專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組人Fc融合長(zhǎng)效干擾素的純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純化工藝領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種適合于重組人Fc融合長(zhǎng)效 干擾素(Fc-IFN)的純化工藝，根據(jù)目的融合蛋白特性?xún)?yōu)化純化工藝、提高目的蛋白的純度 和得率。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是真核細(xì)胞對(duì)各種刺激作出反應(yīng)而自然形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)。 這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。天然或基因重組的干擾素在體內(nèi)的半衰期(half-life，t1/2)短，僅濁左右。為了 維持其有效血藥濃度，達(dá)到治療目的，需要長(zhǎng)期多次給藥。因此，干擾素治療方案一般是大 劑量、頻繁注射。這不僅給患者帶來(lái)巨大的生理和精神痛苦、經(jīng)濟(jì)損失，而且大大限制了該 產(chǎn)品的應(yīng)用和推廣。長(zhǎng)效干擾素可在不影響甚至增加治療效果的情況下，大大降低注射劑量和次數(shù)。 其主要優(yōu)點(diǎn)如下1.注射周期長(zhǎng)，如本專(zhuān)利的Fc-IFN每月只需注射2次，較大程度地減少 了病人的痛苦；2.體內(nèi)血藥濃度曲線平穩(wěn)，療效好，副作用少；3.治療費(fèi)用低，價(jià)格僅是天 然干擾素的1/10左右等等。如此簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的療法，大大減少了患者心理和生理的痛 苦，從而創(chuàng)造良好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。目前，長(zhǎng)效細(xì)胞因子的研究途徑主要有三種PEG修飾、脂質(zhì)體包封和融合蛋白Fc 技術(shù)。PEG修飾技術(shù)簡(jiǎn)單，但是產(chǎn)率低、半衰期短、蛋白與受體的結(jié)合活性就較低。脂質(zhì)體包 封技術(shù)復(fù)雜，且脂質(zhì)體到達(dá)體內(nèi)靶區(qū)或受體時(shí)無(wú)法出現(xiàn)高濃度的富集，影響療效。Fc融合 蛋白技術(shù)是利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，融合表達(dá)細(xì)胞因子-Fc片段(IgG4)。IgG4通 過(guò)Fc片段與其受體結(jié)合，配體-受體復(fù)合物在體內(nèi)可維持20天不被分解。利用此融合表 達(dá)技術(shù)，延長(zhǎng)細(xì)胞因子的半衰期。此技術(shù)構(gòu)建復(fù)雜，產(chǎn)率高，半衰期長(zhǎng)，療效好，是長(zhǎng)效細(xì)胞 因子的發(fā)展方向。本發(fā)明團(tuán)隊(duì)已完成Fc-IFN基因的構(gòu)建。然而，F(xiàn)c-IFN的純化并非簡(jiǎn)單。國(guó)內(nèi)有相 關(guān)融合干擾素純化相關(guān)的專(zhuān)利，如人血清白蛋白-干擾素融合蛋白及編碼基因與應(yīng)用(專(zhuān) 利號(hào)200910076M1. 3)。該專(zhuān)利中融合干擾素純化工藝復(fù)雜(純化步驟包括離心、陽(yáng)離子 層析、疏水層析、陰離子層析、分子篩層析等)、回收率較低(33%)。純化工藝復(fù)雜、回收率 低、不易放大是融合蛋白純化的主要問(wèn)題。純化工藝的優(yōu)劣直接影響到目的蛋白的純度和 得率，直接影響到產(chǎn)品成本，是生物藥品成本控制的關(guān)鍵點(diǎn)。本專(zhuān)利就純化工藝中樣品預(yù)處 理工藝的選擇、優(yōu)化，粗純工藝的選擇、優(yōu)化，精純工藝的選擇，層析柱介質(zhì)的選擇，層析條 件的優(yōu)化等各方面優(yōu)化了融合蛋白的純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種較優(yōu)的Fc融合蛋白(包括但不限于Fc-IFN)純化工藝，以 提高目的蛋白的純化得率與純度，降低生產(chǎn)成本。
在本發(fā)明涉及一種Fc-IFN基因是利用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，連接天然 人干擾素和人IgG4的Fc基因片段構(gòu)建而成。由Fc-IFN基因轉(zhuǎn)染并篩選的獲得Fc-IFN高 效表達(dá)株。Fc-IFN是由干擾素與免疫球蛋白Fc區(qū)通過(guò)免疫惰性肽連接鏈連接的融合蛋白。關(guān)于重組人Fc-IFN的純化工藝，工藝結(jié)合Fc融合蛋白的特性、純化樣品純度得率 要求、后期純化工藝放大以及制劑配方要求等各方面因素。該工藝簡(jiǎn)便、易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生 產(chǎn)，且提高了目的蛋白純度、得率。


圖l.Fc-IFN基因構(gòu)建圖。圖2. Fc-IFN純化工藝流程圖。
圖3. ProteinA層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)=090712) 圖4. Q柱層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)090712) 圖5. G-25層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)=090712) 圖6.純化樣品電泳圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)090712) 圖7. Protein A層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)090728) 圖8. Q層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)090728) 圖9. G-25層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)=090728)
圖10.純化樣品電泳圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào):090728) 1. Marker, 2.細(xì)胞培養(yǎng)液，3. G-25層析
洗脫
圖ll.Protein A層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào):090814) 圖12. Q層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)=090814) 圖13. G-25層析圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào)=090814)
圖14. 030814電泳圖譜(實(shí)驗(yàn)批號(hào):090814) 1. Marker, 2. G-25層析洗脫本發(fā)明團(tuán)隊(duì)通過(guò)Fc-IFN實(shí)驗(yàn)室和中試純化研究，摸索出一條適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 的純化工藝路線，在確保目的蛋白Fc-IFN純度的基礎(chǔ)上，提高了蛋白得率。本發(fā)明涉及的Fc融合蛋白基因及其編碼的免疫融合蛋白結(jié)構(gòu)可參見(jiàn)圖1。Fc融 合蛋白及選擇性標(biāo)記蛋白的DNA序列于相應(yīng)的起始和終止子之間；已知基因表達(dá)必需的調(diào) 控因子，未在圖中表示。總之，除所示序列外，本發(fā)明中的多核苷酸結(jié)構(gòu)還可以進(jìn)一步包括 其他任何可提高蛋白表達(dá)量、保留生物活性、降低篩選及純化難度等的調(diào)控及非調(diào)控序列。本發(fā)明的重組Fc-IFN基因可以克隆到一個(gè)DNA表達(dá)載體中，繼而轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的宿 主細(xì)胞，并篩選獲得免疫融合蛋白的表達(dá)株。細(xì)胞轉(zhuǎn)化包括但不限于磷酸鈣法、電穿孔法、 病毒、脂質(zhì)體等。宿主細(xì)胞包括但不限于CH0、BHK、NS/0、293等。工程細(xì)胞可以培養(yǎng)在各種 不同的有利于融合蛋白表達(dá)的條件下。細(xì)胞的培養(yǎng)條件包括但不限于培養(yǎng)基、空氣中氧氣 和二氧化碳濃度、溫度、pH值緩沖液等等，這些條件的選擇亦屬常規(guī)。本發(fā)明涉及的Fc融合蛋白包括但不限于Fc-IFN。Fc融合蛋白包括免疫球蛋白 Fc區(qū)、免疫惰性肽連接鏈和目的蛋白三部分。免疫球蛋白Fc區(qū)為來(lái)自IgG4的免疫球蛋白 重鏈C末端不變區(qū)的氨基酸序列。IgG4通過(guò)Fc片段與其受體蛋白結(jié)合，以延長(zhǎng)Fc-目的 蛋白復(fù)合物的半衰期。免疫惰性肽連接鏈可增加Fe、目的蛋白的靈活性，從而有助于保留 蛋白的天然構(gòu)型和生物活性。
Fc-IFN基因工程細(xì)胞的構(gòu)建已完成。然而，如何在Fc-IFN高效表達(dá)的基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化 純化工藝、提高了目的蛋白純度和得率、實(shí)現(xiàn)純化工藝的產(chǎn)業(yè)化放大？為解決上述問(wèn)題，本 發(fā)明通過(guò)Fc融合蛋白的實(shí)驗(yàn)室和中試純化研究，摸索出一條適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的純化工 藝路線。具體的研究方案如下Fc-IFN實(shí)驗(yàn)室純化工藝研究緩沖液的選擇結(jié)合干擾素的制劑配方以及純化工藝要求，選擇了磷酸和枸櫞酸 緩沖體系。樣品預(yù)處理方法的確定為防止培養(yǎng)液中的菌體、懸浮雜質(zhì)損傷層析柱，采用離心 的方式對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行處理，離心轉(zhuǎn)速為4000Xg、溫度為4°C、時(shí)間15min。離心后，取上清， 可以直接上樣。Fc-IFN粗純的研究結(jié)合Fc-IFN蛋白特性，選擇親和層析柱。并在此基礎(chǔ)上，考 察了不同NaCl濃度對(duì)目的蛋白及其他雜蛋白吸附的影響，確定上樣及洗脫條件；摸索了最 佳流速及柱載量。研究結(jié)果顯示=Protein A Sepharose FF作為層析介質(zhì)，目的蛋白純度 已達(dá)85%以上，為較理想的粗純介質(zhì)；20mM磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉(pH7. 5)+0. IM NaCl 作為上樣緩沖液，20mM枸櫞酸/枸櫞酸鈉(pH3. 5)作為洗脫液；上樣流速為30cm/h最佳。
表1 :Fc-IFN粗純工藝操作參數(shù)
粗純工藝#1
層析介質(zhì)rotein A Sepharose FF
上樣緩沖液 20mM磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉(pH7.5)+0.1M NaCl 洗脫液20mM枸櫞酸/枸櫞酸鈉(pH3.5)
上樣流速30cm/h超濾脫鹽的研究粗純后樣品鹽濃度太高，且樣品的緩沖體系并不適合進(jìn)行離子 交換層析，所以必須首先要脫鹽。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模首選應(yīng)當(dāng)G-25脫鹽，但作為產(chǎn)業(yè) 化放大，超濾脫鹽是首選。研究結(jié)果表明IOKD超濾膜塊(Millipore公司產(chǎn)品)進(jìn)行超濾 除鹽為最優(yōu)。具體工藝操作參數(shù)表2所示Fc-IFN離子交換層析的研究經(jīng)過(guò)!^rotein A Sepharose FF親和層析和超濾濃 縮后，目標(biāo)蛋白的電泳純度已達(dá)到90%左右，但核酸、內(nèi)毒素等雜質(zhì)還是難以除去干凈，不 能達(dá)到藥用基因工程產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地去除這類(lèi)雜質(zhì)，我們考慮到的是利用離子交換 層析。研究結(jié)果證明Q kpharose層析介質(zhì)能夠很有效的對(duì)樣品進(jìn)一步純化，樣品純度 已經(jīng)達(dá)到95%以上；對(duì)內(nèi)毒素較好的分離效果，保證了樣品內(nèi)毒素的合格。表2 =Fc-IFN超濾工藝操作參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種Fc融合蛋白基因，其特征在于，是利用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，由免疫 惰性肽連接鏈連接目的蛋白和IgG4的Fc基因片段構(gòu)建而成。
2.如權(quán)利要求1所述的一種Fc融合蛋白基因，其特征在于，F(xiàn)c融合蛋白基因包括但不 限于干擾素，還可為生長(zhǎng)激素等生物活性蛋白。
3.一株Fc融合蛋白的高效表達(dá)工程細(xì)胞，其特征在于，它是轉(zhuǎn)染Fc融合蛋白基因到相 應(yīng)的宿主細(xì)胞，并篩選獲得的免疫融合蛋白的高效表達(dá)株。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，包括但不限于磷酸鈣法、電穿孔法、病 毒、脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染技術(shù)。
5.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，包括但不限于CH0、BHK、NS/0、293等宿 主細(xì)胞。
6.一種!^c融合蛋白，其特征在于，是由免疫惰性肽鏈、目的蛋白、免疫球蛋白的Fc區(qū)三 部分組成。
7.如權(quán)利要求6所述的Fc融合蛋白，其特征在于，是由免疫惰性肽鏈連接目的蛋白、免 疫球蛋白的Fc區(qū)構(gòu)成。Fc融合蛋白包括但不限于干擾素、生長(zhǎng)激素等。
8.一條適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的純化工藝路線，其特征在于，純化工藝包括預(yù)處理、粗純、 精純工藝。純化得目的蛋白純度高達(dá)95%以上、蛋白純化得率高達(dá)40%以上。該純化工藝 具有工藝簡(jiǎn)便、高純度、高得率，適于產(chǎn)業(yè)化放大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
9.如權(quán)利要求8所述的預(yù)處理，其特征在于，目的為防止培養(yǎng)液中的菌體、懸浮雜質(zhì)等 損傷層析柱，采用離心的方式對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)處理。離心條件為離心體積為10L，溫度為 4°C，轉(zhuǎn)速為8900rpm，時(shí)間為20min。
10.如權(quán)利要求8所述的粗純，其特征在于，結(jié)合融合蛋白特性選擇親和層析法進(jìn) 行初步純化，粗純得目的蛋白純度已高達(dá)85%以上。粗純條件為層析柱為ftOtein A SepharoseFF (2. 6cmX 15cm, CV = 80ml)，上樣緩沖液為 20mM 檸檬酸-檸檬酸鈉(pH3. 0)。
11.如權(quán)利要求8所述的精純，其特征在于，精純工藝分為兩步精純第一步采用離子交換層析法，達(dá)到了進(jìn)一步純化的目的，同時(shí)又去除了內(nèi)毒素。具 體純化條件為層析柱為Q Sepharose FF (2. 6cmX 10cm, CV = 70ml)，上樣緩沖液為20mM PB (ρΗ7· 5)。精純第二步采用體積排阻層析法分離目的蛋白，并將緩沖體系替換為制劑所需的緩沖 體系。具體純化條件為層析柱為G-25kphadex(2. 6cmX35cm,CV = 175ml)，上樣緩沖液為 IOmM CH3C00NH4+0. 15M NaCl，洗脫緩沖液為 IOmM CH3C00NH4+0. 15M NaCl，層析流速為 30cm/ h。
全文摘要
本發(fā)明涉及Fc融合蛋白的純化工藝。本發(fā)明涉及的Fc融合蛋白包括但不限于重組人Fc融合長(zhǎng)效干擾素(Fc-IFN)。該純化工藝結(jié)合Fc融合蛋白的特性、純化樣品純度得率要求、后期純化工藝放大以及制劑配方要求等各方面因素。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究、中試放大研究，確定了一條適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的純化工藝路線。該工藝路線包括離心預(yù)處理，ProteinA SepharoseFF層析的粗純，Q-Sepharose FF和G25 Sephadex層析的精純。純化得目的蛋白純度高達(dá)95％以上、蛋白純化得率高達(dá)40％以上，提高了目的蛋白純度、得率。研究結(jié)果證實(shí)該純化工藝簡(jiǎn)便、具有較高目的蛋白純度、得率，且適于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化放大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102094034SQ20091023177
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者任軍, 朱學(xué)義, 李艷, 楊靜, 管章委, 邵珂, 黃陽(yáng)濱 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司, 泰州新生源生物醫(yī)藥有限公司