專利名稱：微生物同步發酵生產十八碳二元酸的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵轉化正烷烴和脂肪酸甲酯生產長鏈α，ω-二羧酸的方 法，尤其是發酵正十八烷(nC18)和/或十八碳脂肪酸甲酯，生產十八碳二羧酸(DC18)的方法。
背景技術：
十八碳二元酸(DC18)是一種化工上合成醫藥中間體和尼龍1818工程塑料及涂料 等的重要原材料。0(18是自然界中不存在，化工方法無法合成，生物合成法也難以生產的精細化工新 材料。由于能利用正烷烴生產相應鏈長二元酸的微生物都偏愛同化和氧化C14以上的正烷 烴，尤其嗜好同化和氧化正十八烷而生長，因此難以生成和積累十八碳二元酸，至今為止， 還未見生物合成法從正十八烷(IiC18)生產DC18的專利。現有技術僅有從十八碳脂肪酸(即硬脂酸)發酵生產十八碳二元酸(DC18)的報 道，其公開數據為搖瓶發酵96小時，DC18的含量最多只有29. 7g/L。技術內容本發明的目的是提出一種微生物發酵轉化Cltl-C18正烷烴和/或脂肪酸甲酯生產 α, ω-二羧酸的方法，尤其是高產DC18W方法。本發明所用的微生物菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8突變菌株， 是以一株氧化正烷烴生產混合二羧酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學報》20(1) =88-93, 1980)為出發菌株，經過N+注入法誘變，以一種氧化酶活力篩選指示培養基篩選，經過4次 反復誘變篩選出來的，具有對nC18和十八碳脂肪酸甲酯ω-氧化酶活力強，β-氧化酶活力 微弱，高產出的生產DC18的新菌株。具體篩選方法為將經過N+注入法誘變的微生物菌種 液，用生理鹽水分別稀釋為10_5-10_7，吸取0. Iml稀釋好的菌液，涂布于10巴林糖度的麥芽 汁瓊脂培養平板上，每個稀釋度涂布3個平板，用黑紙包好，置于30°C的培養箱中培養48小 時，統計致死率。以原出發菌株為對照，對誘變后的菌株進行發酵生產DC18的試驗和產酸量 檢測。篩選出對正十八烷烴和/或十八碳脂肪酸甲酯ω-氧化酶活力強菌株即為熱帶假絲 —(Candida tropicalis)ly_8。本發明所述熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-8已于2009年10月14日 在中國典型培養物保藏中心進行保藏，地址為中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO =M 209226。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-8的生理特性如下糖類的發酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。 同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-， 密二糖_，棉子糖_，松二糖+，菊芋糖_，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核 糖_，鼠李糖_，α -甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇_，甘露醇+，肌醇_，核糠醇+，半 乳糖醇_，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉_，丁二酸鈉+，乳酸鈣_。
生長素的需要生物素++，維生素B1++,維生素B2+,維生素B6+,維生素B12+,葉酸 +，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。其他硝酸鹽-，凍化牛奶_，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。形態特征奶油白色，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。培養特征在麥芽汁液體培養基中培養時，假菌絲多而長；在烷烴種子培養基培 養時，有一定數量的短假菌絲；而在發酵培養基中發酵時，大部分是單個橢圓細胞。本發明所述同步發酵生產長鏈二羧酸，特別是十八碳二羧酸的方法是以熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis) ly_8為發酵菌種，在以正十八烷和/或十八碳脂肪酸甲酯為發 酵基質的培養液中同步發酵，生產α，ω-十八碳二元酸。同步發酵生產二元酸過程中所使用的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly-8 的種子培養方法如下種子培養基(1) IOBe'糖度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面；(2) IOBe'糖度的麥芽汁液體培養基；(3)種子培養基包括=KH2PO4 6-12g/L，酵母膏3_8g/L，玉米漿3_8g/L，蔗糖 10-30g/L，尿素l_3g/L，自來水配制，自然PH0培養種子的過程為取一接種環ly-8酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上 (Φ15Χ180試管，每支裝6-7mL培養基，滅菌后放成斜面)，于28-30°C培養40小時。取 一支上述培養好的ly-8菌種全部刮入裝有30mL烷烴種子培養基的250mL三角瓶中，于 28-300C 220轉/分的旋轉搖床上培養40-48小時，作為搖瓶發酵種子或取兩支上述培養好 的ly-8斜面菌種全部刮入裝有500mL培養基的5000mL三角瓶中，于220轉/分的旋轉搖 床28-30°C培養44-48小時，菌株生長光密度OD達到0. 8，作為一級種子罐的種子。同步發酵生產二元酸的方法如下發酵培養基的主要組成為堿金屬磷酸鹽5_12g/L(最好為6_9g/L)、 NaClO. 5-2. 5g/L(最好為 1-1. 8g/L)、醋酸鈉 2_6g/L(最好是 3_7g/L)、硝酸鹽 2-lOg/L(最 好為3-8g/L)、蔗糖15-25g/L、消泡劑400-1000ppm、青霉素100-250單位/mL(最好為 120-200單位/mL)、尿素l_5g/L以及一些公知的營養源。上述堿金屬磷酸鹽可從ΚΗ2Ρ04、 NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽可從鉀或鈉鹽中選一種。發酵混合液中含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85_70% (V/V) 的發酵培養基。用本發明的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8菌株生產長鏈二元酸，特別 是DC18的具體方法是把培養好經過鏡檢，沒有雜菌的菌種液，按發酵培養基20-25% (V/V) 的用量，接入PH 5. 5-9.0，最好為6. 0-7. 8的含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸 甲酯與85-70% (V/V)發酵培養基的混合液中。將上述混合物在24-34°C，最好在27-31°C 通氣發酵72-170小時。第一階段，體系PH控制在7. 0以下，以菌體生長為主，也生產二元 酸；第二階段，體系PH控制在7. 5以下，以產酸為主，也生長菌體；第三階段，體系PH控制在 8. 0以下，只產酸，不長菌體，120小時以后，PH控制在8. 4以下，繼續生產二元酸。從70小 時以后，每天補加一定量的正烷烴和/或脂肪酸甲酯，使發酵液中正烷烴和/或脂肪酸甲酯 的含量始終>5%。
發酵結束后，進行破乳分層，回收正烷烴和/或脂肪酸甲酯，放出中間清液，菌體 層經膜分離除去菌體。合并清液，加入0. 7%活性炭，在85°C左右脫色40分鐘，板框壓濾， 除去活性炭，脫色清液加熱至70°C，加HCL或濃H2SO4至PH3，進行酸化結晶，冷卻至30°C后， 壓濾，用水洗滌，空氣吹干。烘干，得白色DC18。用本發明的ly-8突變菌株和發酵方法，可生產各種單一二元酸，其中在IOL發酵 罐中，發酵生產DC18時，發酵150小時，DC18的產量可達115g/L，nC18轉化率為60. 8%, DC18 純度為95%。
具體實施例方式實施例1.(1).取一接種環的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8菌體，涂布在 Φ 15X180大試管固體麥芽汁斜面，30°C培養兩天。(2).取上述菌種一支，接入裝有30mL種子培養基的250mL三角瓶中，于30°C，220 轉/分的旋轉搖床上培養46小時。種子培養基中，KH2PO4 8g/L，酵母膏5g/L，玉米漿3g/L， 蔗糖30g/L，尿素3g/L，自來水配制，PH 5.0，110°C滅菌30分鐘。(3)在裝有15mL發酵培養基的500mL三角瓶中，接入3. 5mL上述種子液，接三瓶， 在220轉/分旋轉搖床上發酵4天，每24小時用NaOH調一次PH至7. 7。發酵培養基混合 液中含 KH2PO4 8g/L,NaCl lg/L,NaAC 5g/L，酵母膏 2g/L，玉米漿 2. 5g/L，尿素 1. 8g/L，蔗糖 15g/L，青霉素170單位/mL,以及正十八烷150mL/L,自來水配制，PH 7. 2，110°C滅菌30分 鐘。發酵結束后，用HCl調PH至3，用120mL乙醚抽提，除去乙醚，得白色結晶，用標準NaOH 溶液滴定，計算二元酸含量。結果DC18產量平均為65. 8g/L。實施例2.按實例1的方法，只是發酵基質正烷烴使用IiC12 (純度99% )，結果DC12產量為 72g/L，純度 98. 3%0實施例3.按照實例1的方法，只是發酵基質正烷烴用IiC14(純度98. 5% )，結果DC14產量為 75g/L，純度為 98. 1% ο實施例4.按照實例1的方法，只是正烷烴用IiC16 (純度99 % )，結果DC16的產量為52g/L，純 度為97. 5%。實施例5.按照實例1的方法，只是發酵基質正烷烴改用十八碳脂肪酸甲酯，結果DC18產量 為46. 2g/L，純度為92%。實施例6.(1).發酵種子和發酵培養基按照實例1。(2).把30mL培養2天的液體種子液，接入裝有500mL種子培養基，經110°C滅菌 30分鐘的3000mL三角瓶中，共3瓶，29士 1°C，于220轉/分的旋轉搖床上培養40小時，得 到0D(X30，620nm波長)為0. 81的液體種子液作為發酵罐種子。(3).把(2)中培養好經鏡檢無雜菌的1500mL種子液，接入裝有6L發酵培養基，經121°C滅菌30分鐘的IOL自動發酵罐中，調PH 7. 1，加入900mLnC18，在29士 1°C，650rpm，罐 壓lkg/cm2，通氣量1 1，開始發酵。30小時以內，PH控制在7. 1以下，30-65小時，PH控 制在7.5以下，65-120小時，PH控制在8.0以下，120小時以后到發酵結束，PH控制在8. 5 以下；在60、90和120小時分別補加nC18為400、400和200mL。發酵150小時，DC18的產量 為 115g/L，nC18 轉化率為 60. 8%0 發酵結束后，加NaOH至PHlO，加熱至80°C，破乳后，放置分層，降溫至20°C，放置過 夜，回收上層nC18101g，放出中層清液，菌體層抽濾，合并清液，稀釋后加熱至65°C，加入濃 H2SO4調至PH3，酸化結晶。降溫至25-30°C后，抽濾，洗滌，抽空，烘干，得732. 6g DC18產品， 后處理收率為91 %，產品純度為95 %。
權利要求
1.一種微生物同步發酵生產十八碳二羧酸方法，其特征在于所用的微生物為熱帶假 絲酵母(Candida tropicalis) ly_8，該菌種已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為 CCTCC NO :M209226。
2.如權利要求1所述微生物同步發酵生產十八碳二羧酸方法，其特征在于以熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis) ly_8為發酵種子，在以正十八烷和/或十八碳脂肪酸甲酯為發 酵基質的培養液中同步發酵，生產α，ω-十八碳二元酸。
3.如權利要求2所述微生物同步發酵生產十八碳二羧酸方法，其特征在于所說的發酵 種子是由熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_8菌株經斜面培養、液體種子培養基培 養，獲得一級種子罐的種子；所使用的固體斜面培養基為10個巴林糖度的麥芽汁加2%瓊 脂制成；液體培養基為10個巴林的麥芽汁；混合液體種子培養基包含KH2P046-12g/L，酵母 膏3-8g/L，玉米漿3-8g/L，蔗糖10-30g/L，尿素l_3g/L，自來水配制，自然PH。
4.如權利要求2所述微生物同步發酵生產十八碳二羧酸方法，其特征在于所說的同步 發酵過程如下發酵培養基的主要組成為堿金屬磷酸鹽5-12g/L、NaCl 0. 5-2. 5g/L、醋酸鈉2_6g/L、 硝酸鹽2-10g/L、蔗糖15-25g/L、消泡劑400-1000ppm、青霉素100-250單位/mL、尿素l_5g/ L，其中堿金屬磷酸鹽從KH2PO4、NaH2P04、K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽從鉀或鈉鹽中選 一種；發酵混合液中含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/V)的 發酵培養基；具體發酵操作方法為具體方法是把培養好經過鏡檢、沒有雜菌的菌種液，按發酵培養基20-25% (V/V)的 用量，接入PH 5. 5-9.0的含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/ V)發酵培養基的混合液中，將上述混合物在M_34°C，通氣發酵72-170小時；第一階段，體 系PH控制在7. 0以下，以菌體生長為主，也生產二元酸；第二階段，體系PH控制在7. 5以 下，以產酸為主，也生長菌體；第三階段，體系PH控制在8. 0以下，只產酸，不長菌體，120小 時以后，PH控制在8. 4以下，繼續生產二元酸；從70小時以后，每天補加一定量的正烷烴和 /或脂肪酸甲酯，使發酵液中正烷烴和/或脂肪酸甲酯的含量始終> 5%。
5.如權利要求4所述微生物同步發酵生產十八碳二羧酸方法，其特征在于所說的同步 發酵過程中所使用的發酵培養基的主要組成為堿金屬磷酸鹽6-9g/L、NaCl 1-1. 8g/L、醋 酸鈉3-7g/L、硝酸鹽3-8g/L、蔗糖15-25g/L、消泡劑400-1000ppm、青霉素120-200單位/ mL、尿素l_5g/L ；其中堿金屬磷酸鹽從KH2P04、NaH2PO4, K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽 從鉀或鈉鹽中選一種；發酵混合液中含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/V)的 發酵培養基；具體發酵操作方法為具體方法是把培養好經過鏡檢，沒有雜菌的菌種液，按發酵培養基20-25% (V/V)的 用量，接入為Ph為6. 0-7.8的含有15-30% (V/V)的正十八烷和/或脂肪酸甲酯與85-70% (V/V)發酵培養基的混合液中；將上述混合物在27-31°C通氣發酵72-170小時。第一階段， 體系PH控制在7. 0以下，以菌體生長為主，也生產二元酸；第二階段，體系PH控制在7. 5以下，以產酸為主，也生長菌體；第三階段，體系PH控制在8. 0以下，只產酸，不長菌體，120小 時以后，PH控制在8. 4以下，繼續生產二元酸。從70小時以后，每天補加一定量的正烷烴 和/或脂肪酸甲酯，使發酵液中正烷烴和/或脂肪酸甲酯的含量始終> 5%。
6.如權利要求2所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發酵結束后，進行破乳分層，回收正烷烴和/或脂肪酸甲酯，放出中間清液，菌體 層經膜分離除去菌體。合并清液，加入0. 7%活性炭，在85°C左右脫色40分鐘，板框壓濾， 除去活性炭，脫色清液加熱至70°C，加HCL或濃H2SO4至PH 3，進行酸化結晶，冷卻至30°C 后，壓濾，用水洗滌，空氣吹干。烘干，得白色DC18。
7.應用權利要求2 6所述微生物同步發酵正十八烷生產十八碳二羧酸方法，其特征 在于在以Cltl-C18的單一或混合正烷烴為基質的培養基中同步發酵，生產相應的Cltl-C18Ci， ω- 二元酸。
8.應用權利要求2 6所述微生物同步發酵生產十八碳二羧酸方法，其特征在于其中 發酵基質使用十八碳脂肪酸甲酯。
全文摘要
本發明公開了一種利用微生物發酵正十八烷和硬脂酸甲酯生產十八碳二元酸的方法。所用微生物為一株熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)突變菌株ly-8，保藏號為CCTCC NOM 209226。其特點是在微生物菌種接入正烷烴和脂肪酸甲酯為基質的培養基后，30小時內，pH控制在7.1以下，30-80小時內，pH控制在7.5以下，80-144小時，pH控制在8.0以下，發酵轉化生產與基質鏈長相同的二羧酸。當本方法用于發酵正十八烷生產十八碳二元酸時，在10L發酵罐中，發酵150小時，DC18的產量達到115g/L，轉化率為60.8％，DC18純度為95％。
文檔編號C12P7/44GK102115769SQ200910256590
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者曹務波, 曹荀梅子, 陳遠童 申請人:曹務波