專利名稱：酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶b5(trap 5b)的底物的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶 (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP)，優選 TRAP 5b 的底物的用途。本發明也 涉及測量在受試者樣本中作為骨吸收率指標的TRAP 5b的量，以及與其相關的方法。本發 明也提供了酞類化合物的單磷酸酯在測量樣本中TRAP 5b中的用途，和實施本發明的方法 的試劑盒。
背景技術：
骨由2種主要的細胞類型組成負責形成骨的成骨細胞和負責破壞(吸收)骨的 破骨細胞。破骨細胞是進入礦化骨，將其破壞為其組成部分的多核細胞。吸收過程包括破 骨細胞向骨單位的附著。然后破骨細胞引發其細胞膜的內摺，并分泌膠原酶和其它在吸收 過程中重要的酶。由于骨被吸收，高水平的鈣、鎂、磷酸根和膠原的產物被釋放到細胞外液。 通常成骨細胞和破骨細胞處于平衡中，以使吸收的骨的量和形成的骨的量相同。在童年，骨 形成超過吸收，但隨年齡增長，吸收超過形成。已知若干醫學病況與骨吸收率的變化相關，可能最廣泛存在的是骨質疏松。這種 特定病況被認為是破骨細胞活性增加的結果，其特別是在絕經后婦女中導致骨量減少。這 導致骨的弱化并增加了對骨折的易感性。該年齡組的婦女中骨折可能是潛在嚴重的，由骨 質疏松引起的這些和其它癥狀的治療是昂貴的并需要醫學專業。長期以來對那些易患骨質 疏松的人的診斷被認為是重要的，以預防這種病況的潛在嚴重后果。已日益通過例如雌性 激素替代治療或雙膦酸酯治療成功治療骨質疏松。骨質疏松或其易感性的指標是測量受試者中骨密度，其中低的骨密度暗示骨吸收 過量，因此有骨質疏松或其它病況的可能。由于該組人群被認為是重要的商業市場，特別是 在西方國家，已發展了很多方法和儀器以測量骨密度。其中，以那些特異性、快速和廉價的 為人所歡迎。根據其電泳遷移率，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)屬于酸性磷酸酶的5型種類。它 是已鑒定的7種酸性磷酸酶中酸性最強的，并且是唯一一種抵抗酒石酸引起的抑制的酸性 磷酸酶。TRAP是一種在分子的活性位點含有自旋-偶聯鐵單位的堿性糖蛋白。TRAP的雙 核鐵單位含有2個高鐵離子，其使蛋白質呈紫色，因此它也被稱為紫色酸性磷酸酶。這種蛋 白有32kd的分子量。當酶被例如β-巰基乙醇還原，其中一個高鐵離子被還原，酶變為粉 紅色。TRAP在體外可以作為蛋白酪氨酸磷酸酶起作用，其氨基酸序列含有與磷蛋白磷酸酶 同源的區域。但是，TRAP的天然底物依然是未知的。若干研究已涉及在骨吸收過程中的TRAP。小鼠中TRAP基因的破壞(Hayman，A. R et al Development 122:3151-3162,1996)導致軟骨內骨化被破壞和輕度骨質疏松，其暗 示TRAP通過對骨基質吸收的關鍵作用在骨發展、保持成年骨的完整性和更新中對于軟骨 正常的礦化是必需的。
在人類中，已發現存在TRAP的正常細胞僅有破骨細胞和激活的巨噬細胞。已發 現在骨吸收期間TRAP被破骨細胞分泌到血液中。因此暗示TRAP在血清中的濃度作為 骨吸收的標記，并且已發現TRAP在血清中的濃度與骨吸收率相關(Kraenzlin Μ. E et al.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 71(2) 442~451,1990 ；Cheung C. K et al. Clin. Chem 41(5) :679-686,1995 ；Chamberlain P. et al. Clin. Chem. 41(10) 1495-1499，1995 禾口 Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10) 1444-1452，1996)。已鑒定出 2 種 TRAP 的同工型，TRAP 5a 禾口 TRAP 5b (Lam W. K. W. et al. (Clin. Chem. 24 (7) : 1105-1108，1978) )。TRAP 5a在較低最佳pH比TRAP 5b更具活性，由此允許對 TRAP各同工型的的功能測定。為了測定例如骨吸收率而進行的TRAP 5b血清或血漿的濃 度測量中的主要困難，是存在主要由巨噬細胞和樹突細胞產生的酶的5a同工型。這兩種同 工型都是acp5基因的產物，區別僅在于在翻譯后修飾中的變異。TRAP 5b缺少某些在TRAP 5a中存在的唾液酸殘基(在蛋白質的糖基團上)。所述同工型也在如下方面有所不同氨 基酸鏈的約14個殘基片段已經從TRAP 5b被蛋白水解切除。另外，核心蛋白是相同的，在 單純免疫學基礎上沒有區分這兩種同工型的方法。因此，商業上存在的TRAP 5b免疫測定 利用這兩種形式之間的生化差異。可以通過分光光度計測定TRAP的活性，例如在酒石酸存在時通過給予對硝基苯 基磷酸酯(PNPP)作為底物，酒石酸抑制大多數其它酸性磷酸酶。但是，該方法特異性不強， 因此為了測定TRAP，已發展了更具特異性的方法即免疫測定。已發展了多種使用多克隆抗 體的 TRAP 的測定方法(Stepan J. J et al (Biochem, Biophs. Res. Commun. 165 1027-1034， 1989), Kraenzlin Μ. E et al(Journal of Clinical Endrocrinology and Metabolism 71(2) :442-451，1990)和 Cheung C. Ket al (Clin. Chem. 41 (5) :679_686，1995))。針對TRAP 使用多克隆抗體的研究顯示兒童和絕經后婦女具有升高的血清TRAP濃度(Halleen J. et al Journal of Bone and Mineral Research 11(10 :1444_1452，1996)。Chamberlain P. et. Al (Clin. Chem. 41(10) :1495_1499，1995)描述了針對重組產 生的TRAP使用單克隆抗體的測定。基于TRAP 5b是比總TRAP更具特異性的骨吸收的生化標記的發現，國際專利申請 No. WO 1999/050662描述了 TRAP 5b的測定，所述測定在具有確定pH范圍的緩沖液中使用 普通磷酸酶底物，對硝基苯基磷酸酯(PNPP)以使5b同工型的活性最大化，而降低TRAP 5a 的干擾。歐洲專利No. 1598670描述了適于測量TRAP 5b的酸性磷酸酶底物，其中實施例 底物之一，2-氯-4-硝基苯基磷酸酯，對TRAP 5b相對TRAP 5a的相對活性僅僅比上述 W01999/050662中獲得的活性高0. 8倍。美國專利No. 7，074, 903描述了自稱相對TRAP 5a顯示對TRAP 5b的特異性的單 克隆抗體。但是該抗體顯示與重組人TRAP5等效的交叉反應性，這被認為與TRAP 5b (從人 血清中分離)相比更類似于天然的TRAP 5a。因此，所述測定中的抗體功能特異性在區別 TRAP 5a和5b方面并不顯著優于描述于W01999/050662或EP1598670中的活性測定。已知的商業測定適于使用在某些臨床應用中，因為TRAP 5a的酶促活性比5b (臨 床應用的形式)低相當多。但是，通過評價公布于諸多研究范圍內的數據，可以估計在正常樣本中5a的影響可能高達50%。盡管對于某些TRAP 5b水平的變化是顯著的臨床應用，這 并不代表一種顯著的困難，但是已知的方法可能缺乏區分TRAP 5b水平中更細微的變化的 能力。應用于已知測定中的底物pNPP及其4-鹵-取代衍生物在溶液中是不穩定的。當 手工進行測定且其中底物是作為在使用之前立即溶解的固體應用時，這不是問題。但是，底 物的不穩定性使這些化合物難以應用于自動化免疫測定平臺，所述平臺需要底物在溶液中 穩定若干周。專利No. US 3，975，405描述了一種鄰甲酚酞的單磷酸酯及其在血清樣本中作為 測量堿性磷酸酶的底物的用途，并自稱具有如下利益避免由膽紅素引起的干擾，并且與百 里酚酞單磷酸酯相比對堿性磷酸酶的腸道和胎盤內的同工型更敏感。所述方法不區分堿性 磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型，或描述其作為TRAP 5b的底物的用途。專利No. US 4，045，290描述了百里酚藍單磷酸酯作為磷酸酶底物用于在血清中 測量總堿性磷酸酶和在血清中適宜PH條件下測量總酸性磷酸酶的制備和用途。所述方法 不區分堿性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型。因此，需要用于測定TRAP 5b的方法，其中與現有測定相比TRAP 5a的干擾顯著減 少，并且其可易于應用于自動化模式中。

發明內容
本發明提供了酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRAP 5b)的 底物的用途。在本文中，酞類化合物的單磷酸酯定義為下式的化合物其中A是取代或未經取代的0-磷酰化的對苯酚；B是取代或未經取代的對苯酚磷酸酯；X 是 CO 或 SO2 ；R1 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, -C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；R2 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, -C(O) OR5、-OC(O) R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；R3 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, _C(0) OR5、_0C(0) R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；并且R4 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, _C(0) OR5、_0C(0) R5、-S(O)
8nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；其中η 是 0、1 或 2;R5和R6各自獨立地是氫或R7 ；并且R7選自烴基、-(CH2)k-雜環基、-(CH2)k-C(O)-雜環基，其中的任意基團任選地被1、 2、3、4或5個獨立地選自鹵素、氰基、氨基、羥基、-COOH和其酯(例如-C (0) -C1^6烷基)、亞 磷酰胺、Cp6烷基和CV6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6。優選地，酞類化合物的單磷酸酯定義為下式的化合物
權利要求
1.酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的底物的用途。
2.用于測量樣本中TRAP5b的量的方法，所述方法包括使用酞類化合物的單磷酸酯作 為底物測定TRAP 5b的活性。
3.用于測量受試者中骨吸收率的方法，所述方法包括通過使用酞類化合物的單磷酸 酯作為底物測定TRAP 5b的活性而測量受試者樣本中TRAP 5b的量，其中存在于樣本中的 TRAP 5b的量反映了骨吸收率。
4.診斷受試者中與骨吸收率的變化相關的障礙的易感性的方法，所述方法包括通過 使用酞類化合物的單磷酸酯作為底物測定TRAP5b的活性而測量受試者樣本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量是患者患有該障礙的指示。
5.監測用于預防或治療與骨吸收率的變化相關的障礙的藥物在服用該藥物的受試者 中的效果的方法，所述方法包括(a)通過使用酞類化合物的單磷酸酯作為底物測定TRAP 5b的活性而測量受試者樣本中存在的TRAP 5b的量；和(b)將TRAP 5b在上述樣本中的量 與TRAP5b在對照樣本中的量進行比較。
6.篩選受試者對與骨吸收率的變化相關的障礙的易感性的方法，所述方法包括通過 使用酞類化合物的單磷酸酯作為底物測定TRAP5b的活性而測量受試者樣本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量表明對這類障礙的易感性。
7.根據權利要求2至6任一項的方法，所述方法包括(a)將樣本中存在的TRAP與結合 總TRAP (TRAP 5a和TRAP 5b)的抗體結合；和(b)通過使用酞類化合物的單磷酸酯作為底 物測定與所述抗體結合的TRAP 5b的活性而測量樣本中TRAP 5b的量。
8.根據權利要求2至7任一項的方法，其中TRAP5b活性的測定步驟在pH 6. 8至7. 6， 優選pH 6. 8至7. 4，最優選pH 7進行。
9.根據權利要求2至8任一項的方法，其中通過測量TRAP5b活性后樣本顏色而測量 TRAP 5b 的量。
10.根據權利要求1至9任一項的方法，其中測定樣本中TRAP5b的活性的步驟包括如 下連續的步驟(e)溫育酞類化合物的單磷酸酯和樣本以使TRAP5b代謝底物；(f)停止代謝；(g)任選地調節樣本的PH；(h)測量由于被TRAP5b代謝而導致的底物的特征變化。
11.根據權利要求9或10的方法，其中使用分光光度計測量樣本的顏色。
12.根據權利要求2至10任一項的方法，所述方法還包括通過將任一項權利要求中所 得的TRAP 5b的測量值與校正標準或曲線比較而得到存在于樣本中的TRAP 5b的量的絕對值。
13.根據權利要求2至11任一項的方法，其中TRAP5b活性的測定步驟在固體基質上 進行，優選平臺、多孔板或陣列。
14.根據權利要求13的方法，其中所述平臺是自動化的。
15.根據權利要求13或14的方法，其中所述自動化平臺包括磁珠。
16.用于實施根據任一項權利要求的方法的試劑盒，所述試劑盒包含酞類化合物的單 磷酸酯和任選地包含結合總TRAP的抗體。
17.酞類化合物的單磷酸酯通過作為TRAP5b的底物而用作骨吸收的指示物的用途。
18.根據權利要求17的用途，其用于根據權利要求1至15任一項的方法中。
19.根據權利要求16的用途，所述用途包括將所述單磷酸酯與受試者的樣本接觸，隨 后測量樣本的顏色。
20.根據前述權利要求任一項的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物是酚酞或磺酞。
21.根據權利要求19的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物是苯酚磺酞。
22.根據前述權利要求任一項的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物是具有式I的化 合物
23.根據前述權利要求任一項的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物的單磷酸酯選自 酚酞單磷酸酯、甲酚酞單磷酸酯、百里酚酞單磷酸酯、鄰氯酚酞單磷酸酯、苯酚磺酞單磷酸 酯、鄰甲酚磺酞單磷酸酯、間甲酚紫單磷酸酯、溴甲酚紫單磷酸酯、溴甲酚綠單磷酸酯、溴酚藍單磷酸酯、百里酚藍單磷酸酯、溴百里酚藍單磷酸酯、二甲苯酚藍單磷酸酯和氯酚紅單磷酸酯。
全文摘要
本發明涉及酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的底物的用途。在用于測量受試者樣本中TRAP 5b的量的測定中使用所述底物，所述TRAP 5b的量作為骨吸收率的指標，以及因此作為類似病況，例如骨質疏松的指標。本發明也提供了包含酞類化合物的單磷酸酯和任選包含結合總TRAP的抗體的試劑盒，以及方法。
文檔編號C12Q1/42GK102007411SQ200980113346
公開日2011年4月6日 申請日期2009年4月8日 優先權日2008年4月15日
發明者B·休斯敦, D·勞里, J·哈倫 申請人:伊姆諾診斷系統有限公司