專利名稱：棉花GbSTK基因、其編碼蛋白及在植物抗黃萎病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及棉花GbSTK因、其編碼蛋白及在植物抗黃 萎病中的應用。
背景技術：
黃萎病是農作物生產上的主要病害之一，其中對棉花、番茄、茄子、水稻、黃瓜和 向日葵等作物的生產危害嚴重，黃萎病的發生可以導致皮棉纖維品質和產量的嚴重下 降，全世界每年造成的皮棉產量損失約占皮棉產量的10-20%，嚴重發病的年份可以達到 25-30%。因此，防止黃萎病的發生已成為作物生產領域中亟待解決的問題。有研究報道使 用高抗黃萎病材料海島棉和陸地棉進行雜交育種，但F2代分離后，兩者之間很少有基因交 換，所以很難直接利用海島棉來培育高抗黃萎病的陸地棉品種。另外，黃萎病菌是寄主較 為廣泛的病菌，且病菌致病性存在變異，因而通過常規育種方法很難培育出高抗黃萎病的 農作物品種。解決黃萎病的致病機理和尋找抗黃萎病的基因，通過基因工程手段克隆抗黃 萎病基因，進而轉化栽培種驗證基因功能，選育和種植抗病品種的研究越來越受到人們的 關注。與抗黃萎病相關基因序列在GENEBANK數據庫(2010年7月)中僅可檢索到108個 核酸序列和37個蛋白序列，這些序列大部分屬于ve、病程相關蛋白(PR)、18s核糖核酸基 因(18S ribosomal RNA gene)等基因家族，它們分別來源于擬南芥、番茄、棉花、水稻、真 菌等植物。其中，文獻報道的具有黃萎病抗性的基因只有來自于番茄屬的ve基因。轉ve 基因番茄表現出明顯抗性。將從水茄(Solanum torvum Swartz)中克隆得到的StVe基因 轉入櫻桃番茄研究表明轉StVe基因番茄葉片中可溶蛋白具有抑制番茄黃萎病菌生理小種 KVerticillium dahliae race 1)生長的作用。到目前為止，具有明顯抗性的基因種類和 數量遠遠不能滿足農作物育種生產的需要。本發明以海島棉Pima90-53為材料，通過cDNA-AFLP技術篩選得到與抗黃萎病相 關的差異片段，然后通過反轉錄鏈式聚合酶反應(reverse transcription PCR，RT_PCR)和 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術擴增得到棉花黃萎病抗性基因，即絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶(GbSTK)基因，通過對該基因及其編碼蛋白的功能研究，表明GbSTK因具 有一定的抗黃萎病的作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種棉花GbSTK因及其編碼蛋白。本發明的另一目的是提供上述棉花GbSTK因在植物抗黃萎病中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種棉花GbSTK基因編碼的蛋白，具有SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列。例如在非活性區段，將第283位的天冬酰胺(Asn)替換為天冬氨酸(Asp)， 或是將第37位的甘氨酸(Gly)缺失。本發明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
本發明還提供棉花GbSTK基因的全長序列，如SEQ ID No. 1所示。本發明還提供含有棉花GbSTK因的載體及含有該載體的宿主細胞。本發明還提供含有棉花GbSTK基因的轉化植物細胞。本發明進一步提供棉花GbSTK基因在植物抗黃萎病中的應用，所述植物為棉花和 擬南芥。具體地，本發明包括= (I)GbSTK基因的克隆以海島棉Pima90-53為材料，通過 cDNA-AFLP技術篩選得到與黃萎病抗性相關的差異片段，經NCBI網站比對分析和電子拼接 設計引物，通過RACE技術擴增得到黃萎病抗性基因GbSTK全長序列，經過生物軟件DNAMAN 和在美國國立生物信息中心網站(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)的生物信息學分析， 得到GbSTK基因編碼蛋白的開放閱讀框(ORF)。(2) GbSTK基因原核表達構建原核表達載 體，使GbSTK基因在大腸桿菌BL21中表達GbSTK蛋白。(3)GbSTK蛋白的功能分析及預測包 括(a)以洋蔥表皮細胞為材料研究GbSTK蛋白在細胞中的分布；(b)以棉花為材料對GbSTK 蛋白進行功能分析及預測；和(c)以轉GbSTK基因的擬南芥為材料對所表達的GbSTK蛋白 進行功能分析及預測。其中，以洋蔥表皮細胞為材料研究GbSTK蛋白在細胞中的分布，主 要試驗包括采用基因重組技術將GbSTK基因和綠色熒光蛋白基因(GFP)構建成融合基因， 并連接至真核表達載體，然后采用基因槍轟擊法將構建的該GbSTK: :GFP融合基因導入洋 蔥內表皮細胞，使用熒光顯微鏡觀察該融合基因所表達的蛋白在洋蔥內表皮細胞中的分布 情況，結果顯示轉化pCamGbSTK::GFP質粒的洋蔥表皮細胞的細胞膜和細胞骨架周圍的運 輸泡部位有明顯的熒光，由此初步證明GbSTK蛋白主要分布于細胞骨架中。以棉花為材料 對GbSTK蛋白進行功能分析及預測，主要是采用半定量RT-PCR技術分析GbSTK基因在不同 抗性棉花品種中和對黃萎病菌脅迫應答反應的表達差異，結果主要表現為GbSTK蛋白在感 病品種中基因的表達最強，次之是耐病品種，在抗病品種中的表達最弱，同時在黃萎病菌脅 迫48小時后該基因的的表達量最高，說明GbSTK基因參與了黃萎病抗性反應。以轉GbSTK 基因的擬南芥為材料對所表達的GbSTK蛋白進行功能分析及預測，主要是采用農桿菌浸花 法，將GbSTK基因和對照材料即空載體pGN分別轉化到Columbia型擬南芥中。對轉基因擬 南芥接種強致病力黃萎病菌后，轉GbSTK基因擬南芥的黃萎病抗性明顯好于對照材料(轉 PGN空載體擬南芥和Columbia型擬南芥)。同時轉GbSTK基因擬南芥表現出黃化葉片數減 少，花期推遲，頂端第一朵花的高度增加，生物體鮮重增加等表型特征。以上結果綜合分析 說明GbSTK基因對黃萎病具有一定的抗性。借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(1)本發明提供了植物黃萎病抗性GbSTK基因(核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示) 及其編碼的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示)。(2)GbSTK基因及其編碼的蛋白具有一定的抗黃萎病的作用。


圖1為本發明GbSTK基因片段3' RACE擴增結果，其中1為GbSTK-3' NGSP和 GbSTK-7引物擴增產物，2為GbSTK-3' NGSP單引物擴增結果，3為GbSTK_7引物擴增結果， M DL2000DNA 標記。圖2為本發明GbSTK基因片段5' RACE擴增結果，其中1為PCR擴增產物，M為DL2000DNA 標記。圖3為本發明GbSTK基因開放閱讀框擴增結果，其中1為PCR擴增產物，M為 DL2000DNA 標記。圖4為本發明pETGbSTK重組質粒的檢測結果，其中1為PCR擴增產物，2為 pETGbSTK經KpnI/PstI雙酶切產物，M為Ikb DNA標記。圖5為本發明GbSTK基因表達蛋白的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白標記，1，4，7， 10，13分別為不含質粒菌株；2，5，8，11，14分別為為含有空載質粒的菌株；3，6，9，12，15分 別為含有目的基因的菌株，圖中箭頭所示為表達的目的片段67KD。圖6為本發明GbSTK蛋白的亞細胞定位觀察，其中左側為紫外光激發下的熒光觀 察，右側為可見光激發下的細胞觀察。圖7為本發明黃萎病菌脅迫下以管家基因Ubiquitin為內參基因對不同棉花品種 GbSTK基因表達分析，其中1為中棉所8號，2為農大棉94-7，3為Pima90-53，4為冀棉20。圖8為本發明以管家基因Ubiquitin為內參基因對黃萎病菌脅迫不同時間的 GbSTK基因表達分析，其中黃萎病菌脅迫時間分別是0小時、4小時、8小時、12小時、24小 時、36小時和48小時。圖9為本發明黃萎病菌脅迫下的轉基因擬南芥表型觀察，其中a的左側為接水后 Columbia型擬南芥，a的右側為接種黃萎病菌后Columbia型擬南芥；b的左側為接水后轉 GbSTK基因擬南芥，b的右側為接種黃萎病菌后轉GbSTK基因擬南芥；c的左側為接水后轉 空載體PGN擬南芥，c的右側為接種黃萎病菌后轉空載體pGN擬南芥。圖10為本發明黃萎病菌脅迫下的轉基因擬南芥黃化葉片數量累加統計分析結^ ο圖11為本發明黃萎病菌脅迫下的轉基因擬南芥第一朵花開放時莖高的統計分析 結果，其中Col為Columbia型擬南芥；GbSTK為轉GbSTK基因的Columbia型擬南芥；vd為 黃萎病菌；c為水處理對照。圖12為本發明黃萎病菌脅迫下的轉基因擬南芥鮮重分析。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例IGbSTK基因的克隆(1)棉花種植與接種黃萎病菌將海島棉Pima90-53的種子硫酸脫絨后室溫浸種 過夜，選擇發芽整齊一致的種子播于裝有蛙石的營養缽中。當棉苗長至第一片真葉展開時 接種棉花黃萎病菌孢子懸浮液。(2)RNA提取RNA提取和反轉錄采用RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒(購自北京 奧萊博生物技術有限責任公司)，按照說明書操作，得到雙鏈cDNA(dsDNA)材料。(3) cDNA-AFLP 得到的雙鏈DNA (dsDNA)經酶切、連接和測序后得到目的差異 片段，再利用NCBI網站表達序列標簽(expressedsequence tag, EST)數據庫，通過 電子克隆技術拼接得到目的差異片段的電子序列。依據該電子序列設計引物STKfl 5' -ATGAAGAAGAAGCTTGTGCTGC-3‘和 STKf2:5' -TCAAGGGGCCGTAGGTTGTG-3‘。通過 PCR 技術擴增得到目的基因序列。PCR反應體系及程序如下LOyL
2. 0μ L 1. 6μ L 0. 2μ L l.OyL l.OyL 13. 2μ L
PCR體系 目的片段
10 X PCR緩沖液(含Mg2+) 2. 5mM dNTPs
Taq plus DNA 聚合酶(2. 5U/μ L) STKfl(IOuM) STKf2(IOuM) ddH20
混合后，向每管中加入15 μ L礦物油。 PCR擴增程序 95 0C 5分鐘；
950C 30秒，50°C 30秒，72°C 1分鐘 4個循環； 95 0C 30 秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘 25 個循環； 72 0C 10 分鐘。
經瓊脂糖電泳后回收的目的片段連接于PGEM-T載體，反應體系如下 cDNA2 μ LpGM-T 載體(50ng/ μ L)1 μ LT4DNA 連接酶(3U/ μ L)IyLIOX連接緩沖液IyLddH205 μ L將上述混合液混勻后4°C連接過夜。(4)轉化大腸桿菌，獲得陽性克隆連接產物采用熱擊法轉化大腸桿菌感受態細 胞。挑取陽性克隆，進行質粒提取，酶切檢測和測序，獲得與黃萎病抗性相關的差異片段。(5)經NCBI網站比對分析和電子拼接設計引物，引物序列(含巢式引物)如下引物名稱引物序列GbSTK-3‘ GSP 5' -ATGAAGAAGAAGCTTGTGCTGC-3‘GbSTK-3‘ NGSP 5' -AGGAAGAATTCAAGCAAATCC-3‘GbSTK-75' -GCTTACCCTCTTCTTCATCC-3‘GbSTK-6945' -ACCCTCTTTGGAAACCGT-3‘(6)通過RACE技術擴增得到黃萎病抗性基因GbSTK全長將Pima90-53的種子硫 酸脫絨后室溫浸種過夜，選擇發芽整齊一致的種子播于裝有蛙石的營養缽中。當棉苗長至 第一片真葉展開時接種棉花黃萎病菌孢子懸浮液，并提取RNA，RNA提取和反轉錄步驟按照 RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒(購自北京奧萊博生物技術有限責任公司)說明書操作，得 到單鏈cDNA(ssDNA)材料。利用上述引物，采用RACE試劑盒，按照說明書進行操作，3 ‘ RACE 擴增體系如下單鏈cDNALOyL10 X PCR 緩沖液(含 Mg2+)2. 0 μ L2. 5mM dNTPs1. 6μ LTaq plus DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0. 2 μ L
6
PstI1 μ L
10 X H緩沖液2μ L
ddH206 μ L
pET-41a(+)的質粒10 μ L
將表達載體與目的基因片段進行連接，反應體系如下
PCR產物5 μ L
pET-41a(+)載體3μ L
T4DNA 連接酶(3U/ μ L)1 μ L
IOX連接緩沖液1 μ L
混勻后4°C連接過夜。
(4)融合重組蛋白的誘導表達將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，經過PCR和酶切
檢測出陽性克隆。并將含有陽性克隆的質粒直接轉化大腸桿菌BL21菌株后挑取陽性克隆， 經質粒提取、酶切檢測(如圖4所示，圖4為本發明pETGbSTK重組質粒的檢測結果，1 %瓊 脂糖凝膠電泳，其中1為PCR擴增產物，2為pETGbSTK經KpnI/PstI雙酶切產物，M為Ikb DNAmarker)，最后進行測序鑒定。 (5) SDS-PAGE蛋白電泳利用IPTG誘導表達轉有原核表達載體的BL21菌株，分別 收集誘導3小時，6小時，8小時和10小時的菌液，如圖5所示，對pETGbSTK質粒轉化的BL21 受體菌進行誘導表達試驗，結果表明經終濃度為ImM的IPTG誘導，重組質粒在大約74KD的 位置上出現了特異條帶，與預期的表達目標蛋白大小一致。其中pET-41a(+)載體的N端有 GST · Tag序列，產生31KDa的蛋白；表達的目的基因為1314bp，編碼437個氨基酸，可表達 理論上為38KDa的蛋白，二者共為67KD。并設置了不同的誘導溫度(28°C、37°C )和誘導時 間(3小時、6小時、8小時、10小時)。結果表明，重組蛋白在28°C誘導下有明顯特異條帶，37°C時無明顯誘導；在誘導時間為3小時后已經得到了明顯的蛋白表達，隨著誘導時間的 延長，重組蛋白的誘導表達量變化不大。圖中箭頭所示為表達目的片段67KD;M是蛋白標 記；1，4，7，10，13分別為不含質粒菌株；2，5，8，11，14分別為為含有空載質粒的菌株；3，6， 9，12，15分別為含有目的基因的菌株。實施例3GbSTK蛋白的功能分析及預測1、以洋蔥表皮細胞為材料研究GbSTK所表達蛋白在細胞中的分布(即GbSTK基因 所表達蛋白的亞細胞定位研究)(1)設計引物序列利用DNAMAN軟件設計PCR引物，序列如下C5-Y 5‘ -GTCGACATGAAGAAGAAGCTTGTG-3‘C3-Y 5‘ -CCCGGGAGGGGCCGTAGGTTGTGTAAC-3‘(2)開放閱讀框擴增以質粒為模板，擴增不含終止密碼子基因的開放閱讀框，電 泳檢測后切膠回收擴增出的目的條帶，與PGEM-T載體連接，通過藍白斑篩選，測序，篩選出 開放閱讀框序列無誤的含pGEM-STK的陽性克隆用于后續試驗。(3)融合表達載體的構建將中間載體pGEM-STK和表達載體pCamE_GFP分別用Sal I和ApaI酶切。酶切反應體系為Sal I1 μ LApa I1 μ LIOXFast Digest 緩沖液2μ LH2O6μ L質粒IOyL回收酶切產物得到目的片段，然后進行連接。連接體系如下目的片段5yLpCamE-GFP 載體3yLT4DNA 連接酶(3U/ μ L)1 μ LIOX連接緩沖液IyL連接產物采用熱擊法轉化大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性克隆，進行質粒提取，酶 切檢測和測序，獲得用于亞細胞定位的融合表達載體pCamGbSTK: :GFP。(4)基因槍轟擊洋蔥內表皮細胞轉化融合表達載體pCamGbSTK: :GFP。(5)熒光顯微鏡觀察基因槍轟擊后的洋蔥內表皮細胞置于熒光顯微鏡下觀察綠 色熒光在細胞內的分布情況。結果顯示轉化pCamGbSTK: :GFP質粒的洋蔥表皮細胞的細胞 骨架部位有明顯的熒光并呈線性分布，與細胞骨架在細胞中的分布一致，由此推斷GbSTK 蛋白主要分布于細胞骨架中，結果如圖6所示。2、以棉花為材料對GbSTK蛋白進行功能分析及預測(1)棉花種植與接種黃萎病菌將Pima90-53的種子硫酸脫絨后室溫浸種過夜，選 擇發芽整齊一致的種子播于裝有蛙石的營養缽中。當棉苗長至第一片真葉展開時接種棉花 黃萎病菌孢子懸浮液。(2)RNA提取RNA提取和反轉錄采用RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒(購自北京 奧萊博生物技術有限責任公司)，按照所明書操作，得到單鏈cDNA(ssDNA)材料。
半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)對GbSTK基因在棉花不同抗性品種 中的表達分析分別利用前述方法提取棉花抗病品種冀棉20、Pima90-53，耐病品種農大棉 94-7，感病品種中棉所8號的RNA，以棉花中組成型表達基因Ubiquitin作為內參，反應體系 如下引物名稱
Ubiquitin 引物 GbSTK引物
引物序列 正向5' 反向5' 正向5'
-CTGAATCTTCGCTTTCACGTTATC-3‘ -GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC-3‘ -ATGAAGAAGAAGCTTGTGCTGC-3‘
反向5' -TCAA GGGGCCGTAGGTTGTG-3‘
目的基因的PCR反應體系
cDNALOyL
10 X PCR 緩沖液(含 Mg2+)2. 0 μ L
2. 5mM dNTPs1. 6μ L
Taq plus DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L)0. 2 μ L
GbSTK 正向引物(10 μ Μ)l.OyL
GbSTK 反向引物(10 μ Μ)l.OyL
ddH2013. 2μ L 內參Ubiquitin的PCR反應體系
cDNALOyL
10 X PCR 緩沖液(含 Mg2+)2. 0 μ L
2. 5mM dNTPs1. 6μ L
Taq plus DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L)0. 2 μ L
Ubiquitin 向引物(ΙΟμΜ)l.OyL
Ubiquitin 反向引物(10 μ Μ)l.OyL ddH90
_13. 2μ L
將目的基因和內參Ubiquitin的PCR反應體系分別配制混合后，向每管中加入 IOuL礦物油。按如下程序進行PCR擴增94 "C 5 分鐘；94"C 45 秒，58°C 45 秒，72°C 1 分鐘 45 秒 23 個循環；72 "C 10 分鐘。PCR結果經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示GbSTK基因在不同抗性棉花品種中的 表達具有明顯差異，在感病品種中基因的表達最強，次之是耐病品種，在抗病品種中的表達 最弱，據此推測GbSTK基因可能為抗黃萎病相關基因，結果如圖7所示。(4)半定量RT-PCR在棉花對黃萎病菌脅迫下應答反應的GbSTK基因表達差異分 析分別利用前述方法提取棉花在黃萎病菌脅迫O小時、4小時、8小時、12小時、24小 時、36小時、48小時后的總RNA，反轉錄后，以Ubiquitin基因作為內參進行PCR反應，具體 反應體系如下
10
引物名稱 引物序列
正向5' -CTGAATCTTCGCTTTCACGTTATC-3‘
Ubiquitin 引物
反向5' -GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC-3‘
正向5' -ATGAAGAAGAAGCTTGTGCTGC-3‘
GbSTK引物
反向5' -TCAAGGGGCCGTAGGTTGTG-3‘
目的基因的PCR反應體系
cDNALOyL
10 X PCR緩沖液(含Mg2+)2. 0μ L
2. 5mM dNTPs1. 6μ L
Taq plus DNA 聚合酶(2. 5U/μ L)0. 2μ L
GbSTK正向引物(10 μ Μ)l.OyL
GbSTK反向引物(10 μ Μ)l.OyL
ddH2013. 2μ L
內參Ubiquitin的PCR反應體系
cDNAl.OyL
10 X PCR緩沖液(含Mg2+)2. 0μ L
2. 5mM dNTPs1. 6μ L
Taq plus DNA 聚合酶(2. 5U/μ L)0. 2μ L
Ubiquitin 正向引物(10 μ Μ)LOyL
Ubiquitin 反向引物(10 μ Μ)LOyL
ddH2013. 2μ L
將目的基因和內參Ubiquitin的PCR反應體系分別配制混合后，向每管中加入IOuL礦物油。按如下程序進行PCR擴增
94 "C 5分鐘；
940C 45 秒，58 °C 45 秒，72 °C1分鐘45秒，23個循環；
72 °C 10 分鐘。
PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明GbSTK基因在棉花黃萎病菌脅迫4小時、8小時、12小時、24小時、36小時、48小!時后的各個時間點均有表達，且其表達量隨接菌
后時間的延長表達量隨之增加，其中黃萎病菌脅迫24小時后表達量明顯增加，處理48小時 后表達量達到最高。說明GbSTK基因與黃萎病菌誘導存在一定相關性。如圖8所示。3、以轉GbSTK基因的擬南芥為材料對所表達的GbSTK蛋白進行功能分析及預測(1)農桿菌浸花法侵染擬南芥采用浸花法(floral dip)將GbSTK基因轉入 Columbia型擬南芥。(2)轉基因擬南芥抗黃萎病菌接菌實驗分析轉GbSTK基因擬南芥、轉基因超表達 載體PGN以及對照Columbia型擬南芥生長至即將抽薹(約21天)時接種黃萎病菌孢子懸 浮液，同時對照接種同量的水分。結果表明接種黃萎病菌8天后，擬南芥葉片開始出現黃 化，接種黃萎病菌24天后，轉GbSTK基因擬南芥、轉空載體pGN以及Columbia型擬南芥與各自接水的對照相比葉片均出現黃化現象，并且接種黃萎病菌后的擬南芥比接水后的對照 相比，都表現為植株矮小，生長勢弱等特點，結果如圖9所示。統計結果表明接種黃萎病菌 后轉GbSTK基因擬南芥較Columbia型擬南芥、轉空載體擬南芥抗性明顯提高，植株的黃化 葉片數少，植株生長壯，而各自接水的對照無明顯的差別。該結果可以初步說明GbSTK基因 對黃萎病具有一定的抗病性。同時對轉基因擬南芥接種黃萎病菌后黃化葉片數的統計結果分析可知，轉GbSTK 基因擬南芥比Columbia型擬南芥對照葉片黃化的時間晚，且黃化葉片數減少(圖10)，花期 推遲，頂端第一朵花的高度增加(圖11)等表型特征。該結果表明接種黃萎病后擬南芥植 株表型受到一定的影響，如植株生長矮小，提前開花等表型特征。接種黃萎病菌后轉GbSTK 基因擬南芥植株的高度明顯高于Columbia型擬南芥，也可表明GbSTK基因對黃萎病具有一 定的抗性。在對接種黃萎病菌后轉GbSTK基因擬南芥和Columbia型擬南芥的鮮重進行測量 分析后，結果顯示接種黃萎病菌后轉GbSTK基因擬南芥的重量明顯重于Columbia型，并且 轉GbSTK基因擬南芥生長較為強壯。以上分析結果說明GbSTK基因對黃萎病具有一定的抗 性(如圖12所示)。綜上所述，洋蔥表皮亞細胞定位結果初步證明GbSTK蛋白主要分布于細胞骨架 中。半定量RT-PCR結果顯示，在感病品種中基因的表達最強，次之是耐病品種，在抗病品種 中的表達最弱；接種黃萎病菌后基因的表達逐漸增強，至48小時表達量達到最高。這些研 究結果說明GbSTK基因參與了黃萎病抗性反應。以擬南芥為材料研究GbSTK所表達蛋白的 功能發現，接種強致病力黃萎病菌后，轉GbSTK基因擬南芥的黃萎病抗性明顯好于對照材 料即轉pGN空載體植株和Columbia型擬南芥，同時轉GbSTK基因株系表現出黃化葉片數減 少，花期推遲，頂端第一朵花的高度增加，生物體鮮重增加等表型特征。綜合上述分析結果， 表明GbSTK基因對黃萎病具有一定的抗性。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
棉花GbSTK基因編碼的蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 2所示的核苷酸序列。
4.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
5.含有權利要求2-4任一項所述基因的載體。
6.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
7.含有權利要求2-4任一項所述基因的轉化植物細胞。
8.權利要求2-4任一項所述的基因在植物抗黃萎病中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其中所述的植物為棉花。
10.如權利要求8所述的應用，其中所述的植物為擬南芥。
全文摘要
本發明涉及棉花GbSTK基因及其編碼蛋白，其以海島棉Pima90-53為材料，通過cDNA-AFLP技術篩選得到與抗黃萎病相關的差異片段，然后通過反轉錄鏈式聚合酶反應(RT-PCR)和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術擴增得到棉花黃萎病抗性基因，即絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(GbSTK)基因，通過對該基因及其編碼蛋白的功能研究，表明GbSTK基因具有一定的抗黃萎病的作用。
文檔編號C12N1/19GK101942426SQ20101027331
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者吳立強, 吳立柱, 周洪妹, 張桂寅, 李志坤, 李懿義, 王省芬, 馬峙英 申請人:河北農業大學