專利名稱：與種子脂肪酸合成相關的蛋白AtL1L及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及與種子脂肪酸合成相關的蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
植物中的脂肪酸又被稱為植物油，它廣泛存在于植物的種子中。植物油用途廣泛， 運用生物技術改良植物體內脂肪酸的組分和含量具有重要的經濟價值。其中，遺傳工程技 術所選用的操作基因必需是植物體內脂肪酸生物合成過程中的關鍵基因，但是目前人們對 于植物脂肪酸生物合成的分子調控機制還不甚了解，因此，利用遺傳工程技術提高油料作 物含油量的工作目前進展緩慢。以雙子葉模式植物擬南芥為例，植物的胚胎發生主要分為 兩個階段早期形態發生過程和晚期成熟過程。整個胚胎發育過程中伴隨著淀粉、蛋白質 和脂肪酸等貯藏物質的積累。在胚胎發育早期，主要是淀粉的大量積累，在組織和器官形 成以后，淀粉被轉化為蛋白質和脂肪酸。在發育的種子中，碳水化合物通過糖酵解途徑被分 解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被運輸到質體后再轉化成丙酮 酸和乙酰CoA，乙酰CoA作為底物參與脂肪酸的合成(Ruuska, S. A.，Girke, T.，Benning, C. , and Ohlrogge, J. B. (2002). Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsis seed filling. Plant Cell 14,1191-1206.)。在種子發育過程中，質體內的脂肪酸合成酶復合物中的酶類負責脂肪酸的合成， 所合成的脂肪酸被導入胞質?；鵆oA庫中以維持三酯酰甘油(TAG)積累。植物種子中的TAG 的生物合成是在內質網中進行的。TAG的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的過 程共需要三種?；D移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)，溶 血磷脂酸?；D移酶(LPAT)，二脂酰甘油?；D移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Ohlrogge 等，1979，Proc Natl Acad ki，USA，76 :1194-1198)。這三種?；D移酶催 化甘油骨架的逐步?；^程。近十余年來，科學家們對利用遺傳工程技術提高植物體 內，特別是種子中的脂肪酸含量進行了各種有益的探索。Shintani等在煙草中過量表達 了 ACCase的一個亞基-生物素羧化酶(BC亞基)，在煙草葉片中BC的表達水平提高了 3 倍，其它三個亞基的表達水平沒有發生明顯變化，但脂肪酸的含量和組成也沒有明顯改變 (Shintani，D· , Roesler,K. ,Shorrosh,B.，Savage，L，and Ohlrogge,J. (1997). Antisense expression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves. Plant Physiol 114,881-886.)。另一項研究表明，增加丙酰CoA的含量能夠提高脂肪酸的含量。 Roeseler等利用種子特異性表達啟動子在油菜中過量表達擬南芥中的HO-ACCase基因， 結果使ACCase的活性明顯提高，種子中的含油量提高3-5% (Roesler，K.，Shintani, D.， Savage, L.，Boddupalli, S.，and Ohlrogge, J. (1997). Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds. Plant Physiol 113，75-81.)。Roeseler等的研究結果表明，丙酰CoA水平能夠提高脂肪酸的含量，但提高 幅度較小。Dechesh等將菠菜的KASIII基因在煙草中過量表達，結果使KASIII的酶活性提 高了 100-300 倍，但脂肪酸的含量卻降低了 5-10% (Dehesh等，2001 ,Plant Physiol.，125 1103-1114)。上述研究結果表明，植物體內的脂肪酸代謝是一個復雜和高度協調的過程，通 過對脂肪酸代謝途徑中的個別或單個基因進行遺傳操作并不能夠有效地改變脂肪酸的含 量。因此，Girke等人預言在脂肪酸的代謝過程中，很可能存在一種蛋白激酶或其它調控因 子(例如轉錄因子)在起調控作用(Girke，Τ.，Todd, J.，Ruuska，S.，White, J.，Benning, C. , and Ohlrogge, J. (2000). Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds. Plant Physiol 124，1570-1581.)。目前，已發現的參與植物脂肪酸代謝的轉錄因子有擬南芥的WRIl和LECl等。其 中，WRIl編碼一個AP2/ERra轉錄因子蛋白，它可能是植物體內由蔗糖向TAG轉化的一個 關鍵的調節因子(Cernac，Α.，and Benning, C. (2004). WRINKLEDlencodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J 40，575-585.)。LECl屬于能結合啟動子中順式作用元件CCAAT盒的 一類轉錄因子，調控胚胎的發生與種子成熟，同時可能對胚胎形成過程中胚胎儲存物的積 Mii^fiIiS (Lotan, T. ，Ohto, M. ，Yee, K. M. ，West, Μ. Α. ，Lo, R. ，Kwong, R. W. ，Yamagishi, K. , Fischer, R. L. , Goldberg, R. B. , and Harada, J. J. (1998). Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryodevelopment in vegetative cells.Cell 93，1195-1205.)。過量表達LECl能大幅度增加轉基因擬南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.， Tan, H. , Zheng, Q. , Fu, F. , Liang, Y. , Zhang, J. , Yang, X. , Wang, Τ. , Chong, K. , Wang, X. J., et al. (2008). LEAFYC0TYLED0N1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Physiol 148，1042—1054.)。在擬南芥基因組中，編碼轉錄因子的基因占了很大一部分，至少有1500個，占整 個基因組的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110-2113)。這些轉錄因子大多 屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉錄因子家族是植物所特有 的。對轉錄因子的研究結果表明，一個轉錄因子可能對一類相關性狀的很多基因實施調節 控制，從而有效改變植物的相關特性。CCAAT盒是一個廣泛存在于基因啟動子上的順式作 用元件，與CCAAT序列結合的轉錄因子又稱為nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是一個由三種不同亞基構成的異源三聚體復合物，它特異性地識別DNA 上的CCAAT序列，并與之結合，從而調節基因的表達。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個亞 族NF-YA(又稱為 HAP2 或 CBF-B)，NF_YB(又稱為 HAP3 或 CBF-A)和 NF_YC(又稱為 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結構域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一個緊密結合的異源二聚體復合物，NF-YA再結合在這個復合物的表面， 形成異源三聚體復合物。該三聚體復合物對DNA有很高的親和力(Gusmaroli，G.，Tonelli， C. , and Mantovani, R. (2002). Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits. Gene 283,41-48. ；Romier, C., Cocchiarella, F. ， Mantovani, R. ， and Moras, D. (2003). The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y.J Biol Chem 278,1336-1345)。編碼NF-Y亞基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母與動物體中，各種亞 基都是由單基因編碼的。而在植物的基因組中，NF-Y亞基是由多種不同基因編碼的。在 擬南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年報道了三個NF-Y亞族中的共四個ESTs 的序列(Gusmaroli, G. , Tonelli, C. , and Mantovani, R. (2001). Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana. Gene 264,173-185),本發 明的發明人于2004年完成了該家族32個基因cDNA的克隆，其中9個HAP2，11個HAP3， 12 個 HAP5 (Wei 等，2004，Plant Physiol. , 135 :773-782) NF-YB 亞族的轉錄因子在基 因內部都含有一個保守的B結構域，依據B結構域序列的差異，該家族被分為兩類=LEAFY COTYLEDON 1 (LECl)類型和非 LECl 類型(Kwong, R. W.，Bui，A. Q.，Lee，H.，Kwong, L. W.， Fischer,R. L. ,Goldberg,R. B. ,and Harada,J. J. (2003). LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regu lators essential for embryo development. Plant Cell 15，5—18)。 LECl類型包括兩個基因LECl和LEAFY COTYLEDONl-Iike (LlL)。這兩個基因都是特異性 地在胚胎和種子發育過程中表達。LECl類型的轉錄因子的B結構域含有16個保守的氨 基酸殘基，這16個氨基酸殘基在非LECl類型的轉錄因子中是不存在的。B結構域是決定 LECl類轉錄因子在功能上區別于其它非LECl類轉錄因子的關鍵因素(Hyes eimg等，2003， Proc Natl Acad Sci，USA, 100 :2152-2156)。LECl 是 HAP3 家族中功能研究的較為清楚的 一個蛋白。LECl是擬南芥胚胎發生過程中一個關鍵的調控因子。LECl參與了種子成熟的 多個過程，包括種子的干燥和養分的積累。目前，在玉米、向日葵和胡蘿卜中，均發現了 LECl 白勺^] ! (Zhang, S. ， Wo ng, L. ， Meng, L. ， and Lemaux, P. G. (2002). Similarity of expression patterns of k nottedl and ZmLECl during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zea mays L·)· Planta 215,191-194. ；Yazawa, K. , Takahata, K. , and Kamada, H. (2004). Isolation of the gene encoding Carrot leafy,cotyledonl and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis. Plant Physiol Biochem 42，215-223.)。

發明內容
本發明的目的在于提供一種與種子脂肪酸合成相關的蛋白。本發明提供與種子脂肪酸合成相關的蛋白，是調控種子脂肪酸代謝的轉錄因子， 來源于擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)，名稱為LEAFY C0TYLED0N1-LIKE (簡稱 AtLlL)，該蛋白是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關的由1)衍生的蛋白質。序列表中的SEQ ID NO :1由234個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第61-1 位氨基酸殘基為NF-YB結構域。所述取代和/或缺失和/或添加的一至幾個氨基酸殘基是1-10個氨基酸殘基，可 以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。為了使1)中的AtLlL便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與種子脂肪酸合成相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因是如下1)-4) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第39-743位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；3)在嚴格條件下與與1)或幻的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
4.根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述權利要求3中，3)或4)的基因 是序列表中序列3所示的基因。
5.含有權利要求2-4任一所述基因的重組載體或轉基因細胞系或重組菌。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是按照下述1)或2)的 方法制備得到的重組表達載體1)將序列表中序列4的自5’端第832-1145位所示的啟動子與權利要求2-4任一所述 基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位點間，得到重組表達載體。2)將序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示的啟動子與權利要求2-4任一所述 基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位點間，得到重組表達載體。
7.一種培育種子含油量高的轉基因植物的方法，是將權利要求2-4任一所述的編碼基 因轉入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物種子的含油量高于所述目的植物種 子的含油量。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于權利要求2-4任一所述的編碼基因是通 過權利要求5或6所述的重組表達載體導入所述目的植物中。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子 葉植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、 棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小 麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁或草坪草。
全文摘要
本發明公開了一種與種子脂肪酸合成相關的蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關的由1)衍生的蛋白質。將該蛋白的編碼基因導入植物中，可以提高油菜種子中的含油量。這對提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關性狀的改良具有重要的理論及實際意義，在農業領域具有廣闊的應用和市場前景。
文檔編號C12N15/11GK102070706SQ20091023828
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月24日 優先權日2009年11月24日
發明者左建儒, 楊曉輝, 牟金葉, 譚河林 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所