專利名稱：醇的微生物制備方法
技術領域：
本發明涉及通過微生物發酵制備醇的方法，尤其涉及通過含CO的基質的微生物 發酵制備醇的方法。本發明更具體涉及由其相應的酸制備醇的方法。
背景技術：
醇可應用于包括香料，醫藥和燃料工業在內的許多工業中。例如，乙醇和丁醇迅速 變成世界上的主要液體運輸燃料。各種醇的制備方法均為已知。工業醇生產以衍生自石化 工藝的合成為主。然而，微生物發酵還被應用于制備醇，例如生物燃料，變得越來越流行。用于運輸的生物燃料是有吸引力的汽油的替代品，其作為低濃度混合物迅速地滲 透市場。衍生自自然植物資源的生物燃料，比衍生自化石資源(如石油)的生物燃料更加 環境可持續發展，它們的使用使得釋放到大氣中的所謂的化石二氧化碳(C02)氣體由于燃 料燃燒而減少。另外，生物燃料可在許多地質中就地制得，并且可用于減少對于進口石化能 量資源的依賴。其中，作為生物燃料使用的醇包括乙醇，丁醇和2，3_ 丁二醇。乙醇正在迅速變成世界上主要的富氫運輸燃料。2005年世界上的乙醇消耗量估計 達到1.22百億加侖。由于歐洲，日本，美國和幾個發展中國家對乙醇的興趣的增長，未來燃 料乙醇工業的全球市場也已經預計會繼續急劇增長。例如，在美國，乙醇被用作制備E10，汽油中的10%的乙醇混合物。在E10混合物 中，乙醇組分作為氧化試劑，促進了燃燒的效率且降低了空氣污染物的產生。在巴西，乙醇 同時作為在汽油中混合的氧化試劑，或自身作為純燃料，滿足了大約30%的運輸燃料需求。 另外，在歐洲，關于溫室氣體(GHG)排放引起的環境問題，已經刺激歐盟在成員國中建立關 于可持續性運輸生物燃料燃燒的指令性目標。丁醇還可以用作內燃機的燃料。在幾個方面，相比于乙醇，它更類似于汽油。由于 對環境可持續燃料的生產和應用的興趣增長，對于生物方法制備丁醇(通常叫作生物_ 丁 醇)的興趣也隨之提高。丁醇可以用農作物如甜菜、玉米，小麥和甘蔗等的生物質的微生物 發酵制備。然而，這些碳水化合物原材料的成本受其作為人類食物或動物飼料的價值的影 響，并且在整個地理學上用于丁醇制備的淀粉或產蔗糖的作物并非經濟可持續的。因此，發 展技術以轉化低成本和/或更充足的碳資源成為燃料丁醇引起了人們的興趣。厭氧細菌，例如那些梭菌屬厭氧細菌，被證明可通過乙酸輔酶A(aCetyl CoA) 生物途徑由⑶，0)2和吐制備乙醇。例如，由氣體制備乙醇的梭狀桿菌(Clostridium 1 jungdahlii)的各種菌株記載于國際專利W000/68407,歐洲專利EP117309，美國專利 5，173，429，5，593，886，和 6，368，819，W098/00558 和 W0 02/08438 中。還已知產醇梭菌 (Clostridium autoethanogenum sp.)細菌可由氣體制備乙醇(Abrini et al，Archives of Microbiology 161，pp 345-351 (1994)(阿布里尼等人，微生物學文獻集，第161期， 345-351 頁(1994)))。然而，典型的通過氣體發酵的微生物制備乙醇的方法與乙酸鹽和/或乙酸的副生 產有關。由于可利用的一些碳被轉化為乙酸鹽/乙酸而不是乙醇，利用這種發酵方法制備乙醇的效率并非讓人滿意。除非乙酸鹽/乙酸副產品可以被用于其他用途，它將面臨一個 廢物處理的問題。乙酸鹽/乙酸通過微生物被轉化成甲烷，因此具備為溫室氣體(GHG)排 放作貢獻的潛力。其他廢物產品，例如丁酸/ 丁酸鹽也可以在通常使用的發酵方法中制備。更進一步地，典型地利用酵母或細菌的生物發酵工藝，會局限于制備一種或兩種 醇，其中，具體的微生物能夠由生長其的基質(例如碳水化合物或包含一氧化碳的氣體)制 備。如果希望得到不同的醇，將需要不同微生物發起。因此，發展技術以轉化低成本和/或 更充足的碳資源如有機酸成為所需產品如燃料乙醇引起了人們的興趣。酸微生物轉化成它們相應的醇的工藝已經在以前被描述過美國專利 4, 851, 344 ；White and Simon (白和西蒙)，Arch Microbiol (微生物學文獻集)(1"2)， 158 81-84 ；Huber et al (胡伯等人)，Arch Microbiol (微生物學文獻集)(1995) 164 110-118。然而，這些方法也有很多缺點。例如，它們需要利用化學介質，而這些介質許多是 有毒和/或昂貴的。另外，這些方法利用細胞提取物，或靜止的和在酸轉化為醇前在緩沖液 中需要旋轉減速和再懸浮的隔離細胞。這些工藝步驟是勞力密集的，增加了微生物暴露在 氧氣中，溶解或以其他方式被破壞的風險。本發明提供通過厭氧細菌發酵制備有價值醇的方法，該方法克服了現有技術方法 的一些缺點，或者至少為公眾提供了一個有用的選擇。

發明內容
在一主要方面，本發明提供一種將酸轉化成為其相應醇的方法，該方法利用代謝 活性細菌在含一氧化碳和/或氫氣的基質中生長。在具體實施方式
中，本方法包括a.在生物反應器中，在含CO的基質的存在下，培養一株或多株一氧化碳營養細 菌，以制備一種或多種酸和可選的一種或多種醇；和b.干擾該微生物培養物，致使至少一種酸轉化為至少一種醇。典型地，步驟a制備得到的至少一部分酸在步驟b中被轉化為醇。另外或選擇性 的，在步驟a和/或步驟b期間，另外的酸可以加入生物反應器，以轉化為至少一種醇。在某些實施方式中，干擾該微生物培養物的步驟包括以下一個或多個步驟 改變包含微生物培養物的液體培養基的pH值； 改變包含微生物培養物的液體培養基的0RP值； 添加一種或多種酸至生物反應器； 添加一種或多種還原試劑至生物反應器； 改變包含微生物培養物的液體培養基中的C0濃度； 改變生物反應器中的C0的分壓，其中含C0的基質是氣態的。在具體的實施方式中，所述改變C0濃度的步驟包括增加液體培養基中的C0濃度 至少lmmol。在另一主要方面，本發明提供一種制備醇的方法，該方法至少包含以下步驟(a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質存在下，培養一株或多株細菌；(b)當所述一株或多株細菌處于轉化階段時，在生物反應器中加入酸，以制備與所 述酸相對應的醇；和
其中，制得的醇并非所述一株或多株細菌在無所述酸存在下在所述基質中生長時 能夠制備的醇。在以上方面的具體實施方式
中，該方法在無介體(mediator)的存在下進行。在一種實施方式中，兩種或更多種的酸被加入生物反應器中，以制備兩種或更多 相應的醇。在某些實施方式中，所述一種或多種細菌為能夠利用乙醛氧化還原酶(A0R) 途徑將酸還原為相應醇的細菌。合適的細菌種類包括梭菌(genera Clostridia)，穆 爾氏菌(Moorella),真細菌(Eubacterium),醋酸桿菌(Acetobacterium)，丁 酸桿菌 (Butyribacterium)和脫硫桿菌(Desulfobacterium)屬。在具體實施方式
中，細菌為產醇 梭菌(Clostridium autoethanogenum)。典型地，酸為一元羧羧或二元羧酸。在具體實施方式
中，酸選自乙酸，丙酸，正丁 酸，正戊酸，正己酸，和苯甲酸。在具體的實施方式中，所述制備的醇選自乙醇、1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇、1-己醇 和芐醇。在另一主要方面，本發明提供一種制備丁醇的方法，該方法至少包含以下步驟(a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質存在下，培養一株或多株適應于制備非 丁醇的醇的細菌；(b)當所述一株或多株細菌處于制備非丁醇的醇的活性時，在生物反應器中加入 丁酸鹽，以制備丁醇。在另一主要方面，本發明提供一種制備丁醇的方法，該方法至少包含以下步驟(a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質存在下，培養一株或多株適應制備乙醇 的細菌；(b)當所述一株或多株細菌處于制備乙醇的活性時，在生物反應器中加入丁酸鹽， 以制備丁醇。在另一主要方面，本發明提供一種制備醇的方法，該方法包括至少包含以下步 驟(a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質存在下，培養產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)；(b)當所述產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)處于轉化階段時，在生物 反應器中加入酸，以制備與該酸相對應的醇；和其中制得的醇并非所述產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)在無所述酸存 在下在所述基質中生長時能夠制備的醇。在一優選主要方面，本發明提供一種制備丁醇的方法，該方法至少包含以下步 驟(a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質存在下，培養產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)；(b)當所述產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)處于轉化階段時，在生物 反應器中加入丁酸鹽，以制備丁醇。典型的，本發明的方法在無介體的存在下進行。
在具體實施方式
中，依照本發明的方法加入生物反應器中的酸通過含一氧化碳的 基質的微生物發酵制備。在某些實施方式中，細菌在酵母提取物和/或蛋白胨的存在下在液體培養基中進 行培養。在一種實施方式中，培養基為后面描述的LM23或LM33。在另一主要方面，本發明提供一種制備一種或多種醇的方法，該方法至少包含以 下幾個步驟(a)在第一生物反應器中，發酵基質以制備一種或多種酸；(b)在第二生物反應器中，在含一氧化碳的基質的存在下，培養一株或多株細菌；(c)當所述一株或多株細菌處于產溶劑階段時，將步驟(a)中的一種或多種酸引 入第二生物反應器中，以制備與所述一種或多種酸相對應的醇；和其中，制得的醇并非所述一株或多株細菌在無所述酸存在下在所述基質中生長時 能夠制備的醇。在具體實施方式
中，該方法在無介體的存在下進行。在某些實施方式中，第二生物反應器中所述的一株或多株細菌如前述定義所述。在本發明的另一方面，提供了一種在生物反應器中，在含CO的基質的存在下，由 酸的厭氧細菌的發酵制備醇的方法。在一種實施方式中，所述基質的CO濃度提供至促進酸轉化為醇。在一種實施方式中，所述CO的濃度在足夠的閾值濃度以上，致使酸轉化為醇被促 進。在該足夠的閾值濃度以上提供CO發酵，在促進酸轉化為醇的同時，降低或避免制造酸 和/或降低或避免微生物生長。在一種實施方式中，所述基質以發酵培養基的一氧化碳濃度至少約為2. 5mmol/L 來提供。在一種實施方式中，一氧化碳濃度至少約為2. 75mmol/L。在一種實施方式中，一氧 化碳濃度至少約為3mmol/L。在一種實施方式中，該濃度至少約為3. 5mmol/L。通過以上敘述，本領域技術人員可以理解的是，有許多方式可以增加發酵培養基 中的CO的可溶解性，包括但不限于溫度變化和/或加入增溶試劑例如油。在本發明的實踐 中，這種方法可以當在發酵培養基中必要或需要達到某具體的C0濃度時應用。在一種實施方式中，含C0的基質為氣態基質，并且溶解在發酵培養基中的C0的量 與發酵作用中的C0的分壓成正比。因此，實現在發酵培養基中足夠的閾值濃度可以通過增 加⑶的分壓實現。在一種實施方式中，提供一氣態基質，致使C0的分壓為至少約37psi。 在另一種實施方式中，C0的分壓至少約為47psi。依照本發明的方法，另外的酸可以提供于生物反應器，并且轉化為醇。在本發明的多種實施方式中，該方法包括俘獲和再回收一種或多種發酵制備的醇 的步驟。在本發明的另一方面，提供一種制備醇和/或酸的方法，該方法包括在生物反應 器中厭氧發酵第一基質，以制備一種或多種包括醇和/或酸產品；其中在一個理想的時間 點加入含C0的第二基質，致使與酸如乙酸相關的醇如乙醇的產量提高。在一種實施方式中，加入含C0的第二基質導致至少一部分酸被轉化為醇，假設最 終溶解的C0濃度為或高于發酵的足夠的閾值濃度。在一種實施方式中，第一基質還包括C0;然而，該方法不僅限于這樣的實施方式。例如，在一些實施方式中，所述第一基質可以包括一種或多種碳水化合物或丙酮酸鹽。適當 的碳水化合物可以包括但不限于纖維素，纖維素水解產物，淀粉，淀粉水解產物，葡萄糖，果 糖，木糖，阿拉伯糖，或乳糖。在一些實施方式中，碳水化合物為果糖或木糖。在其他實施方 式中，所述第一基質可以包含C02和/或H2或任何其他適合通過發酵產生酸和/或醇的成 分。在多種實施方式中，該方法包括俘獲和再回收一種或多種由發酵制備的醇的步驟。在本發明的另一方面，提供一種制備醇和/或酸的方法，該方法包括以下步驟(a)在含一種或多種微生物的培養物的生物反應器中以第一濃度加入含CO的基 質；(b)厭氧發酵生物反應器中的培養物，由所述基質制備一種或多種包括醇和/或 酸的產品，其中提供給生物反應器的基質的濃度可選地在一理想的時間點增加，致使與酸相 關的醇的產量增加。在多種實施方式中，增加基質的濃度使得至少一部分酸轉化為醇，和/或基質的 濃度可提高到足夠的閾值以上，其中至少一部分酸被轉化為醇。在多種實施方式中，該方法包括俘獲和再回收一種或多種由發酵制備的產品的步驟。在本發明的另一方面，提供了一種制備醇和/或酸的方法，該方法包括以下步驟(a)在含一種或多種微生物培養物的生物反應器中，以第一 CO分壓，提供含CO的 氣體基質；和(b)厭氧發酵生物反應器中的培養物，由所述基質制備一種或多種包括乙醇和/ 或乙酸的產品，其中所述CO分壓可選地在一理想的時間點增加，致使與乙酸相關的乙醇的產量 增加。在一種實施方式中，該方法包括監控微生物生長和/或一種或多種產品的濃度和 /或CO的濃度，其中在一個理想的產量和/或C0濃度，CO分壓可以增加。在一種實施方式 中，C0分壓可增加到27psi以上。在多種實施方式中，增加C0分壓導致至少一部分酸被轉化為醇，和/或C0分壓可 被增加到一個足夠的閾值以上，其中至少一部分酸被轉化為醇。在多種實施方式中，該方法包括俘獲和再回收由發酵制備的醇的步驟。根據本發明的另一方面，提供了一種調節微生物生長和/或酸生產的方法，該方 法包括以下步驟(a)在含一種或多種微生物培養物的生物反應器中，以第一 C0分壓，提供含C0的 氣體基質；和(b)厭氧發酵生物反應器中的培養物，由所述基質制備一種或多種包括乙醇和/ 或乙酸的產品，其中所述C0分壓可在一理想的時間點增加，致使微生物生長和/或酸生產降低或 基本被抑制。
在多種實施方式中，增加CO分壓導致至少一部分酸被轉化為醇，和/或CO分壓可 被增加到一個足夠的閾值以上，其中至少一部分酸被轉化為醇。在一種實施方式中，當CO分壓降低時，微生物生長和/或酸生產可被增加/促進 (或重啟)。在多種實施方式中，該方法包括俘獲和再回收一種或多種由發酵制備的醇的步
馬聚o在本發明的另一方面，提供了一種調節乙醇生產的方法，該方法包括以下步驟(a)在含一種或多種微生物培養物的生物反應器中，以第一 CO分壓，提供含CO的 氣體基質；和(b)厭氧發酵生物反應器中的培養物，由所述基質制備一種或多種包括乙醇和/ 或乙酸的產品，(c)增加C0分壓至一足夠的閾值以上，致使至少一部分酸轉化為乙醇；和(d)可選地接著降低C0分壓至該閾值以下，致使微生物生長和酸生產被促進。在多種實施方式中，醇和酸的生產和/或微生物的生長在發酵過程中被監控，和/ 或步驟(c)和(d)重復至少一次。本發明的實施方式發現了在含C0的氣體基質的存在下酸發酵的具體應用。基質 包含作為工業方法的副產品獲得的氣體。在某些實施方式中，工業方法選自由黑色金屬產 品生產，有色金屬產品生產，石油煉制方法，生物質的氣化，煤氣化，電工生產，碳黑生產，氨 氣生產，甲醇生產和焦炭生產組成的組中的方法。在本發明的一種實施方式中，氣體基質是 合成氣。在一種實施方式中，氣體基質包含獲得自鋼廠的氣體。含C0的基質典型地包含一大部分的C0，例如至少約20%至約100%體積的C0， 40%至95%體積的C0，40%至60%體積的⑶，和45%至55%體積的C0。在具體實施方式
中，基質包含約25%，或約30%，或約35%，或約40%，或約45%，或約50%，或約55%，或 約60%體積的C0。具備低濃度C0的基質，如6%，可能也合適，尤其是當H2和C02也存在 時。在多種實施方式中，發酵利用一株或多株一氧化碳營養細菌的培養物實現。在多 種實施方式中，所述一氧化碳營養細菌選自梭菌(Clostridium)，穆爾氏菌(Moorella)，醋 菌(Oxobacter),消化鏈球菌(P印tostr印tococcus),醋酸桿菌(Acetobacterium),真細菌 (Eubacterium)或丁酸桿菌(Butyribaceterium)。在一種實施方式中，一氧化碳營養細菌 為產酉享梭菌(Clostridium autoethanogenum)。本發明的方法可用于制備任何種類的醇，包括但不限于乙醇和/或丁醇，通過在 基質，尤其是含一氧化碳的氣體基質的存在下酸的厭氧發酵。本發明的方法還可以用于需 氧發酵，其他產品的需氧或厭氧發酵，包括但不限于異丙醇，和除含碳氣體的基質的發酵。本發明還可以包括本申請的說明書中提到和表明的部分，要素和特征，以及個別 的或共同的，所述兩個或更多部分，要素或特征的任意或全部組合。在本文提到含有本發明 涉及的技術領域公知的等同物的特定的整體時，這些已知的等同物被視為并入本文中如同 單個陳述一樣。


本發明的這些和其他方面，考慮到所有新的方面，通過下面的僅以實施例方式給 出的描述將明確，其中相關的附圖如下圖1 借助血清瓶中的產醇梭菌(C. autoethanogenum)使丁酸鹽轉化為丁醇。起始 條件產醇梭菌(C. autoethanogenum)的活性培養物，制備乙酸鹽(4. 7g/l)和乙醇(1. 2g/ l)pH 5. 5，頂部空間:25psig過壓的95% CO于C02中。結束條件pH 6. 35，乙酸鹽(4. 7g/ 1)，乙醇(3. 2g/l)，頂部空間14psig過壓。圖2 在一批產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)培養物中加入甲酸鹽制 備乙酸鹽和最小量的乙醇的影響。甲酸鹽溶液在t = 0和t = 30min(大約)以及接著在 t = 60min (大約)時加入。圖3 在連續的產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)培養物中加入乙酸鹽 制備約6g/L/天乙醇和lg/L/天乙酸鹽的影響。乙酸鹽(15g/L/天)在52天繼續加入。圖4 含產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的微生物培養物改變pH制備 乙酸鹽和乙醇的影響。約2小時激發細胞循環，然后在大約t =第3天調節pH至5. 9。隨 著PH的改變，乙酸鹽被消耗，制得增加量的乙醇。圖5 根據本發明的具體實施方式
的體系，包括生長生物反應器和轉化生物反應器。圖6 根據本發明的具體實施方式
的體系，包括多級生長生物反應器和轉化生物 反應器。
具體實施例方式以下為本發明的說明，包括以普通術語給出的多種實施方式。本發明通過下文給 出的標題為“實施例”的內容進行了進一步示例，實施例部分提供了實驗數據，本發明的多 方面的具體的示例，實施本發明的例證性方式以支持本發明。包括酸和醇的產品可以由含C0的基質通過微生物培養物制備。依照本發明的方 法，微生物培養物的干擾出人意料地導致了酸的消耗，以及隨之而來的微生物培養物引起 的醇的生產。被認為這個結果可能是由于在發酵液體培養基(broth)中存在的至少一部分 酸被直接或間接還原為醇，尤其是乙醇。這可以被看作是發酵反應的“轉化階段”。根據本 發明的方法，發酵反應可以從生產(或生長)階段(此時微生物生長被促進，醇和/或酸被 制備)，變為干擾微生物培養物的轉化階段。得到認可的是，至少一部分微生物培養物可處于生產階段，而至少一部分處于轉 化階段。然而，在干擾下，處于生產階段的至少一部分微生物培養物變為轉化階段，致使與 酸相關的醇的生產增加。在一種具體實施方式
中，具有酸的總凈消耗量和醇生產量。依照本發明的一種實施方式，當由含C0的基質制備例如乙酸和可選的乙醇的產 品的微生物培養物被干擾，由該微生物發酵制備得到乙醇。干擾之后，至少一部分C0會轉 化為酸和/或醇，但大部分乙醇是通過乙酸/乙酸鹽(‘轉化’)的微生物還原制得的。有許多利用含C0的基質的發酵反應制備醇和/或酸的例子，其中酸和醇同時制 得。然而，在這些例子中，產品比例大致傾向于酸(例如乙酸/乙酸鹽)高于醇(乙醇)。 在本發明的另一實施方式中，具體的發酵條件可以傾向于醇的生產高于酸的生產。在這種 條件下，加入發酵器中的另外的酸可以通過微生物培養物轉化為相應的醇。例如，如丁酸的酸可以加入發酵反應并且轉化為如丁酸鹽的醇。依照本發明的方法，令人吃驚的是，使用例如甲基紫精等介體輔助酸至醇的轉化 并非必要。實際上，可以確定的是甲基紫精對通過產醇梭菌(C. autoethanogenum)的丁醇 生產具有負面影響。這與那些酸需要介體通過微生物轉化成為它們相應的醇的報道相反。同時為了不被劃分為任意特定的理論，可以認為依照本發明通過Clostridium autoethanogenum由酸至醇的轉化通過涉及醛氧化還原酶(A0R)的生物化學途徑發生。 A0R為一個獨特的含鎢酶，其能夠還原非活性羧基酸為醛。該醛可通過醛脫氫酶被進一步 還原為醇。A0R代表產溶劑(solventogenesis)途徑的一個重要的分支。該鎢輔助因子顯 示出對于酶活性是決定性的。這些酶可以在發酵微生物如梭菌(Clostridium)，脫硫桿菌 (Desulfitobacterium)，和熱球菌(Pyrococcus)中發現。最具特色的A0R屬于激烈熱球 菌(Pyrococcus furiosus)，其基因組包含五個中四個被表征的序列。第一個激烈熱球菌 (P. furiosus) A0R具有寬的基質范圍，但優選來源于氨基酸的醛。它的晶體結構反映了鉬 喋呤系鎢結合點的存在。第二 A0R，甘油醛-3-磷酸鐵氧蛋白氧化還原酶(GF0R)，僅使用甘 油醛-3-磷酸，以及第三A0R，甲醛鐵氧蛋白氧化還原酶(FOR)，優選一種至三種碳醛。第四 A0R，W0R5具有寬的基質范圍。A0R也由甲酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)和 熱乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)純化。產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)包含兩個公認的A0R基因，其與激烈 熱球菌(P. furiosus) A0R具有約56%的同源性，與肉毒梭菌(Clostridium botulinum)具 有80%的同源性。A0R基因標記了一個與產醇梭菌(C. autoethanogenum)最靠近排列的親 屬，克氏梭菌(Clostridium kluyveri)重要的區別，克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的 基因序列不包含A0R基因和通過乙酰輔酶A(acetyl-CoA)生產醇。可以想到，獲得的結果 用于由其相應的酸制備任何醇，該制備利用產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或 任何其他能夠利用A0R途徑的細菌實現。因此，在最主要的方面，本發明提供了利用微生物培養物將酸轉化為其相應醇的 方法。在具體的實施方式中，微生物培養物在含C0和/或吐的基質的存在下將酸轉化為定義除非另外定義，整個說明書中的以下術語定義如下本文所用的術語“轉化階段”指細菌發酵一種或多種酸以制備一種或多種醇的一 段時間。典型地，至少一部分細菌群落將處于這樣的階段。然而，沒有必要使所有的細菌群 落活性制備醇。所述轉化階段的特征在于在發酵液體培養基中存在一定水平的乙醇。本文所用的術語“進行干擾”，“干擾”以及類似詞，用于與微生物培養物相關的地 方，表示包括任何直接或間接影響微生物培養物的改變。對微生物培養物所作的改變包括 改變發酵操作條件如PH，CO濃度，0RP或改變含培養物的液體培養基的成分。本文所用的術語“微生物培養物”和類似詞，包括至少一種在適于促進生長和/或 代謝物生產的營養培養基中和/或在該培養基上載持的微生物。在這里提到的，通過本發明的方法“制得的醇”并非在無相應的酸的存在下當生長 在基質上時所述一株或多株細菌能夠制得的醇。然而，應當理解的是，該方法可以制備額外 的產品；例如，所述細菌由在其上進行培養的基質發酵得到的酸或醇。本方法的“制得的醇”所指的是“初級醇”或“初級產品”以及任何如“副產品”的額外的產品。“初級”的使用不 應被看作是指相對于副產品的產品的具體級別。本文所用的“氧化還原介體”以及類似詞，是指電子穿梭物質，其作為給電子體和/ 或電子受體發揮作用。介體包括紫精染料(例如甲基紫精)，蒽醌和其他醌類染料，三苯甲 烷染料，酞菁染料，次甲基染料，吡咯染料，卟啉染料，蝶啶，喋啶酮(pteridones)，黃素和副 族VI，VII和VIH的金屬復合物。根據本發明，當提到加入一種“酸”至培養物或微生物反應器時，術語“酸”，“酸類” 以及類似詞的使用，應當寬泛理解，即包括任何一元羧酸和二元羧酸。另外關于“酸”的加 入應當包括相關的等同的鹽或鹽和酸的混合物。類似地關于這里的具體的酸應當考慮為包 括相關的等同的鹽(例如丁酸和丁酸鹽)，反之亦然。在發酵液體培養基中，酸和羧酸鹽的 分子比例依賴于體系的PH值。示例性的酸包括乙酸，丙酸，正丁酸，正戊酸，正己酸，和苯甲 酸。術語“生物反應器”包括由一個或多個容器和/或塔或管道裝置組成的發酵設備， 該設備包括連續攪拌槽反應器(CSTR)，固定化細胞反應器(ICR)，滴流床反應器(TBR)，泡 罩塔，氣升發酵槽，膜反應器例如中空纖維膜生物反應器(HFMBR)，靜止混合器，或其他容器 或其他適于氣液接觸的設備。正如下面將進一步描述的，在一些實施方式中，生物反應器可包括第一生長反應 器和第二發酵反應器。由此，應當理解的是，當提到添加一種或多種碳水化合物至生物反應 器或發酵反應中時，需要時可以包括添加至這些反應器中的一個或兩個。術語“含一氧化碳的基質”包括任何可引入生物反應器進行發酵作用的含CO的固 態，液態或氣態材料。“含一氧化碳的氣態基質”包括任何含一氧化碳的氣體。氣態基質典 型地包含一實質部分C0，例如至少約15%至約95%體積的CO。術語“溶解的CO濃度”包括在發酵液體培養基/介質中存在的CO的以體積為基
準的量。術語“C0分壓”及其類似詞包括在含C0和可選的其它氣體的氣態基質中由C0施 加的相對壓力。短語“閾值濃度”，“足夠閾值濃度”以及類似詞，可以量化確定但在不同的發酵條 件下會變化，例如用不同微生物中應用的；該術語包括微生物從實質上由基質制備乙醇和 /或酸，變為在一延長的時期內制備醇和消耗酸的濃度或濃度范圍。除非上下文需要，否則本文所用的短語“發酵”，“發酵方法”或“發酵反應”以及 類似詞，包含涉及利用微生物的產品生長和/或生物合成的生長階段以及產品生物合成階 段。依照本發明的方法，包括酸和醇的產品由含C0的基質例如含C0的氣態基質利用 微生物發酵制備。在本發明的具體實施方式
中，制備如酸和可選的醇的產品的活性生長微 生物培養物，可以被干擾，致使至少一部分微生物培養物消耗一種或多種酸和制備一種或 多種相應的醇。該結果可能是由于存在于發酵液體培養基中的至少一部分酸直接或間接還 原為醇，尤其是乙醇。這可以稱為發酵反應的“轉化階段”。依照本發明的具體實施方式
，發 酵反應可以由促進微生物生長以及生產醇和/或酸時的實質上生產階段，變為在發酵反應 中增加C0濃度的轉化階段。
在本發明的另一些實施方式中，至少一部分活性生長培養物可以制備醇，并且所 述干擾包括添加一種或多種酸至培養物中，致使至少一部分一種或多種酸轉化為一種或多 種醇。一般，本發明的方法包含至少(a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質的存在下，培養一株或多株細菌，以制 備一種或多種酸和可選的一種或多種醇，和(b)干擾該培養的微生物，致使至少一種酸轉化成至少一種醇。在具體實施方式
中，步驟(a)中通過所述細菌制備的至少一部分酸，轉化為步驟 (b)中的相應的醇。然而，在具體實施方式
中，另外的酸可以被加入所述生物反應器，致使該 至少一部分加入的酸轉化為步驟(b)中的醇。在這些實施方式中，制得的醇可以不是所述 一株或多株細菌在無所述酸存在下在所述基質中生長時能夠制備的醇。該方法優選在無介 體的存在下進行。一種具體實施方式
中，本方法至少包含以下步驟a)在生物反應器中，在含一氧化碳的基質的存在下，培養一株或多株細菌，其中所 述細菌制備醇；和b)當至少一部分培養物處于制備醇的轉化階段時，向所述培養的細菌中加入酸。有許多應用含CO的基質制備醇和/或酸的發酵反應的實施例，其中同時制備醇 和酸。然而，在這些實施例中，產品比率一般有利于酸(例如乙酸/乙酸鹽)大于醇(乙 醇)。將微生物培養物由生產階段變為轉化階段的適當的干擾包括但不限于改變發酵 培養基的PH值和/或0RP值；改變發酵液體培養基中的CO濃度(本領域技術人員應當理 解的是，依靠發酵方法實現這點有多種方法，包括改變氣體成分，改變氣體壓力，改變氣體 流動速度，改變在CSTR中的攪拌速度)；加入還原試劑；加入一種或多種酸。因此，在本發明的具體實施方式
中，干擾該微生物培養物包括以下一個或多個步 驟 改變包含微生物培養物的液體培養基的pH值； 改變包含微生物培養物的液體培養基的0RP值； 添加一種或多種酸至生物反應器； 添加一種或多種還原試劑至生物反應器； 改變包含微生物培養物的液體培養基中的CO濃度； 改變生物反應器的CO的分壓，其中含CO的基質是氣態的。雖然以下說明集中在本發明的具體實施方式
中，應當理解的是，本發明被應用于 由其相應的酸制備可選的醇。示例性的醇包括乙醇，1"丙醇，1" 丁醇，1"戊醇，1"己醇，和 苯甲醇。示例性的相應的酸分別包括乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸和苯甲酸。依照本 發明，示例性的可制得的進一步的醇包括，那些用于香料，醫藥和燃料工業的醇。另外，該方法可以利用除產醇梭菌(C. autoethanogenum)外的細菌進行；例 如可以使用梭菌(Clostridia)，穆爾氏菌(Moorella)，真細菌(Eubacterium)，醋酸桿 菌(Acetobacteria), 丁酸桿菌(Butyribacterium)禾口 脫硫桿菌(Desulfobacterium) 屬的菌種。更具體的，可以用梭狀桿菌(Clostridium ljungdahlii)，醋酸梭菌(Clostridium aceticum),甲酸醋酸梭菌(Clostridium formicaceticum),熱乙酸禾裹爾 氏菌(Moorella thermoacetica)，熱自養禾裹爾氏菌(Moorella thermoautotrophica)， 粘液真桿菌(Eubacterium limosum)，伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium Woodi)，食甲基 丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum),禾口 自養脫硫桿菌(Desulfobacterium autotrophicum)。本發明的某些實施方式適于利用又一種或多種工業方法制的氣流。這些方法包括 制鋼方法，尤其是制備含高含量CO或高于預先給定值的CO含量(例如5%)的氣流的方 法。根據這些實施方式，一氧化碳營養細菌優選用來在一個或多個生物反應器中制備酸和/ 或醇，尤其是乙醇或丁醇。基于即時的公開，本領域技術人員應當意識到，本發明可以應用 于多種工業或廢氣流，包括具有內燃機的交通工具。并且基于即時的公開，本領域技術人員 還應當意識到，本發明還可以用于包括使用相同或不同微生物的那些方案在內的其它發酵 反應。因此，可以預期，本發明的范圍不應當局限于具體的實施方式和/或描述的應用，相 反應當理解為一個較寬的范圍；例如，除了其中的至少一個組分對發酵反應供料有用外，氣 流的來源不是有限的。本發明特別應用于改善全部的碳俘獲，和/或由氣態基質(例如汽 車尾氣和高體積含CO工業燃料氣體)制備乙醇和其他醇方面。發酵由氣態基質制備乙醇和其他醇的方法是已知的。示例性的方法包括國際專利 W02007/117157、W02008/115080，美國專利 US6, 340，581、US6, 136，577、US 5，593，886、US 5，807，722和US5，821，111中描述的，它們中的每個均引入到本文中作為參考。已知許多厭氧細菌能夠實現C0的發酵為醇和酸的作用和適用于本發明的方 法，所述醇包括正丁醇和乙醇，所述酸如乙酸。這樣的適用于本發明的細菌的例子包括， 梭菌(Clostridium)屬的那些細菌，例如梭狀桿菌(Clostridium ljungdahlii)菌株， 包括國際專利W0 00/68407，歐洲專利EP117309，美國專利申請5，173，429，5，593，886， 和6，368，819，國際專利W098/00558和W0 02/08438所描述的菌株，梭菌Clostridium carboxydivorans) (Liou et al. ( >ClJ 等入)，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (國際微生物分類進化學雜志)33 :pp2085-2091)， 梭菌 Clostridium ragsdalei (國際專利 W0/2008/028055)和產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (Abrini et al (阿布里尼等人)，Archives of Microbiology (微生物 學文獻集)161:pp 345-351)。其他合適的細菌包括穆爾氏菌(Moorella)屬的那些細菌， 包括Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et. al.，Biotechnology Letters (生物技術通訊)29 ppl607-1612)菌，以及氧化碳嗜熱(Carboxydothermus)屬的那些細菌(Svetlichny，V. A.， Sokolova, T.G.et al(1991), Systematic and Applied Microbiology(微生物工程與應 用)14 :254_260)。進一步的例子包括熱乙酸穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)，熱自 養禾裹爾氏菌(Moorella thermoautotrophica)，產生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)， jiKSlSlff (Acetobacterium woodii) ，_占1貞木干胃(Eubacterium limosum)，申― 丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)，普氏醋菌(Oxobacter pfennigii), 巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)，噬乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans)，庫氏脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum kuznetsovii) (Simpa et. al.(西姆帕 等人)，Critical Reviews in Biotechnology (生物技術評論)，2006 Vol. 26. pp 41-65)。另外，本領域技術人員應當理解的是，其他一氧化碳營養厭氧細菌也可以應用于本發明。還 應當理解的是，本發明可以適用于兩種或多種細菌的混合培養物。一種示例性適于本發明應用的微生物為產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)，在一禾中實IS方式中，產酉享 菌(Clostridium autoethanogenum)是 一種具有在德國資源中心儲藏的生物材料(DZMZ)儲藏編號為19630的菌株的特定特 征的 Clostridium autoethanogenum。在另一實施方式中，產醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)是具有DSMZ儲藏編號為DSMZ10061的特定特征的Clostridium autoethanogenum。在本發明的方法中細菌的培養可以用任何本領域已知的方法培養和使用厭氧 細菌發酵基質來進行。示例性的技術在下面的“實施例”部分舉出。通過進一步的實施 例的方式，在下文中概括描述的使用氣態基質發酵的方法可以使用(i)K.T.KlaSSOn，et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources (合成氣體發 酵資源用生物反應器).Conservation and Recycling (轉化和循環)，5 ； 145-165 ； (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations (用 于合成其它發酵的生物反應器設計).Fuel (燃料).70. 605-614 ； (iii)K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels (合 成氣體向液體或氣體燃料的生物轉化).Enzyme and Microbial Technology(酶和微 生物技術) 14;602_608 ;(iv)J.L Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation (氣體基質發酵的石if究)Carbon Monoxide Conversion to Acetate ( 一氧 化碳轉化成乙酸鹽的方法).2. Continuous Culture (連續培養).Biotech. Bioeng (生物 技術與工程).34. 6. 785-793 ;(v)J. L Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations (氣體基質發酵的石if究)Carbon monoxide conversion to acetate ( 一 氧化碳轉化為乙酸鹽的方法).1. Batch culture (間歇式培養).Biotechnology and Bioengineering (生物技術與工程) 34. 6. 774-784 ； (vi) J. L. Vega, et al. (1990) Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations
應器設計) Resources，Conservation and Recycling (資源，減量化，再循環) 3. 149-160 ； 所有這些內容并入到本文中作為參考。發酵可在任何適當的生物反應器中進行，例如連續攪拌槽反應器(CSTR)，固定 細胞反應器，氣升反應器，泡罩塔反應器(BCR)，膜反應器，例如中空纖維膜生物反應器 (HFMBR)或滴流床反應器(TBR)。另外，在本發明的一些實施方式中，生物反應器包含第一 生長反應器，其中微生物被培養，以及第二發酵反應器，在其中來自生長反應器的發酵液體 培養基被供給，且制備大部分的發酵產品(例如乙醇和乙酸鹽)。在一些實施方式中，當基質是氣態時，可在升高的壓力下進行制備和/或轉化 階段；可至少為幾個大氣壓。這樣的體系將使用可適應能夠承受提高的壓力的生物反 應器。許多種類的生物反應器可適應于承受高壓；這樣的生物反應器的例子是Buchi AUT0KLAV (Buchi高壓釜)反應器。在本發明的一些實施方式中，生物反應器可包含第一，生長反應器，在其中微生物 被培養以及制備可選的酸，以及第二，發酵反應器，在其中來自生長反應器的液體營養基被 供給，且如果不是大部分，則附加制得了醇發酵產品(例如乙醇)。如上面提到的，額定壓力發酵生物反應器可被應用。根據本發明的多種實施方式，發酵反應的碳源為氣態的含CO基質。該基質可為獲 得自工業方法的副產品的含CO的廢氣，或來自其他如汽車尾氣的來源。在某些實施方式 中，所述工業方法選自由黑色金屬產品生產例如鋼廠，有色金屬產品生產，石油煉制方法， 煤氣化，電工生產，碳黑生產，氨氣生產，甲醇生產和焦炭生產組成的組中的方法。在這些實 施方式中，含CO的基質可在其排放至大氣之前利用任何方便的方法由工業方法獲得。取決 于含CO的基質的組成，也可優選對它去除任何不需要的雜質，例如在引入發酵之前去除灰 塵顆粒。例如，利用已知方法過濾或凈化所述氣態基質。可選的，含CO的基質可來自生物質的氣化。所述氣化方法包括限量供給空氣或氧 氣的條件下生物質的部分燃燒。得到的氣體典型地包括大部分的CO和H2，小部分體積的 co2，甲燒，乙烯和乙烷。例如，獲得自如甘蔗的糖，或玉米或谷物的淀粉的食品材料，或產生 自森林產業的非食品生物質的提取和處理過程中得到的生物質副產品，可被氣化以制備含 CO的適于本發明的氣體。含C0的基質典型地包含一大部分的C0，例如至少約20%至約100%體積的C0， 40%至95%體積的C0，40%至60%體積的⑶，和45%至55%體積的C0。在具體實施方式
中，基質包含約25%，或約30%，或約35%，或約40%，或約45%，或約50%，或約55%，或 約60%體積的C0。具備低濃度C0的基質，如6%，可能也合適，尤其是當H2和C02也存在 時。雖然沒有必要使基質中包含任何的氫氣，根據本發明的方法，氫氣的存在對產品 的形成不應當是有害的。在具體的實施方式中，氫氣的存在致使醇的制取效率得到全面的 提高。例如，在具體的實施方式中，基質可包含大約2 1，或1 1，或1 2比例的H2 C0。 在另一些實施方式中，基質氣流包含低濃度的H2，例如少于5%，或小于4%，或小于3%，或 小于2%，或小于1%，或基本不含氫氣。所述基質也可包含一些C02，例如約至約80% 的體積，或1 %至約30 %體積的C02。典型地，一氧化碳以氣態加入發酵反應。然而，本發明的方法不局限于以這種狀態 加入基質。例如一氧化碳可以液態提供。例如這樣的液體，即，含有一氧化碳的氣體飽和， 將該液體加入生物反應器。這可利用標準操作學實現。通過實施例的方法，微泡分布發生 器(Hensirisak et. al. ,Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation(用于需氧發酵的微泡分布發生器的按比例增大)；Applied Biochemistry and Biotechnology (應用生物化學和生物技術)，Volume 101, Number 3/0ctober, 2002) 可為該目的而使用。在本發明的一種實施方式中，產品通過第一基質和第二基質的發酵制備。在本發 明的一個具體的實施方式中，醇和/或酸將在第一基質例如丙酮酸鹽或碳水化合物例如果 糖或木糖，以及第二基質例如含C0的基質被提供時來制備。當發酵被干擾時，至少一部分 酸(乙酸/乙酸鹽)被轉化為醇(乙醇)。考慮到目前的公開，應當理解的是現有技術中還 有許多碳水化合物適于發酵的例子，并且還有多種方法可以適用于發酵應用于本發明的碳 水化合物基質。通過實施例，適合的基質可包括，但不限于，單糖例如葡萄糖和果糖，低聚糖 如蔗糖或乳糖，多糖如纖維素或淀粉。雖然所有這些碳水化合物基質(及其混合物)適用 于本發明的多種實施方式，更常使用的碳水化合物基質包括葡糖糖，果糖，木糖和蔗糖(及其混合物)。本領域技術人員基于該公開應當理解的是，適用于本發明的方法的可發酵的糖可 通過例如美國專利申請
發明者B·艾爾-辛那維, C·科利特, G·陳, J·M·Y·馮, K·M·馬哈爾, M·J·羅, P·L·陳, R·L·S·福斯特, S·D·辛普森 申請人:藍瑟科技紐西蘭有限公司