專利名稱：棉花纖維特異表達的水孔蛋白家族基因GhPIP2;6的制作方法
技術領域：
本發明涉及棉花基因，具體是水孔蛋白(Aquaporin，AQP)家族的棉花新基因 GhPIP2 ；6的cDNA和基因組DNA全長序列的克隆鑒定及其編碼蛋白的活性檢測；并研究它 們在棉纖維發育過程中的表達及功能，進而應用于棉纖維品質改良。
背景技術：
水是植物所有活細胞的重要組成成分，對水分吸收和運輸的嚴格調控是植物生長 和發育的基礎。在植物體內水分的運輸有3種途徑質外體途徑、共質體途徑和跨膜運輸 途徑。跨膜運輸途徑是指水分跨過液泡膜和質膜的運輸。水分的跨膜運輸又可以分為兩種 方式，1)通過磷脂雙分子層的自由擴散運輸；2)通過膜上的通道蛋白進行的被動運輸。生 物膜上運輸水分的通道蛋白統稱為水孔蛋白(Aquaporin，AQP)。第一個水孔蛋白AQPl是 Agre研究小組在1988年從人紅細胞質膜上分離出來的，隨后，在植物、動物、酵母和細菌中 都發現有許多類似的運輸水分的通道蛋白。水孔蛋白與1984年Gorin等從牛晶體纖維細胞膜中分離到的MIP蛋白(Major intrinsicprotein)具有很高的序列同源性和結構相似性，因此將它們同歸于MIP家族， 分子質量在26 34kDa之間。水孔蛋白具有MIP家族結構的典型特征，序列親水性分析 表明，水孔蛋白具有由5個短環(IoopA IoopE)相連的6個跨膜α -螺旋(Hl Η6)及 N末端和C末端。B環、D環、N末端和C末端始終面向細胞質這一側，而A環、C環和E環 則位于另一側。相對而言，水孔蛋白的N末端和C末端具有較大的可變性，而絕大多數水 孔蛋白的B環和E環上都存在一個高度保守的氨基酸序列天冬酰胺_脯氨酸_丙氨酸 (aspargine-proline-alanine, NPA)，被稱之為NPA基序，這兩個NPA基序直接參與了水通 道的形成。對于水孔蛋白的二級拓撲結構，人們提出了幾種假設，其中被普遍接受并被證實 的是Jung等提出的“水漏模型”(Hourglass model)。在此模型中，B環E環各自形成半個 跨膜螺旋(HB和HE)，分別從膜的兩側折向膜內形成第七個跨膜螺旋，2個NPA基序位于該 螺旋的中心，與其它6個跨膜螺旋共同作用，形成一個可雙向運輸水分子的孔道。植物中水孔蛋白數目較多。例如，擬南芥中有35個，玉米和水稻中各有33個 水孔蛋白。根據其序列同源性，植物水孔蛋白可以分為4類質膜內在蛋白(Plasma membraneIntrinsic Proteins，PIP)，液泡月莫內在蛋白(Tonoplast Intrinsic Proteins, TIP)，類 N0D26 內在蛋白(Nodul in26-l ike Intrinsic Proteins，NIP)，小的堿性內在蛋白 (Small basic IntrinsicProteins, SIP) 0其中，質膜內在蛋白根據其序列同源性和活性 差異，又可分為PIPl和PIP2兩個亞類，在爪蟾卵母細胞或酵母細胞中表達，大多數PIPl蛋 白的活性較低或沒有活性，而PIP2蛋白的活性則明顯高于PIPl蛋白。已有研究表明，4類 水孔蛋白均具有轉運水分子的功能，同時還能轉運一些小的中性分子，如C02、H202、尿素、硼 酸、硅酸等。它們參與了一系列重要的生理過程(例如，水分的吸收和運輸、種子的成熟與 萌發、花粉的開裂和萌發、細胞伸長、逆境應答等)，在植物生長發育繁殖及逆境應答等過程 中都起著非常重要的作用。目前在棉花中僅報道了 8個水孔蛋白基因，大多在根中優勢表達，參與水分的吸收和植物逆境應答反應，其它在胚珠中特異表達(GhAQPl)和纖維中優勢 表達(GhPIPl-2和Gh γ TIP1)，但其功能和調控機制尚不清楚。

發明內容
本發明的目的在于提供一個在棉纖維中特異表達的水孔蛋白家族新基因GhPIP2 ； 6，分析其蛋白活性及其在酵母細胞中表達對宿主細胞形態的影響，以研究其功能，為解析 纖維細胞伸長的分子機制，改良棉纖維的品質提供新的理論基礎。我們構建了棉花纖維的cDNA文庫，從文庫中隨機挑出4000個cDNA克隆，經測序 和比較分析發現其中一些克隆含有水孔蛋白基因(GhPIP)的部分序列。用a-P32PP-dCTP標 記GhPIP cDNA 3，-末端片段(0. 4kb)，以此為探針，篩選纖維cDNA文庫，得到100多個陽 性克隆，經測序證實其中一些克隆含有GhPIP2 ；6基因的全長cDNA序列。GhPIP2 ；6基因的cDNA全長為1012bp，其開放閱讀框為837bp，編碼278個氨基酸， 蛋白分子量約為29. BkDa0經比較發現，GhPIP2 ；6蛋白具有水孔蛋白的典型結構和保守序 列，含有5個短環連接的6個α-跨膜螺旋和兩個高度保守的“NPA”基序(圖1)。與已知 的擬南芥和棉花水孔蛋白序列相比較，GhPIP2 ；6與PIP2類蛋白的同源性較高(序列相似 性76 94% )，與PIPl類蛋白的同源性次之，而與其它種類的水孔蛋白序列相似性較低。為獲取GhPIP2 ；6基因的基因組DNA全長序列，本申請人在其開放閱讀框(ORF)兩 端設計一對引物(見表1)，以棉花基因組DNA為模板，在94°C -5min, 1個循環；94°C -lmin, 58°C -lmin,72°C -2min，32個循環的PCR反應條件下得到了一個IOlObp的產物。測序結果 顯示該DNA序列為GhPIP2 ；6基因的DNA全長序列，與其cDNA序列比較分析發現該基因含 有兩個內含子，長度為89和84bp，第一個內含子插入在編碼Gly94密碼子內，第二個內含子 插入在編碼His239與Trp240的密碼子之間(圖2)。為驗證GhPIP2 ；6基因編碼的蛋白是否具有水通道活性，我們利用爪蟾卵母細胞 系統進行檢測。先在體外轉錄合成GhPIP基因帶帽結構的cRNA并定量，然后按每個細胞 50ngcRNA進行顯微注射。注射后的卵母細胞在孵育液中靜置培養2 3天，以使GhPIP2 蛋白在細胞內充分合成并整合到細胞膜上。檢測蛋白活性時，將卵母細胞轉移至高滲溶液 1/5ND96溶液中后，拍照記錄細胞體積的變化。卵母細胞轉入1/5ND96溶液后，因細胞內 外的滲透差，水分進入細胞而使其膨脹，體積變大。根據細胞體積變化的速率可計算細胞 膜的水導度，也即是GhPIP2蛋白的活性。如圖3A所示，注射GhPIP2 cRNA的細胞快速膨 脹，體積明顯增大；而注射水的對照細胞大小基本沒有變化。表達GhPIP2蛋白的卵母細胞 轉移到1/5 ND96溶液后3分鐘內細胞半徑變化如表2所示，對照細胞的體積變化很小，半 徑差僅約5. 4 μ m，而表達GhPIP2蛋白的卵母細胞膨脹明顯，在3min內即使細胞半徑增 加了 21. 7 22. 8 μ m。細胞膨脹速率不同，說明細胞膜對水的透性存在差異，即水導度不 同。對照細胞的水導度Pf = 9. 82 士 5. 27μπιΛ(η = 30)，而表達GhPIP2 ；6的細胞水導度為 41. 03 士 8. 07 μ m/s (η = 30)，與對照相比，細胞水導度增加了約4. 2倍(圖3Β)。用水孔蛋 白活性抑制劑HgCl2 (50 μ Μ)預處理上述卵母細胞0. 5h，則細胞膨脹速度明顯下降(表2)， GhPIP2 ；6的水通道活性顯著降低(圖3B)。以上結果說明GhPIP2 ；6蛋白具有運輸水分的 功能，能提高細胞膜對水的透性。為研究GhPIP2 ；6基因在棉花各組織/器官中的表達模式，用改良的CTAB/酸酚法提取棉花組織/器官的總RNA，分別做實時定量RT-PCR和Northern雜交，結果如圖4A和 4B所示。兩個實驗結果均顯示GhPIP2 ；6基因在纖維中特異表達，且Northern雜交結果顯 示GhPIP2;6在6 12 DPA纖維中的表達量有明顯差異。因此，我們又采集并提取了 3 20 DPA的纖維的總RNA，對這個基因在纖維發育過程中的表達情況作進一步詳細的分析，實 時定量RT-PCR結果如圖4C所示。GhPIP2 ；6在纖維發育過程中的表達模式基本一致，其轉 錄產物主要集中在3 12 DPA纖維中，在9 DPA纖維中表達量最高，在15 20 DPA纖維 中，表達量急劇下降到很低的水平。GhPIP2 ；6mRNA在伸長期的棉纖維中大量積累，表明這些基因產物在纖維細胞伸 長過程中可能起重要作用。為進一步研究GhPIP2基因(蛋白)的功能，GhPIP2;6基因的 編碼序列(ORF)被重組到酵母表達載體PREP-5N質粒中，隨后用重組質粒轉化裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)細胞。在 pREP 質粒中，GhPIP2 ；6 的表達受到 nmt-Ι 啟動 子的調控。nmt-Ι啟動子的活性受外源VB1的抑制，即當培養基中缺乏VB1 (誘導培養基) 時，啟動下游基因的表達，而當培養基中存在VB1時(非誘導培養基)，啟動子下游基因不表 達。對包含pREP-GhPIP2 ；6質粒的酵母在誘導或非誘導培養基中培養一段時間后的細胞形 態進行觀察分析，實驗結果如圖6和表3所示。對照酵母細胞(包含PREP-5N空質粒)無 論在非誘導還是在誘導培養基中，形態基本沒有差異(圖5a和5b)。GhPIP2 ；6轉基因酵母 (包含pREP-GhPIP2 ；6質粒)在非誘導培養基中形態與對照類似(圖5c)，而在誘導培養基 中細胞長度顯著比在非誘導條件下長得多(圖5d)。從轉基因酵母中隨機選取5個細胞系 進行培養，測量其在非誘導和誘導條件下的細胞長度，統計分析結果顯示GhPIP2 ；6轉基因 酵母在誘導條件下與在非誘導條件下的細胞長度有顯著的差異，對照細胞在兩種條件下長 度沒有明顯的差異(如表3所示)。GhPIP2 ；6的表達可使細胞伸長1. 30 1. 47倍。以上 實驗結果表明，GhPIP2 ；6基因在裂殖酵母中異源表達可以顯著改變細胞的形態，促使細胞 縱向伸長。HgCl2是水孔蛋白活性抑制劑，它能阻斷水孔蛋白介導的水分運輸。為研究水孔 蛋白是否在纖維發育過程中起重要作用，本申請人用低濃度的HgCl2 (O 50 μ M)短時間 (0. 5 2h)處理開花后1天的棉花離體胚珠，再在正常條件下培養10 12天，結果發現纖 維長度顯著下降，經過HgCl2處理的纖維其長度是對照的52. 4 69. 7% (圖6)，這表明水 孔蛋白參與了纖維的發育尤其是纖維的伸長。本發明的優點1、提供了一個棉花新基因GhPIP2 ；6的全長cDNA序列及其編碼的蛋白質序列，并 通過非洲爪蟾卵母細胞系統檢測了蛋白活性，發現這個基因的編碼蛋白具有強的水通道活 性，證明它們屬于水孔蛋白家族。2、提供了 GhPIP2 ；6基因的全長DNA序列，該基因由三個外顯子和兩個內含子組 成。3、GhPIP2 ；6的轉錄產物在處于伸長期的棉纖維細胞中大量積累，而且GhPIP2 ；6 基因的表達能顯著促使酵母細胞縱向伸長，水孔蛋白活性抑制劑HgCl2能顯著抑制纖維的 伸長，這些實驗結果表明GhPIP2 ；6參與了棉纖維的發育，在纖維伸長過程中起重要作用。本發明通過以下附圖和實施進行進一步闡述，但并不限制本發明的范圍。


圖l.GhPIP2 ；6蛋白結構分析及與棉花已知PIP蛋白的序列比較。圖中黑色陰影中的字母表示GhPIPl和GhPIP2中可替換的氨基酸殘基，灰色陰影 中的表示GhPIPl與GhPIP2兩類白中的差異氨基酸殘基。6個方框所在的區域指六個跨膜 螺旋(Hl H6)，加粗的字母則表示MIP家族的典型序列。箭頭所指的位置是GhPIP2;6基 因的內含子插入的位置。已知棉花PIP蛋白在GenBank內的Accession號碼如下=GhPIPl ； 1 (ABK60194) ；GhPIPl-2(ABR68794) ；GhPIPl ；3 (ABD63904) ；GhPIP2 ； 1 (ABK60195)； GhPIP2 ；2(ABK60195) ；GhPIP2 ;3 (ACB42440) ；GhPIP2 ；4 (ACB42441)。圖2. GhPIP2 ；6的基因結構。黑色方框表示外顯子，線段表示5’ -和3’ -端非編碼區及內含子。線段下的數字 指內含子的大小，而線段上的氨基酸及數字指內含子在基因中插入的位點。ATG，起始密碼 子；TGA和TAA，終止密碼子。圖3. GhPIP2 ；6蛋白活性分析。A、表達GhPIP2蛋白的爪蟾卵母細胞轉移到高滲溶液5分鐘前后體積變化；B、表達GhPIP2蛋白的卵母細胞的質膜水導度及HgCl2對GhPIP2蛋白活性的抑制。 GhPIP2 ；6 cRNA的爪蟾卵母細胞在轉移到1/5 ND96高滲溶液之前，先轉移到含50 μ mol/L HgCl2的孵育液中預處理30分鐘，再檢測細胞的水導度。“**”指經過生物統計學分析，注 射了 GhPIP2 cRNA的卵母細胞的水導度與對照有極顯著差異(P值<0.01) ；“++”代表經過 HgCl2預處理的細胞水導度與未經處理的細胞水導度有極顯著差異(P值< 0. 01)。圖4. GhPIP2 ；6基因的表達分析。A、實時熒光定量RT-PCR分析GhPIP2 ；6基因在棉花不同組織/器官中的差異表達 (R，根；C,子葉；L,葉片；H,下胚軸；P,花瓣；A,花藥；0，胚珠；F,纖維)；B、Northern雜交分析GhPIP2 ；6基因在棉花各組織/器官中的差異表達(R，根； C，子葉；L，葉；H，下胚軸；P，花瓣；A，花藥；0，開花后10天的胚珠；F6 F12，分別指開花后 6，8，10，12 天纖維)；C、實時熒光定量RT-PCR分析GhPIP2 ；6基因在纖維發育過程中的表達(3f 20f， 指開花后3 20天纖維)。圖5.過量表達GhPIP2 ；6基因的裂殖酵母細胞形態分析。(a和b)在非誘導(a)或誘導(b)培養基上生長的包含pREP5N空質粒的對照酵母 細胞；(c和d)在非誘導(c)或誘導(d)培養基上生長的包含pREP_GhPIP2 ；6質粒的酵 母細胞。圖6. HgCl2顯著抑制棉纖維細胞伸長，導致纖維長度變短。a、用含有不同濃度的HgCl2 (0 50 μ Μ)的BT培養基處理開花后1天的棉花離體 胚珠0. 5小時后，再在不含HgCl2的BT培養基中培養12天后的棉花胚珠；b、用含有50 μ M HgCl2的BT培養基處理開花后1天的棉花離體胚珠不同時間后 (0 2小時)，再在不含HgCl2的BT培養基中培養10天后的棉花胚珠；C、經過不同濃度的HgCl2 (0 50 μ Μ)處理0. 5小時后再培養12天的離體胚珠纖 維的長度；
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表3多個不同轉GhPIP2 ；6基因的酵母細胞系和對照酵母細胞系的細胞長度統計 分析。d、經過50 μ M的HgCl2處理不同時間(0 2小時)后再培養10天的離體胚珠纖 維的長度。表1 GhPIP2 ；6基因RT-PCR引物及GhPIP2 ；6基因全長DNA序列克隆引物 表2表達GhPIP2蛋白的爪蟾卵母細胞轉移到高滲溶液后半徑的變化 (1)棉纖維 cDNA 文庫的構建(按 Li XB 等，2002，Molecular characterization of the cottonGhTUBl gene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiol 130 666-674中的方法進行)。(2)從棉纖維cDNA文庫中隨機挑出1000個cDNA克隆，經測序和比較分析發現 其中一些克隆含有水孔蛋白基因(GhPIP)的部分序列。用α-P32PP-dCTP標記GhPIP cDNA 3’ -末端片段(0. 4kb)，以此為探針，篩選纖維cDNA文庫中2X IOP5p克隆，得到十多個陽性 克隆，經測序發現其中3個克隆含有GhPIP2 ；6基因的全長cDNA序列。2、GhPIP2 ；6基因的DNA全長序列的克隆在GhPIP2 ；6基因ORF兩端設計一對引物(見表1)，以棉花⑶NA為模板，在94°C _5 分鐘，1個循環；94°C -1分鐘，580C -1分鐘，720C _2分鐘，32個循環的PCR反應條件下得到 了一個約Ikb的DNA片段，將該片段插入到PBS-T載體中。利用PBS質粒上的T3和T7啟 動子對目的DNA片段進行測序。再用DNAstar軟件分析所得的序列，與基因cDNA序列進行 比較，分析內含子的大小和插入位置。3、GhPIP2蛋白活性檢測(1)爪蟾卵母細胞預處理低溫麻醉爪蟾后，手術方式取出適量卵巢的卵頁，并縫 合爪蟾下腹部；用鑷子將卵頁分成小塊，再用滴管取至50ml離心管中；用無鈣ND96溶液沖 洗數遍后，加入2mg/ml的膠原酶室溫消化1小時；棄上清，取出卵母細胞至孵育液中培養備用。(2)顯微注射體外轉錄合成基因的cRNA(按Ambion公司的體外轉錄試劑盒 mMACHINESP6 Kit的說明書操作)；將cRNA濃度調至1 μ g/μ 1 ；在實體顯微鏡下，用顯微注 射儀向每個卵母細胞注射50nl的cRNA，對照注射50nl的RNase-free水；(3)GhPIP2蛋白合成將注射后的卵母細胞轉移至新鮮的ND96溶液中，19°C靜置 培養2 3天，GhPIP蛋白即在卵母細胞內合成并整合到卵細胞膜上。(4)卵細胞膜水導度檢測將培養2 3天后的卵母細胞轉移至1/5ND96溶液 中，在實體顯微鏡下每隔30秒拍照一次，記錄卵母細胞體積的變化。再根據
公式Pf =V。[d(V/VQ)/dt]/[SQXVw(0Smin-0Sm。ut)]，計算細胞膜的水導度，其中，V0 = 9X10_4cm3，S0 = 0. 045cm2, V0, S0為卵母細胞初始體積和表面積；V為變量，指t時刻時卵母細胞的體積；VW =18cm7mol，為水的摩爾體積；Osmin = 220mosm/kg，指細胞內的滲透壓，Osmout = 44mosm/ kg，指細胞外的滲透壓。4、實時熒光定量RT-PCR(1)棉花各組織總RNA的提取(按蔣建雄、張天真，2003，利用CTAB/酸酚法提取棉 花組織總RNA0棉花學報，15 166-167進行)；(2)逆轉錄按M-MLV逆轉錄酶(Promega公司)的使用說明書操作；(3)實時熒光定量PCR:按熒光定量PCR試劑盒(Τ0Υ0Β0)的使用說明書操作。以 棉花持家基因GhUBI作為內參，根據公式Y= 10Δ__5Χ100%計算基因表達的相對值。Ct 是指基因擴增產物最初能被熒光檢測到的循環數，ACt是指目的基因與內參基因GhUBI循 環數的差值，即ACt = CtGhUBI-CtGhPIPs。為了得到最佳的實驗效果，PCR擴增條件及引 物效率都以目的基因的cDNA為模扳進行優化。該實驗中每個組織采集3次樣品，分別提取 RNA,每個樣品的RNA重復3次實時定量RT-PCR實驗，最后統計9次實驗結果，計算其平均 值和標準差。5、Northern 雜交總RNA的電泳和轉膜及雜交均按《分子克隆》介紹的方法進行(主編，第三版)。 雜交探針的合成是以基因cDNA的3’端約0. 2kb的序列作為雜交探針模板，按隨機引物標 記 DNA 試劑盒(Random Primer DNA labeling Kit, Takara)的操作說明進行的。6、酵母轉化、培養及形態觀察根據分子克隆技術，在GhPIP2 ;6基因開放閱讀框(ORF)兩端引物加上Nde I 和Sal I酶切位點的回文序列，用于PCR擴增基因ORF片段。用相應的內切酶酶切該目 的DNA片段后，重組到pREP-5N質粒中。酵母轉化、培養及形態觀察均按Li L等，2007， Molecularcharacterization of cotton GhTUA9 gene specifically expressed in fiber and involved in cell elongation. J Exp Bot，58 :3227_3238 中的方法進行。7、棉花離體胚珠培養及HgCl2處理采集開花后1天的棉鈴，用體積濃度70%乙醇表面殺菌1分鐘，無菌水沖洗3 4 次后，在無菌條件下，將棉鈴中的胚珠剝離出來，置于適量BT培養基中，按比例加入一定量 的無菌ImM HgCl2，靜置0. 5 2小時后取出，用BT培養基清洗2次，再置于適量BT培養基 中，30°C，黑暗條件下靜置培養10 12天。棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于該基因的全長cDNA核苷酸序列如 下GGGCACGAGT CAAAAAAGCT TCCAACATTT TGAAGAAACA AAGAATCAAA CATGTCGAAG 60GMGTGAGTG MGAAGGGGT GAGCCGAAAG GACTATGTGG ATCCTCCACC GGCACCGCTC 120ATCGACGTGG CTGAGATCAA GCTTTGGTCT TTTTACAGAG CTCTCATCGC CGAATTCATC 180GCTACTCTCC TCTTCCTATA CGTCACCATA GCCACCGTCA TCGGCCACAA GAAACMCAC 240GATGCATGCG ATGGTGTTGG TCTTTTGGGC ATTGCTTGGG CTTTTGGTGG CATGATTTTC 300ATTCTTGTTT ACTGCACCGC CGGTATCTCA GGTGGTCACA TTAACCCGGC GGTGACATTT 360GGGTTGTTTT TGGCTAGGAA GGTGTCGTTA ATAAGGGCGG TGGCTTACAT GGTAGCTCM 420
100071]TGTTTGGGTG CTATTTGTGG TGTTGGGTTA GTTAAGGCAT TCATGAAGAG TGAATACAAC480
0072]TCCCTTGGCG GCGGTGTTAA CACGGTGGCG ACTGGTTATA ACAAAGGGAC TGCTTTGGGA540
0073]GCTGAGATTA TTGGGACATT CGTGCTTGTT TACACTGTTT TTTCAGCTAC TGACCCTAM600
0074]AGAAGTGCCC GTGATTCACA TGTACCCGTG TTGGCTCCAC TTCCTATAGG ATTTGCAGTG660
0075]TTCATGGTTC ATTTGGCTAC TATTCCTATC ACCGGAACTG GTATTAACCC TGCTAGAAGC720
0076]TTCGGCGCCG CCGTTATTTA CAACAACGAC AAGGCTTGGG ATGACCACTG GATATTCTGG780
0077]GTTGGACCAA TGGTGGGAGC ACTTGCGGCG GCGGCATATC ATCAGTACAT CCTTAGAGCG840
0078]GCGGCTATTA AGGCTTTGGG ATCTTTCCGG AGCAACCCCA GCAATTAAAA GCTMAAAGA900
0079]GMGAAMCC ACAATATGTT TGTCTCATTG TGTTTATAAT GTTTCTTCAT TGTTGGTTCC960
0080]TGTGTGTGTA TTGTATTATG ATTGATGATT ATTAATTCAG ACCTTTTTAT TT1012
0081]所述的一個棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于與該基因的第52 888 核苷酸對應的編碼氨基酸序列如下
0082]MetSerLysGluValSerGluGluGlyValSerArgLysAspTyrValAsp0083]1510150084]ProProProAlaProLeulieAspValAlaGlulieLysLeuTrpSerPhe0085]2025300086]TyrArgAlaLeulieAlaGluPhelieAlaThrLeuLeuPheLeuTyrVal0087]354045500088]ThrlieAlaThrVallieGlyHisLysLysGlnHisAspAlaCysAspGly0089]5560650090]ValGlyLeuLeuGlylieAlaTrpAlaPheGlyGlyMetliePhelieLeu0091]707580850092]ValTyrCysThrAlaGlylieSerGlyGlyHislieAsnProAlaValThr0093]90951000094]PheGlyLeuPheLeuAlaArgLysValSerLeulieArgAlaValAlaTyr0095]1051101150096]MetValAlaGlnCysLeuGlyAlalieCysGlyValGlyLeuValLysAla0097]1201251301350098]PheMetLysSerGluTyrAsnSerLeuGlyGlyGlyValAsnThrValAla0099]1401451500100]ThrGlyTyrAsnLysGlyThrAlaLeuGlyAlaGlulielieGlyThrPhe0101]1551601651700102]ValLeuValTyrThrValPheSerAlaThrAspProLysArgSerAlaArg0103]1751801850104]AspSerHisValProValLeuAlaProLeuProlieGlyPheAlaValPhe0105]1901952000106]MetValHisLeuAlaThrlieProlieThrGlyThrGlylieAsnProAla0107]2052102152200108]ArgSerPheGlyAlaAlaVallieTyrAsnAsnAspLysAlaTrpAspAsp
225230235His Trp lie Phe Trp Val Gly Pro Met Val Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala240245 250255Tyr His Gln Tyr lie Leu Arg Ala Ala Ala lie Lys Ala Leu Gly Ser Phe260265270Arg Ser Asn Pro Ser Asn275278棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于該基因的基因組DNA全長核苷酸序 列如下(斜體下劃線標記的序列為內含子核苷酸序列)ATGTCGAAGG AAGTGAGTGA AGAAGGGGTG AGCCGAAAGG ACTATGTGGA TCCTCCACCG 60GCACCGCTCA TCGACGTGGC TGAGATCAAG CTTTGGTCTT TTTACAGAGC TCTCATCGCC 120GMTTCATCG CTACTCTCCT CTTCCTATAC GTCACCATAG CCACCGTCAT CGGCCACAAG 180AMCAACACG ATGCATGCGA TGGTGTTGGT CTTTTGGGCA TTGCTTGGGC TTTTGGTGGC 240ATGATTTTCA TTCTTGTTTA CTGCACCGCC GGTATCTCAG gtactctccc ccccccaaaa 300
aaaaacagtg acttcattaa tatagccaat tagccatttt tgttgaattt tggttgtttt 360
0123]acgacgcaa GTGGTCACATTMCCCGGCGGTGACATTTGG GTTGTTTTTG GCTAGGAAGG4200124]TGTCGTTAATMGGGCGGTGGCTTACATGGTAGCTCAATGTTTGGGTGCTATTTGTGGTG4800125]TTGGGTTAGTTAAGGCATTCATGAAGAGTGAATACAACTCCCTTGGCGGCGGTGTTAACA5400126]CGGTGGCGACTGGTTATAACMAGGGACTGCTTTGGGAGCTGAGATTATTGGGACATTCG6000127]TGCTTGTTTACACTGTTTTTTCAGCTACTGACCCTAAAAGAAGTGCCCGTGATTCACATG6600128]TACCCGTGTTGGCTCCACTTCCTATAGGATTTGCAGTGTTCATGGTTCATTTGGCTACTA7200129]TTCCTATCACCGGAACTGGTATTAACCCTGCTAGMGCTTCGGCGCCGCCGTTATTTACA7800130]ACM0GACM GGCTTGGGAT GAOCAC gtaa gcttctcttt ctaaaaaaaatttcagtgtt840tttttgttca tttagtttgt gaaactaaca aaaatggcga caatgaacag TGGATATTCT 900GGGTTGGACC MTGGTGGGA GCACTTGCGG CGGCGGCATA TCATCAGTAC ATCCTTAGAG 960CGGCGGCTAT TMGGCTTTG GGATCTTTCC GGAGCMCCC CAGCMTTM1010
1權利要求
棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2；6，其特征在于該基因的全長cDNA核苷酸序列如下GGGCACGAGT CAAAAAAGCT TCCAACATTT TGAAGAAACA AAGAATCAAA CATGTCGAAG 60GAAGTGAGTG AAGAAGGGGT GAGCCGAAAG GACTATGTGG ATCCTCCACC GGCACCGCTC 120ATCGACGTGG CTGAGATCAA GCTTTGGTCT TTTTACAGAG CTCTCATCGC CGAATTCATC 180GCTACTCTCC TCTTCCTATA CGTCACCATA GCCACCGTCA TCGGCCACAA GAAACAACAC 240GATGCATGCG ATGGTGTTGG TCTTTTGGGC ATTGCTTGGG CTTTTGGTGG CATGATTTTC 300ATTCTTGTTT ACTGCACCGC CGGTATCTCA GGTGGTCACA TTAACCCGGC GGTGACATTT 360GGGTTGTTTT TGGCTAGGAA GGTGTCGTTA ATAAGGGCGG TGGCTTACAT GGTAGCTCAA 420TGTTTGGGTG CTATTTGTGG TGTTGGGTTA GTTAAGGCAT TCATGAAGAG TGAATACAAC 480TCCCTTGGCG GCGGTGTTAA CACGGTGGCG ACTGGTTATA ACAAAGGGAC TGCTTTGGGA 540GCTGAGATTA TTGGGACATT CGTGCTTGTT TACACTGTTT TTTCAGCTAC TGACCCTAAA 600AGAAGTGCCC GTGATTCACA TGTACCCGTG TTGGCTCCAC TTCCTATAGG ATTTGCAGTG 660TTCATGGTTC ATTTGGCTAC TATTCCTATC ACCGGAACTG GTATTAACCC TGCTAGAAGC 720TTCGGCGCCG CCGTTATTTA CAACAACGAC AAGGCTTGGG ATGACCACTG GATATTCTGG 780GTTGGACCAA TGGTGGGAGC ACTTGCGGCG GCGGCATATC ATCAGTACAT CCTTAGAGCG 840GCGGCTATTA AGGCTTTGGG ATCTTTCCGG AGCAACCCCA GCAATTAAAA GCTAAAAAGA 900GAAGAAAACC ACAATATGTT TGTCTCATTG TGTTTATAAT GTTTCTTCAT TGTTGGTTCC 960TGTGTGTGTA TTGTATTATG ATTGATGATT ATTAATTCAG ACCTTTTTAT TT1012
2.按照權利要求1所述的一個棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ;6，其特征在于與該基因的第52 888核苷酸對應的編碼氨基酸序列如下Met Ser Lys Glu Val Ser Glu Glu Gly Val Ser Arg Lys Asp1510Pro Pro Pro Ala Pro Leu lie Asp Val AlaTyr 35 ThrPro Ala 20Arg Ala Leu lieLeu lie Asp Val 25Glu Phe lie AlaGlu lieAla 40 lielie Ala Thr Val 55Leu Leu Gly lieGly HisVal Gly 70Val Tyr Cys ThrLys 60 AlaLysThr 45 GlnLeuLys 30 LeuTyr Val Asp 15Leu Trp Ser PhePhe Leu Tyr Val 50Cys Asp GlyPhe Gly Leu 105 AlaAla 90Phe Leu Ala ArgAla Trp 75Gly lie Ser GlyHis Asp Ala 65Met lie Phe liePhe Gly Gly 80His lie Asn ProMet 120 PheVal 125 MetLys 110 AlaValGly 95 SerLeu 85 ThrLysGln Cys Leu Gly 130Ser Glu Tyr Asn Ser 140lie CysLeu Gly 145Leu lie Arg 115 GlyGly GlyVal 135Gly ValAla Val 100Ala Val Ala Tyr Leu Val Lys AlaAsn 150Thr Val Ala
3.按照權利要求l所述的棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2；6，其特征在于該基因的基因組DNA全長核苷酸序列如下(斜體下劃線標記的序列為內含子核苷酸序列)ATGTCGAAGG AAGTGAGTGA AGAAGGGGTG AGCCGAAAGG ACTATGTGGA TCCTCCACCG60GCACCGCTCA TCGACGTGGC TGAGATCAAG CTTTGGTCTT TTTACAGAGC TCTCATCGCCl 20GAATTCATCG CTACTCTCCT CTTCCTATAC GTCACCATAG CCACCGTCAT CGGCCACAAGl 80AAACAACACG ATGCATGCGA TGGTGTTGGT CTTTTGGGCA TTGCTTGGGC TTTTGGTGGC 240ATGATTTTCA TTCTTGTTTA CTGCACCGCC GGTATCTCAG G了AC廠C廠CCC CCCCCCAAAA 300 ACGACGCAGG 7CGTCACATT AACC。GCOCG．mACArI”m GTKrIT廠IG GCrAGGAACG420TGTCGTTAAT AAGGGCGGTG GCTTACATGG TAGCTCAATG TTTGGGTGCT ATTTGTGGTG 480TTGGGTTAGT TAAGGCATTC ATGAAGAGTG AATACAACTC CCTTGGCGGC GGTGTTAACA 540CGGTGGCGAC TGGTTATAAC AAAGGGACTG CTTTGGGAGC TGAGATTATT GGGACATTCG 600TGCTTGTTTA CACTGTTTTT TCAGCTACTG ACCCTAAAAG AAGTGCCCGT GATTCACATG 660TACCCGTGTT GGCTCCACTT CCTATAGGAT TTGCAGTGTT CATGGTTCAT TTGGCTACTA 720TTCCTATCAC CGGAACTGGT ATTAACCCTG CTAGAAGCTT CGGCGCCGCC GTTATTTACA 780ACAACGACAA GGCTTGGGAT GACCAC GTAA GCTTCTCTTT CTAAAAAAAA TTTCAGTGTT 840TTTTTGTTCA TTTAGTTTGT GAAACTAACA AAAATGGCGA CAATGAACAG囂GA TA T TC T 900GGGTTGGACC AATGGTGGGA GCACTTGCGG CGGCGGCATA TCATCAGTAC ATCCTTAGAG 960CGGCGGCTAT TAAGGCTTTG GGATCTTTCC GGAGCAACCC CAGCAATTAAl o l o
全文摘要
棉花纖維特異表達的水孔蛋白家族基因GhPIP2；6。該基因的cDNA全長序列為1012bp，基因全長序列為1134bp，由3個外顯子和2個內含子組成。GhPIP2；6基因編碼的蛋白質為278個氨基酸，分子量約為29.6kDa，其蛋白具有很高的水通道活性。GhPIP2；6在棉纖維中特異表達，其轉錄產物主要在伸長期的棉纖維中積累。在酵母中表達GhPIP2；6基因能促使宿主細胞縱向伸長，細胞長度是對照的1.30～1.47倍。相反，用HgCl2處理導致該蛋白活性下降，棉纖維細胞伸長遲緩，長度變短。上述實驗結果證明GhPIP2；6在棉纖維伸長過程中起重要作用，這個水孔蛋白基因對于改良棉纖維品質、增加棉花產量可能具有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/29GK101906425SQ20091027336
公開日2010年12月8日 申請日期2009年12月23日 優先權日2009年12月23日
發明者吳雅潔, 李學寶, 李登弟, 王秀蘭, 阮想梅 申請人:華中師范大學