專利名稱：利用內(nèi)生菌和微生物發(fā)酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明涉及松脂醇二葡萄糖苷的制備方法，具體是一種利用內(nèi)生菌和微生物發(fā)酵 法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法。
背景技術(shù)：
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是中國傳統(tǒng)的名貴中藥，其降血壓功能持續(xù)、 穩(wěn)定、無副作用，是其他化學(xué)降壓藥無法比擬的。已有研究證明，杜仲中主要降壓成分是松 脂醇二葡萄糖苷(PDG)。獲取杜仲中功能性成分的傳統(tǒng)方法是利用杜仲的皮、葉進行提取。 這種方法受到材料來源的限制，無法滿足市場需求，而且會破壞杜仲資源，不利于可持續(xù)發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種從杜仲中分離一株內(nèi)生菌，再經(jīng)過微生物 發(fā)酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法。與傳統(tǒng)方法相比，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)植物有效成 分具有簡便、快速、成本低等特點。從杜仲中分離到的一株內(nèi)生菌為擬莖點菌屬XP-8 (Phomopsis sp. XP-8)，于2009 年12月1日由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號 為 CCTCC M209291。內(nèi)生菌XP-8的制備方法如下(1)取新鮮的杜仲樹皮，切成約0. 5cmX0. 5cm大小的小塊，先在70%酒精中浸泡 lmin，然后用3%次氯酸鈉(有效氯)溶液處理2min，無菌水清洗兩次，接種于PDA培養(yǎng)基 平板上，25 °C下培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)3-5d，待平板上菌絲萌發(fā)時，用劃線或稀釋等分離方法，挑取形態(tài)不同的 菌落，轉(zhuǎn)入到PDA斜面培養(yǎng)基上，在25°C條件下培養(yǎng)。經(jīng)過分離、篩選、純化的反復(fù)過程，直 至得到純化的典型菌落；(3)純化后的菌種移至PDA培養(yǎng)基的斜面上培養(yǎng)后，4°C保存。一種利用內(nèi)生菌和微生物發(fā)酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法包括以下步驟(1)液體種子的制備取2cm2活化好的內(nèi)生菌XP-8菌種接入種子培養(yǎng)基中，裝液 量為100ml/250ml三角瓶，在28°C，180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)120h ；(2)液體發(fā)酵以10% (V/V)的接種量將上述培養(yǎng)好的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量為發(fā)酵罐體積的40 % 70 %，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為 160 180r/min，發(fā)酵液溫度控制為28°C，培養(yǎng)168 240h ；(3)產(chǎn)物的分離發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液，在5000r/min下離心IOmin ；取上清液， 加入2倍于發(fā)酵液體積的95%乙醇溶液，靜置24h ；然后在5000r/min下離心1Omin ；取上 清液，在40°C、真空度0. 05 0. 09MPa的真空度下減壓濃縮10 20倍，高速離心13000r/ min, IOmin,取上清液；
(4)產(chǎn)物的提取選用樹脂S-8對(3)中所得上清液進行吸附，吸附時，發(fā)酵液中 松脂醇二葡萄糖苷的濃度為0. 195mg/ml，溫度為20°C，pH值為9，控制流速lBV/h，溶液處理 量20BV ；然后，再用洗脫液進行洗脫，洗脫條件是以30%的乙醇水溶液為洗脫液，控制洗 脫液流速lBV/h，洗脫液用量為6BV ；收集全部洗脫液，在40°C、真空度0. 05 0. 09MPa的 真空度下蒸發(fā)出所有乙醇，所得液體即為松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整個純化過程對發(fā) 酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率為89. 8% ；(5)產(chǎn)物的純化將(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔徑為0.45μπι的 水性醋酸纖維微孔濾膜過濾，取濾液在制備液相色譜儀上進行純化，收集出峰時間在 4. 46-4. 47min處的組分，即為松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸發(fā)揮干溶液中溶劑，所得粉末，即 為松脂醇二葡萄糖苷的純品；上述制備過程中，所用培養(yǎng)基分別為內(nèi)生菌XP-8菌種保藏培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，自然ρ H(約 7. 2)；種子培養(yǎng)基采用察氏培養(yǎng)基，組成為蔗糖30. 0g, NaNO3 2. 0g, K2HPO4L 0g, KCl 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20(100g/L) 2 滴，蒸餾水 lOOOmL，自然 ρ H(約 7. 89)；發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖47. 5g，NaNO3 3. 0g, K2HPO4 2. 83g，KCl 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g， FeSO4 · 7H20(100g/L)2 滴，蒸餾水 IOOOmL,自然 pH (約 7. 89)；上述制備過程中，產(chǎn)物純化所用制備液相色譜純化的條件為檢測波長228nm，柱 溫25°C，流動相的流速為12ml/min，進樣量4ml/次，流動相為32%甲醇水溶液。所述松脂醇二葡萄糖苷應(yīng)用于醫(yī)藥和食品加工以及化學(xué)分析與檢測等領(lǐng)域。


圖1菌株XP-8的形態(tài)特征；(A和B分別為菌種XP-8在PDA平板生長5d和15d的 菌落形態(tài)，C為菌株在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基上生長7d時產(chǎn)生的甲型分生孢子)；圖 2 菌株 XP-8 的 rDNA ITS 區(qū) PCR 擴增結(jié)果；M :DNA Marker DL2000 ；1 菌株 XP-8.；圖3菌株XP-8的rDNAITS區(qū)的基因序列；圖4基于菌株XP-8ITS區(qū)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；注節(jié)間數(shù)字代表 bootstrap支持值；XP-8為供試菌株；其中P.代表Phomopsis ；D.代表Diaporthe ；圖5溫度對菌落生長速度的影響；圖6pH值對菌落生長的影響；圖7碳源對菌落生長的影響；圖8氮源對菌落生長的影響；圖9溫度對S-8吸附PDG的影響；圖10不同溫度下S-8吸附等溫線；圖11不同溫度下S-8靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線；圖12S-8吸附PDG過程液膜擴散速率；圖13S-8吸附PDG過程顆粒內(nèi)擴散速率；圖14pH對S-8吸附PDG的影響；
圖15不同流速下PDG在樹脂上的動態(tài)吸附曲線；圖16洗脫劑乙醇濃度對洗脫的影響。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
和試驗例進一步的說明。1.菌種的分離、純化與鑒定1. 1材料與方法菌種XP-8的制備取新鮮的杜仲樹皮，切成約0. 5cmX0. 5cm大小的小塊，先在 70%酒精中浸泡lmin，然后用3%次氯酸鈉(有效氯)溶液處理2min，無菌水清洗兩次，接 種于PDA培養(yǎng)基平板上，25°C下培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5d，待平板上菌絲萌發(fā)時，用劃線或稀釋等分 離方法，挑取形態(tài)不同的菌落，轉(zhuǎn)入到PDA斜面培養(yǎng)基上，在25°C條件下培養(yǎng)。經(jīng)過分離、篩 選、純化的反復(fù)過程，直至得到純化的典型菌落。純化后的菌種移至PDA培養(yǎng)基的斜面上培 養(yǎng)后，4°C保存。菌種的形態(tài)學(xué)觀察將活化后的菌種XP-8接于PDA培養(yǎng)基中，于28°C恒溫培養(yǎng) 15d，每天觀察其菌落形態(tài)特征；同時將菌株XP-8點接于燕麥片瓊脂培養(yǎng)基中央，于22°C培 養(yǎng)，待長出黑色載孢體后，挑取載孢體切開后制片，在Motic BA 400數(shù)碼成像光學(xué)顯微鏡下 獲取菌株的顯微形態(tài)，使用軟件Motic 3. IPreview Software對圖像進行分析。菌種的ITS區(qū)序列分析用BioFlux公司Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提 取 XP-8 的總 DNA，用 TaKaRa 公司的 Fungi Identification PCR Kit(D317)進行 ITS 區(qū)全 序列PCR擴增，由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司對PCR擴增的特異性產(chǎn)物進行測序。序列分析與系統(tǒng)樹的構(gòu)建將測序獲得的ITS序列在GenBank中進行BLAST 比較搜索，下載同源性序列，用ClustalX 1.8 (Thompson et al. 1997)進行序列比對 (alignment)，用 MEGA4. 02Neighbor-Joining 法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行 1000 次 Bootstrap檢驗。(許超德和李紹蘭2004)。1. 2結(jié)果與分析試驗以絲狀真菌為主要分離目標(biāo)，經(jīng)過分離、篩選、純化的反復(fù)過程，得到了 18株 菌落特征各不相同的真菌菌株。用HPLC對分離到的18株杜仲內(nèi)生菌進行產(chǎn)PDG的能力鑒 定，通過檢測發(fā)現(xiàn)有3株菌能產(chǎn)生PDG (表1)。其中菌株XP-8產(chǎn)PDG的能力最強，產(chǎn)量為 11. 65mg/L，遠遠高于其他兩株菌的PDG產(chǎn)量。表IPDG產(chǎn)生菌的菌落形態(tài)和PDG的產(chǎn)量
菌株菌落特征PDG產(chǎn)量
XP-3 菌落白色，邊緣較整齊，菌絲呈絨毛狀，培0.874
養(yǎng)基呈灰褐色,
XP-B 菌落白色，菌絲較稀疏，環(huán)形匍匐生長，培11.650
權(quán)利要求
1.內(nèi)生菌XP-8，中國典型微生物保藏中心保藏，編號為CCTCCM209291。
2.如權(quán)利要求1所述的內(nèi)生菌XP-8，其特征在于其制備方法如下(1)取新鮮的杜仲樹皮，切成約0.5cmX0. 5cm大小的小塊，先在70%酒精中浸泡lmin， 然后用3%次氯酸鈉(有效氯)溶液處理2min，無菌水清洗兩次，接種于PDA培養(yǎng)基平板上， 25 °C下培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)3-5d，待平板上菌絲萌發(fā)時，用劃線或稀釋等分離方法，挑取形態(tài)不同的菌 落，轉(zhuǎn)入到PDA斜面培養(yǎng)基上，在25°C條件下培養(yǎng)。經(jīng)過分離、篩選、純化的反復(fù)過程，直至 得到純化的典型菌落；(3)純化后的菌種移至PDA培養(yǎng)基的斜面上培養(yǎng)后，4°C保存。
3.一種利用內(nèi)生菌和微生物發(fā)酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于所述 制備方法包括以下步驟(1)液體種子的制備取2cm2活化好的內(nèi)生菌XP-8菌種接入種子培養(yǎng)基中，裝液量為 100ml/250ml三角瓶，在28°C、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)120h ；(2)液體發(fā)酵以10%(V/V)的接種量將上述培養(yǎng)好的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā) 酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量為發(fā)酵罐體積的40% 70%，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為160 180r/min，發(fā)酵液溫度控制為28°C，培養(yǎng)168 240h ；(3)產(chǎn)物的分離發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液，在5000r/min下離心IOmin；取上清液，加入 2倍于發(fā)酵液體積的95%乙醇溶液，靜置24h ；然后在5000r/min下離心IOmin ；取上清液， 在40°C、真空度0. 05 0. 09MPa的真空度下減壓濃縮10 20倍，高速離心13000r/min， lOmin，取上清液；(4)產(chǎn)物的提取選用樹脂S-8對(3)中所得上清液進行吸附，吸附時，發(fā)酵液中松脂 醇二葡萄糖苷的濃度為0. 195mg/ml，溫度為20°C，pH值為9，控制流速lBV/h，溶液處理量 20BV ；然后，再用洗脫液進行洗脫，洗脫條件是以30 %的乙醇水溶液為洗脫液，控制洗脫 液流速lBV/h，洗脫液用量為6BV ；收集全部洗脫液，在40°C、真空度0. 05 0. 09MPa的真 空度下蒸發(fā)出所有乙醇，所得液體即為松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整個純化過程對發(fā)酵 液中松脂二葡萄糖苷的收集率為89. 8% ；(5)產(chǎn)物的純化將(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔徑為0.45μπι的 水性醋酸纖維微孔濾膜過濾，取濾液在制備液相色譜儀上進行純化，收集出峰時間在 4. 46-4. 47min處的組分，即為松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸發(fā)揮干溶液中溶劑，所得粉末，即 為松脂醇二葡萄糖苷的純品；上述制備過程中，所用培養(yǎng)基分別為內(nèi)生菌XP-8菌種保藏培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，自然ρ H(約7. 2)；種子培養(yǎng)基采用察氏培養(yǎng)基，組成為蔗糖30. Og, NaN032. Og, K2HPO4L Og, KCl 0. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 (lOOg/L) 2 滴，蒸餾水 lOOOmL，自然 pH (約 7. 89)；發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖 47. 5g，NaN0s3. 0g, Κ2ΗΡ042· 83g，KCl 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g， FeSO4 · 7H20 (lOOg/L) 2 滴，蒸餾水 IOOOmL,自然 pH (約 7. 89)；上述制備過程中，產(chǎn)物純化所用制備液相色譜純化的條件為檢測波長228nm，柱溫 25°C，流動相的流速為12ml/min，進樣量4ml/次，流動相為32%甲醇水溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的一種利用內(nèi)生菌和微生物發(fā)酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于所述松脂醇二葡萄糖苷應(yīng)用于醫(yī)藥和食品加工以及化學(xué)分析與檢測等領(lǐng) 域。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從杜仲中分離內(nèi)生菌，再經(jīng)過微生物發(fā)酵法制備松脂醇二葡萄糖苷的方法。內(nèi)生菌為XP-8，中國典型微生物保藏中心保藏，編號為CCTCCM209291；制備方法包括液體種子的制備、發(fā)酵、產(chǎn)物的分離、提取、純化等步驟，具有簡便、快速、成本低等特點。
文檔編號C12N1/14GK102002462SQ20091025449
公開日2011年4月6日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者師俊玲 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)