181 ACAGAAAACCCTCGTCCTGTTTAGCAACGCGTTCTTTTCCGCTTTGCACCGGGTAGACCC 240241 CAGTCGTCACCGGAAGTGCTTTCATTTCCCACTAAATTTTTCCTTTCTCAACAACAGAAG 300301 AATCGTCAGCGCGTTTTGTTTCCAGAAATTAAAGCCAATCGATTTTCCACGCAGCATCTT 360361 CCTATTACGTAAAAGTTTTTCGCCAAAGCTTCGACGCACGAGACATAATATTCAGCGGAA 420421 TAATTCGTTTCGGAGCTTTTCTCGACGGAAGATGATCTCCCCGAAATACACCTTGTACTA 480481 AAAATGTAACTATTTATAACCAGACCGCATGTCCGTCACGTGAAGTTAGCATTCACGTGG 540541 AGGGTGTGAAGTTCCGCGAGAGGGTTGGTATGCCTGGAATATTTGGTAAAGCCTAGATCA 600601 TAATTTCGATTTCCGAATGATACAACGTCATTCTCTTTCTTATTCATCATCATATATCCG 660661 TCAACACATMTCCTACTAMTATCTCCTCGAMTTCTTAAAATAAAGCGTAATTCCAM 720721 CTCAAAACGAGTMTTACCATGTGMTAGTTACAGGTATGGCAGTGTATGGCAGCTGCCA 780781 GCCGCCGCGTCCCTTTMCAGAGGTTTGGTAAGTTCGAGACTGMTGGAATTTTACATGA 840841 MCGATATAAAGMCTGATGATTAATTATTTCTGTGAMTATGATMTGCATTTTCTTGC 900901 AGTAATTAGCTTTTCAGTTGMGAATATATATTTACCGTAGATTCCTTTATTTMTGAGC 960961 ATTTGTTACCGGMGTATMTGGTGGAAATCGATGGCCAAGAAMTTCTAGMTTCTATG 10201021 ATMGTTCTTACTGTATAATGAMTATAGATAAMTTAAATTGAAACTCTATGATMCTA 10801081 ATTAATTGTATTTGTACATAMCGMTTGTGTGATTCTATGMGATGCGAGAGAGTGTAA 11401141 CGTGTGAGTGTTTGAAATGTAGGTACGAGCGAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG 12001201 AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATAAAMGGACA 12601261 GGCTTTTCGGACATACMCAACAGTCTTACGCAATGAATTATATAATACTGTCGAGGGCA 13201321 TGTTMCTGAGTGATGTGTGATTCMGTTTTTATCMTGTGACTGATAAAGTTACCGAGG 13801381 ACAGCTGATGATTAGGMTTCGTAGAATMCAAMGACATATTTCMCACATTAAATATA 14401441 CGTCGTTAGAGTATGGATTGTATATTTACTGATATTGGTGTTTCCTTTTATATAAMCAA 15001501 MTAATTGTAGAMTTTTGGCGTTTTTATTTCATTTTTTTTTCTTTATTAGGAGTMGTA 15601561 CTCAGTCAMTGGGTATTTTMCGACCAGTTGACTGCATTTTCATTTTGAAMGTACCAT 1620
1621 CGCTTCTAATCATTMTGAGMCATTTAAGTCGMGCTTAAATCTGACTGCATGATATTC 16801681 TTGCTTTCGCCATATTACAAAAATMGTAMTAATGGAAACAAACTGCAATMGATTATA 17401741 ACACCTGTMGCCTGAMTGACTGTGMTATATTTTCAGCTATTATATCGAATAAATATG 18001801 ATTGGTTCAGTTGATGTAMCGTGTCATACCTTACACGAATTATATTTCACTACTATGAT 18601861 ACCTTTAGCGTTATTGTCMGACTGGTAACCCATAGACATTCTAGATATTATCMTTATC 19201921 ATMGCGAACMTTTACTMTAMGACACTTTTTTCCMCTGTGTCTGAAGMGTTATTT 19801981 TTACTCCGGGCTCTACGGTTGCATAAAGCCGGGCCACGTGATACTCTCGTAGATGGTCCC 20402041 CCGCGCCCAGACCTCGCTGGCTGGCTGGCTCGCTCTGCCATGAGGTCGCTTCCCACGTGG 2100 2101 TGACGGAGCCGCTGTCATGTTGGCACGCCTGGTACGCCGAGCCGTTCTGCGGTGACGCGC 21602161 GTAAMTTCCCGCCAAATATTGTCCAATCAGCGTTGACCATTCCGGCATTGTTGACCMT 22202221 GAGAACGGTTCTTTTACTACGTCACTGTTATGAAGCCCTACGATTGGGACCAGMGTGAC 22802281 GTCATGMCTAGGAGCTCTCTGMTGGCCMCGTTCCGAAGMGGTTCTAGMGGTTTAC 23402341 AAAGGGGTCGATGTCGCCGCTTTATGGATTTGTCGMGTCATACCAGCCGGAGACCGAGA 24002401 GAAGAGAGGACGTATTACAGCTAGCTCTMGGACTATTTAAAAATATCTAAMTAAGGTA 24602461 AGCCAATGATCTATTTG2477(a)序列特征*長度2477堿基對*類型核苷酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源凡納濱對奸(Litopenaeus vannamei)(f)特異性名稱Promoter實施例2凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子片段的克隆分析測得的BAC克隆全長，將編碼熱休克蛋白基因hsc70的第一個堿基記為+1。取-3800至O位置的堿基序列進行啟動子預測。在-700、-1600和-3100堿基處分別預測到三個分值很高(分別是0.701、0.773和0.696)的啟動子區域。經同源性比對得知，該基因在-1200堿基處還有轉錄，故將-3700至-1200間的堿基序列定為熱休克蛋白基因的啟
動子區。在該啟動子兩側設計引物，并加上不同的沒切位點(Xho I和BamH I)，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增啟動子區。設計正向引物Fl :5' -CTCGAGTATGCGTCAGTGCGAGTGTG -3'及反向引物Rl 5/ -GGATCCCAAATAGATCATTGGCTTACCTTAT-3'并在以下的反應體系中進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增SEQ ID NO I.所示序列表中啟動子區，PCR產物電泳并進行膠回收。反應體系模板(BAC質粒)1μ I ;正向引物(lOpmol/μ 1)0. 5μ I ;反向引物(lOpmol/μ 1)0. 5μ I ； IOxTaq DNA 聚合酶緩沖液 2. 5 μ I ；MgCl2 (2. 5 μ mol/L) I. 5 μ I ;脫氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) O. 5 μ I ；Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ;滅菌水18. 25 μ I ;總體積25 μ I。將膠回收純化所得PCR產物連接pMD19_T simple載體過夜；將連接產物轉化DH5ci大腸桿菌菌株，涂布含氨芐青霉素的平板，37 °C培養過夜；挑選含重組子的陽性克隆，利用載體引物M13 (正向引物5 ^ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ,;反向引物
-CAGGAAACAGCTATGAC-3/ )及啟動子序列特異引物PCR擴增并測序驗證，具體為步驟如
下挑取10個單克隆，并以挑取的單克隆細菌為模板，分別用上述兩組引物對其進行PCR擴增。反應體系為模板(單克隆菌液)1μ I ;正向引物(lOpmol/μ 1)0. 5 μ I ;反向引物(IOpmol/μ I) O. 5 μ I ; IOxTaq DNA 聚合酶緩沖液 2. 5 μ I ；MgCl2 (2. 5 μ mol/L) I. 5 μ I ;脫 氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) O. 5 μ I ；Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ;滅菌水18. 25 μ I ;總體積 25 μ I0兩組引物都有擴增、且電泳條帶大小與序列長度一致的的單克隆視為陽性克隆。提取陽性克隆的質粒(用TIANGEN普通質粒小提試劑盒，目錄號DP103)，對提取的質粒進行測序，證實質粒中所含的序列為目標啟動子序列。實施例3啟動子表達載體與轉基因載體pLvHscPl-EGFP的構建用限制性內切酶Xho I和BamH I對提取的質粒進行雙酶切，并回收SEQ ID NOI.所示序列表中啟動子片段；再用限制性內切酶Xho I和BamH I對載體pEGFP_l進行雙酶切，并回收被線性化的pEGFP-1載體；用T4連接酶過夜連接回收的啟動子片段和pEGFP-Ι載體。連接體系如下，pEGFP-Ι與啟動子片段的摩爾比控制在I : 2-6之間。將連接產物轉化DH5a大腸桿菌菌株，涂布含卡那霉素的平板，37°C培養過夜。挑選含重組子的陽性克隆。利用pEGFP-Ι載體引物和啟動子特異引物同時檢測。連接體系T4連接酶 I μ I ;10x Buffer I μ I ；pEGFP-1 I μ I ;啟動子片段 7 μ I ;總計，10 μ Io其中pEGFP-Ι載體引物如下正向引物FI :5' -CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGG-3'反向引物Rl :5' -CCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC-3'。實施例4轉基因載體pLvHscPl-EGFP的活性驗證(I)昆蟲細胞sf9的培養及傳代，將對數生長期的sf9細胞經計數，以6xl05/ml的細胞密度傳代至6孔板中，27°C過夜培養。(2)轉染，在細胞密度達到鋪板面積80-90%時開始轉染。轉染mix的配制用超純水配制IOOul濃度為20ng/ul轉染載體。混合均勻后加Fugene HD轉染試劑7ul，混合均勻。室溫放置15分鐘。加入到6孔板中，培養基液面以下，混合均勻。(3)轉染18h后對一組進行熱激42 °C 30分鐘，另一組不做處理。熱激后3h和6h時分別觀察兩組熒光表達情況，兩組均能觀察到熒光，而熱激組比未熱激組表達量高(參見圖2)。
權利要求
1.一種凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子，其特征在于凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子為下述任一項 (1)凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子為序列表中SEQID NO. I堿基序列； (2)與序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列； (3)是SEQID NO. I的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下游基因轉錄的DNA分子。
2.—種權利要求I所述的凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子的應用，其特征在于所述啟動子作為啟動海洋生物組織特異性地表達目的基因的啟動子的用途。
3.按權利要求2所述的凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子的應用，其特征在于以可表達的方式將有效基因與所述啟動子連接，得重組片段；將上述重組片段插入載體中；用該載體轉化宿主細胞，培養該細胞表達有效基因。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子。采用BAC克隆篩選及測序分析、啟動子預測、DNA擴增及測序、載體構建等技術得到凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子，具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列；在此基礎上用所克隆的啟動子與攜帶加強型綠色熒光蛋白(EGFP)的質粒結合，構建了含凡納濱對蝦自源啟動子的EGFP基因表達載體；將該表達載體轉染昆蟲細胞sf9，觀察到綠色熒光蛋白有較強的表達，且在熱激后有更高水平的表達；該發明獲得凡納濱對蝦熱休克蛋白基因啟動子，其采用含目的基因的BAC克隆全測序及啟動子預測方法，比傳統的染色體步移方法更簡單快捷。
文檔編號C12N15/63GK102757964SQ201110341708
公開日2012年10月31日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者張曉軍, 李富花, 相建海, 趙翠, 郇聘 申請人:中國科學院海洋研究所