專利名稱：一種食甲醇芽孢桿菌及其生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地涉及一種食甲醇芽孢桿菌及其生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法。
背景技術(shù)：
香蘭素(Vanillin)，又名香草醛、香蘭醛等，是香莢蘭豆中的主要成分，化學(xué)名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，相對(duì)分子量為152. 15。香蘭素外觀為白色至微黃色針狀結(jié)晶或粉末，呈香莢蘭豆特有的香氣，微甜，在潮濕的空氣中緩慢氧化為香蘭酸。
香蘭素是世界上產(chǎn)量最大、用途最廣的香料之一，被譽(yù)為“香料之王”，廣泛應(yīng)用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香煙、飲料和高檔化妝品中。它不僅可以用作增香劑和定香劑，還在食品中用作防腐劑、保鮮劑和抗氧化劑。香蘭素的世界年消費(fèi)量約I. 2萬(wàn)噸，而天然香蘭素的產(chǎn)量?jī)H為1800噸，因此遠(yuǎn)不能滿足需求。目前常用的香蘭素生產(chǎn)方法有植物原料提取法和化學(xué)合成法。香蘭素在香莢蘭豆中含量約為15_20g/kg。香莢蘭種植受地域和氣候環(huán)境的限制產(chǎn)量極少，且在種植過(guò)程中需要對(duì)花朵進(jìn)行人工授粉、勞動(dòng)強(qiáng)度大，難以進(jìn)行大規(guī)模栽種，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求。目前市場(chǎng)上絕大多數(shù)的香蘭素產(chǎn)品是通過(guò)化學(xué)合成的，常用合成底物包括丁香酚、木質(zhì)素、乙醛酸和愈創(chuàng)木酚等。國(guó)內(nèi)常用的是采用愈創(chuàng)木酚和烏洛托品反應(yīng)的亞硝化工藝，該方法路長(zhǎng)，分離過(guò)程復(fù)雜，收率低，環(huán)境污染嚴(yán)重，原料消耗高，國(guó)外早已被淘汰。國(guó)外主要采用愈創(chuàng)木酚和乙醛酸縮合工藝，該工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，產(chǎn)物純度高，原料來(lái)源廣泛，但是存在嚴(yán)重的缺陷，比如環(huán)境污染嚴(yán)重，產(chǎn)品香氣單一，易摻雜質(zhì)，合成香蘭素的安全性也受到質(zhì)疑。香蘭素的生物合成方法主要有微生物發(fā)酵、酶工程、細(xì)胞工程等，與化學(xué)合成相t匕，生物法合成香蘭素具有反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，提取步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)清潔，環(huán)境污染低，產(chǎn)品安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。但是綜合考慮技術(shù)可行性、經(jīng)濟(jì)性、安全性等因素，微生物發(fā)酵法被認(rèn)為是目前最實(shí)際的天然香蘭素制取方法。許多天然物質(zhì)如阿魏酸、1，2_二苯乙烯酚、丁香酚、木質(zhì)素、異丁香酚等都可以作為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的前體物質(zhì)。關(guān)于用多種微生物發(fā)酵法將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素已有報(bào)道。如1996年Rabenhorst 報(bào)道 Streptomyces setonii ATCC39116 和 1998 年 A. Muheim 報(bào)道的Amycolatopsis sp. HR167,香蘭素濃度分別達(dá)到12g/L和11. 5g/L,且培養(yǎng)基成分較為復(fù)雜,生產(chǎn)成本較高,副產(chǎn)物較多包括香蘭酸、香蘭醇和愈創(chuàng)木酚等,給產(chǎn)品分離提取帶來(lái)了相當(dāng)?shù)睦щy。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillus methylotrophicusVJ4-1，于2012年I月16日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC M2012004，其生物學(xué)特征是是革蘭氏陽(yáng)性菌，能在10% NaCl中生長(zhǎng)，有精氨酸雙水解酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性，能產(chǎn)酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水楊素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸鹽、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸組氨酸、檸檬酸鹽為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其16S rRNA序列與Bacillusmethylotrophicus的16S rRNA序列比對(duì)相似性達(dá)到100*%。本發(fā)明利用食甲醇芽孢桿菌在是生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法，其方法涉及的步驟如下(I)斜面培養(yǎng)將食甲醇芽抱桿菌 Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC M2012004接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25 35°C、pH5 9條件下，靜置培養(yǎng)24 72小時(shí)后,置于冰箱中；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(I)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 35°C條件下，100 150rpm振蕩培養(yǎng)24h 72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 4次，制得種子培養(yǎng)液； (3)發(fā)酵使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)基，按體積百分比2 20%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 40°C條件下，100 200rpm振蕩培養(yǎng)24 72h ；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的發(fā)酵液，加入5 13. 3g/L的阿魏酸，在30 40°C條件下，100 200rpm避光振蕩培養(yǎng)6 12天后停止。進(jìn)一步，所述斜面培養(yǎng)基馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L ;種子液培養(yǎng)基組成為麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。再進(jìn)一步，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為碳源谷殼5 20g/L，氮源豆柏I 3g/L，氯化鈉0. 5 I. 5g/L，七水硫酸亞鐵0. 01 0. 05g/L,磷酸氫二鉀0. 5 I. 0g/L、七水硫酸鎂0.5 1.0g/L，調(diào)節(jié) pH 至 6 10。再進(jìn)一步，所述碳源為淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼任選其一，所述碳源優(yōu)選谷殼。(I)不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)天然香蘭素的產(chǎn)量以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，固定氮源和無(wú)機(jī)鹽，分別以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼作為碳源，濃度均為20g/L。由圖I可知，不同碳源與麩皮比較發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素的產(chǎn)量，由高到低依次是谷殼、麩皮、鹿糖、淀粉、麥芽浸粉、麥芽糖、葡萄糖和果糖。緩效碳源比速效碳源更易于香蘭素的產(chǎn)生，緩效碳源中的谷殼由于其中含有生長(zhǎng)因子而比單一碳源更易于香蘭素的產(chǎn)生。再進(jìn)一步，所述氮源為酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動(dòng)物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆柏任選其一，所述氮源優(yōu)選谷殼。(2)不同氮源發(fā)酵生產(chǎn)天然香蘭素的產(chǎn)量以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源和無(wú)機(jī)鹽不變，分別以酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動(dòng)物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆柏作為氮源，濃度均為lg/L。由圖2可知，不同氮源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響有高到低依次是豆柏、黃豆餅粉、牛肉膏、蛋白胨(Arg)、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨。由圖2可看出無(wú)機(jī)氮源不利于香蘭素的產(chǎn)生，有機(jī)氮源更利于香蘭素的產(chǎn)生。以豆柏作為氮源比其他氮源產(chǎn)生的香蘭素更多。再進(jìn)一步，所述pH優(yōu)選為10。(3)不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值下天然香蘭素產(chǎn)量使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基碳、氮、無(wú)機(jī)鹽組成，配制成pH值為3. 0至11. 0九種培養(yǎng)基，篩選出產(chǎn)香蘭素濃度最高的發(fā)酵培養(yǎng)基pH值。由圖3可以看出，pH值3. 0,4. 0,11. 0時(shí)，由于強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性影響，香蘭素產(chǎn)量較低；在堿性條件下，PH值在8. 0至10. 0之間都具有相對(duì)較高的產(chǎn)量，說(shuō)明該菌在堿性條件下更適合阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素。其中在PH值為10. 0
時(shí)香蘭素的產(chǎn)量最高。 再進(jìn)一步，所述發(fā)酵溫度優(yōu)選為40°C。(4)不同發(fā)酵溫度下天然香蘭素的產(chǎn)量使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，pH調(diào)至10. 0，選擇溫度為30°C至40°C之間進(jìn)行優(yōu)化。由圖4可以看出，當(dāng)溫度在30°C至40°C之間時(shí)，香蘭素的產(chǎn)量逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵溫度為40°C時(shí)香蘭素的產(chǎn)量最高，此溫度下適宜菌體酶活與菌種生長(zhǎng)。再進(jìn)一步，發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)選為lOOrpm。(5)不同發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速下生產(chǎn)天然香蘭素的產(chǎn)量以優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基組成、初始pH值、發(fā)酵溫度、接種量、底物添加量和底物添加時(shí)間為基礎(chǔ)，選擇發(fā)酵轉(zhuǎn)速為lOOrpm、150rpm、200rpm三種轉(zhuǎn)速進(jìn)行比較。根據(jù)圖5可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速在IOOrpm至200rpm之間時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，香蘭素的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率降低。所以當(dāng)發(fā)酵轉(zhuǎn)速為IOOrpm時(shí),香蘭素的產(chǎn)量最高。再進(jìn)一步，發(fā)酵過(guò)程優(yōu)選為光照條件。(6)發(fā)酵過(guò)程光照/避光生產(chǎn)天然香蘭素的產(chǎn)量通過(guò)對(duì)比在光照和避光條件下香蘭素的濃度來(lái)確定光照對(duì)菌種轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的影響。根據(jù)圖6可以看出，在光照條件下香蘭素的產(chǎn)量較高。不同發(fā)酵培養(yǎng)條件下生產(chǎn)天然香蘭素的產(chǎn)量(I)接種量、底物添加量和底物添加時(shí)間對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響以優(yōu)化得到的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH調(diào)至10. 0，培養(yǎng)溫度為40°C。用正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化接種量、底物添加量和底物添加時(shí)間，選取L9(34)正交表，其因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4的結(jié)果及方差分析可見(jiàn)，三個(gè)因素對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響順序?yàn)榘⑽核峒尤肓?> 阿魏酸加入時(shí)間> 接種量，即阿魏酸加入量的對(duì)香蘭素產(chǎn)量影響最大，接種量對(duì)香蘭素產(chǎn)量影響最小。根據(jù)表I的結(jié)果可知最佳組合為A1B3C3 :接種量5mL，底物添加量20mL，底物添加時(shí)間24h。表I.正交設(shè)計(jì)因素和水平表
水平接種量(％)阿魏酸加入時(shí)間阿魏酸加入量 _(h)_(g/L)_I10722.7
220 48 5
_3_2_24__表2.正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表和結(jié)果分析
權(quán)利要求
1.一種食甲醇芽孢桿菌，該菌株名為Bacillus methylotrophicus VJ4-1,保藏編號(hào)CCTCC NO :M2012004，食甲醇芽孢桿菌 Bacillus methylotrophicus CCTCC NO M 2012004的生物學(xué)特征是是革蘭氏陽(yáng)性菌，能在10% NaCl中生長(zhǎng)，有精氨酸雙水解酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性，能產(chǎn)酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水楊素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸鹽、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸組氨酸、朽1檬酸鹽為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其16S成應(yīng)序列與1^0；[11118 methylotrophicus的16S rRNA序列比對(duì)相似性達(dá)到100%。
2.一種食甲醇芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法，其方法涉及的步驟如下 (1)斜面培養(yǎng)將食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus CCTCC M2012004接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25 35°C、pH5 9條件下，靜置培養(yǎng)24 72h ； (2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(I)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 35°C條件下，100 150rpm振蕩培養(yǎng)24h 72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 4次，制得種子培養(yǎng)液； (3)發(fā)酵使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)基，按體積百分比2 20%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 40°C條件下，100 200rpm振蕩培養(yǎng)24 72h ； (4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的發(fā)酵液，加入5 13.3g/L的阿魏酸，在30 40°C條件下，100 200rpm振蕩培養(yǎng)6 12天后停止。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種食甲醇芽孢桿菌在是生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法，其特征在于所述斜面培養(yǎng)基馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L ;種子液培養(yǎng)基組成為麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種食甲醇芽孢桿菌在是生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為碳源5 20g/L，氮源I 3g/L，無(wú)機(jī)鹽0. 5 I. 5g/L，七水硫酸亞鐵0. 01 0. 05g/L,磷酸氫二鉀0. 5 I. 0g/L、七水硫酸鎂0.5 I. 0g/L，調(diào)節(jié) pH 至 6 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源為淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼任選其一。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的碳源，其特征在于所述碳源為谷殼。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述氮源為酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動(dòng)物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆柏任選其一。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的氮源，其特征在于所述氮源為谷殼。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述pH為10，發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為IOOrpm，發(fā)酵過(guò)程為光照條件。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種食甲醇芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，該菌株名為Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月16日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)CCTCC NOM 2012004，利用該菌株生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)天然香蘭素的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)量較高，方法工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，產(chǎn)物濃度較高，提取步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)清潔，產(chǎn)品環(huán)境友好，安全可靠。主要原料來(lái)源廣泛，成本極為低廉，具有天然性和工業(yè)化生產(chǎn)前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102747008SQ20121011390
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者喻林, 宋旭艷, 李丹, 王潔, 羅誠(chéng)浩, 陳勇, 魏敏 申請(qǐng)人:湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司