專利名稱：轉染的細胞的生產方法
技術領域：
本發明涉及生產含有其中導入了期望的基因的T細胞的細胞群體的方法，其在醫 學領域是有用的。
背景技術：
生物體主要由免疫反應來保護免于幾種生物學侵入，免疫系統由各種細胞和它們 產生的可溶性因子組成。在它們之中，白細胞，特別是淋巴細胞起到重要作用。這種淋巴細 胞被分成兩種主要類型，B淋巴細胞(在下文也稱為B細胞)和T淋巴細胞(在下文也稱 為T細胞)，兩者都特異性地識別抗原并作用于它們來防護生物體。在外周部，具有⑶(分化簇)4標記物的⑶4 T細胞或具有⑶8標記物的⑶8 T細 胞占據了 T細胞的大部分。大部分的CD4 T細胞被稱為輔助T細胞(在下文中描述為Th)， 涉及抗體生產的輔助和各種免疫反應的誘導，通過抗原刺激分化成Thl型或Th2型，其分別 產生各種細胞因子。大部分CD8 T細胞通過抗原刺激分化成細胞毒性T細胞[Tc 細胞毒T 淋巴細胞；別名殺傷T細胞；在下文中也稱為CTL]，其顯示細胞毒性活性。作為在外科手術、化學治療和放射治療之后對于癌癥的第四種治療，免疫治療是 令人感興趣的。免疫治療利用了人類本來擁有的免疫性，對患者的物理壓力與其他療法相 比更小。轉移淋巴因子活化的細胞、NK T細胞、γ δ T細胞等等的療法，所述細胞是通過對 根據各種方法離體(ex vivo)誘導的CTL、外周血淋巴細胞等等進行擴增獲得的，樹突狀細 胞轉移療法、肽疫苗療法和Thl細胞療法，通過所述Thl細胞療法抗原特異性CTL的體內誘 導是預期的，此外，免疫基因療法，其中這些細胞離體用預計具有各種效果的基因轉導并被 轉移到體內，等等，被稱為免疫療法。一種細胞毒性T細胞(CTL)可以通過特異性T細胞受體(在下文中縮寫為TCR) 識別復合物，所述復合物是由主要組織相容性復合體(在下文中縮寫為MHC)和抗原肽編碼 的、主要組織相容性復合體分子(MHC分子，對人類來說稱為人類白細胞抗原；在下文中縮 寫為HLA)的共軛物，并可以殺死在細胞表面呈遞這種復合物的細胞。特異于目標抗原的細胞毒性活性可以通過將識別目標抗原的TCR的基因導入T細 胞例如CTL來賦予。根據這個發現，使用TCR基因的基因療法正在嘗試靶向各種抗原，例 如，MART 1 (非專利文獻1)、gpl00 (非專利文獻2)和mHAG HA-2抗原(非專利文獻3)。此 外，基因療法正在嘗試利用編碼來自人類的TCR、來自人類以外的生物體的TCR、識別目標 抗原的抗體的抗原識別點的嵌合受體、一組與TCR締合來形成抗原識別復合物的分子(例 如，⑶3)、T細胞表面抗原(例如，⑶8和⑶28)和這些的部分的基因，作為要導入T細胞的 受體。纖連蛋白是在血液中、在細胞表面上、在動物組織的細胞外基質中存在的高分子 量糖蛋白，具有250，000的分子量，已知具有多種功能。在轉移通過擴增CTL、外周血淋巴細 胞等等獲得的淋巴因子活化細胞的免疫治療中，所述CTL、外周血淋巴細胞等等通過IL-2 和抗⑶3抗體的刺激離體地獲得，已經檢查了纖連蛋白或其片段對一些問題的作用，例如，如何離體誘導的抗原特異的CTL的擴增時維持細胞毒性活性，以及如何有效地離體擴增淋 巴細胞(例如，專利文獻1到3)。近年來，已經報道的是，在免疫治療中，通過向生物體施用處于更為未分化狀態的 幼稚T細胞或中央記憶T細胞，而不是施用終末分化的效應T細胞，可以預期更高得多的治 療效果(例如，非專利文獻4和5)。此外，利用樹突狀細胞轉移療法、肽疫苗療法等等，在 其中抗原特異CTL的體內誘導是預期的，例如，在患有進展的癌癥、被認為體內具有將成為 CTL的祖代的小群體幼稚T細胞的患者中，常常不能獲得足夠的效果。專利文獻1 :W003/016511 冊專利文獻2 :W003/080817 冊專利文獻3 :W0 2005/019450 冊非專利文獻 1 Journal of Immunology, Volume 163，pp. 507—513 (1999)非專利文獻 2 Journal of Immunology, Volume 170, pp. 2186-2194(2003)非專利文獻3 :Blood, Volume 103，pp. 3530-3540 (2003)非專 利文獻 4 Journal of Clinical Investigation, Volume 115, pp. 1616-1626(2005)非專利文獻 5 Journal of Immunology, Volume 175，pp. 739-748 (2005)

發明內容
本發明要解決的問題本發明的目的是提供方便地生產細胞群體的方法，所述細胞群體中導入了期望的 基因，其在通過細胞療法的疾病治療中是有用的，以及生產細胞群體的方法，所述細胞群體 中以更高的效率導入了期望的基因。作為解決上述問題的認真研究的結果，本發明人發現，對于在含有纖連蛋白或其 片段和CD3配體的容器中培養的細胞群體，當導入攜帶期望基因的載體的操作在同一容器 中進行時，基因轉移效率相比現有技術提高，完成了本發明。也就是說，本發明涉及[1] 一種生產細胞群體的方法，所述細胞群體中導入了期望的基因，所述方法包括 以下的步驟(1)在含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中培養含有T細胞和/或T細胞 的祖細胞的細胞群體的步驟；和(2)向步驟(1)的容器添加攜帶所述期望的基因的載體的步驟，[2]根據[1]的方法，其中，在步驟O)中，所述載體是逆轉錄病毒載體，[3]根據[1]的方法，其中，在步驟O)中，在添加載體之后，進行物理地提高載體 和細胞之間的接觸頻率的操作，[4]根據[3]的方法，其中，通過增加離心力或攪動所述容器的內容物物理地提高 載體和細胞之間的接觸頻率，[5]根據[1]的方法，進一步包括培養步驟O)中獲得的轉導的細胞群體的步驟，[6]根據[1]的方法，進一步包括從步驟( 中獲得的轉導的細胞群體分離期望的 亞細胞群體的步驟，
[7] 一種其中導入了期望的基因的細胞群體，其是可通過根據[1]到[6]的任一項 的方法獲得的，[8] 一種藥物，包含其中導入了期望的基因的細胞群體作為活性成分，所述細胞群 體是可通過根據[1]到W]的任一項的方法獲得的，[9] 一種疾病的治療或預防方法，包括向受試者施用有效量的其中導入了期望的 基因的細胞群體的步驟，所述細胞群體是可通過根據[1]到[6]的任一項的方法獲得的，和[10]其中導入了期望的基因的細胞群體用于制備藥物的用途，所述細胞群體是可 通過根據[1]到W]的任一項的方法獲得的。發明效果根據本發明的生產方法，提供了含有高比例的其中導入了期望的基因的細胞的群 體。可通過所述生產方法獲得的細胞群體在通過細胞療法的疾病治療中是極其有用的。附圖的簡要說明附

圖1顯示了 hGreen基因轉移的效率；禾口附圖2顯示了 AcGFP基因轉移的效率。實施發明的最佳方式在本發明中，“T細胞”是指一種細胞，也稱為T淋巴細胞，在涉及免疫反應的淋巴 細胞之中，其來源于胸腺。T細胞包括輔助T細胞、抑制T細胞、細胞毒性T細胞、幼稚T細 胞、記憶T細胞、表達由α鏈和β鏈組成的TCR的α β T細胞、以及表達由、鏈和δ鏈 組成的TCR的、δΤ細胞。此外，具有分化成T細胞的能力的“Τ細胞的祖細胞”，也可以用 于本發明中。“含有T細胞和/或T細胞的祖細胞的細胞群體”的實例包括外周血單核細胞 (PBMC)、幼稚T細胞、記憶T細胞、造血干細胞、臍帶血單核細胞，等等。此外，含有T細胞的 來自造血細胞的多種細胞群體可以用于本發明中。這些細胞可以通過細胞因子例如IL-2 在體內或離體活化。作為這些細胞，從生物體采集的那些、或通過體外培養獲得的那些，例 如，通過本發明的方法獲得的T細胞群體可以直接使用或在低溫保存之后使用。此外，例 如，也可以使用通過多種誘導操作或分離操作從來自生物體的T細胞群體的制品中使用的 細胞獲得的細胞群體，例如，通過從細胞如PBMCs分離CD8+或CD4+細胞獲得的任何細胞群 體。注意到，在本發明的方法中，為了生產細胞群體，可以使用含細胞的材料，例如，血液，如 外周血和臍帶血液，已經除去了例如紅細胞或血漿的組分的血液，骨髓溶液等等。在本發明中，“纖連蛋白，，和其片段可以天然地獲得或人工地合成，也就是說，非 天然的。纖連蛋白和其片段可以根據例如RuoslahtiE.，et al. Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) ,Volume 256, No. 14, pp7277-7281 (1981)所公開的，從來自天然 來源的物質，以基本上純的形式制備。在此，此處描述的基本上純的纖連蛋白或纖連蛋白片 段是指基本上不含有與纖連蛋白天然地在一起存在的其他蛋白質的蛋白。纖連蛋白和其片 段可以分別單獨地、或以與幾種蛋白質的混合物形式在本發明中使用。此外，可以使用纖連 蛋白片段的單獨分子或具有不同結構的復數種片段的組合。注意到，雖然已知纖連蛋白存在許多剪接變體，本發明中使用的纖連蛋白可以是 任何變體，只要它顯示了本發明的期望的效果。例如，在纖連蛋白來自血漿的情況下，存在 于細胞結合結構域的上游的稱為ED-B的區域、存在于細胞結合結構域和肝素結合結構域 之間的稱為ED-A的區域已知被刪除；然而，來自血漿的這種纖連蛋白也可以用于本發明5中。可以用于本發明的纖連蛋白片段的有用的信息和片段的制備可以從Journal of Biochemistry(J. Biochem. ), Volume 110, pp284-291 (1991)> EMBO Journal(ΕΜΒ0 J. ) , Volume 4, No. 7， pp1755 — 1759 (1985)、 Biochemistry, Volume 25, No. 17， PP4936-4941 (1986)等等獲得。此外，編碼纖連蛋白的核苷酸序列和纖連蛋白的氨基酸序列 在 GenBank Accession No. NM_002026 和 NP_002017 中公開。纖連蛋白的結構域結構被分成七個結構域，此外，在其氨基酸序列中含有三種相 似的序列。整體由這些序列的每一種的重復構成。這三種相似的序列被分別稱為I型、II 型和III型，在這之中，III型由71到96氨基酸殘基組成，這些氨基酸殘基的匹配率是17 到40%。在纖連蛋白中，存在14種III型序列，在這之中，第8、9和10種序列(以下分別稱 為III-8、III-9和111-10)含在細胞結合結構域中，第12、13和14種序列(以下分別稱為 III-12、III-13和111-14)含在肝素結合結構域中。此外，稱為IIICS的區域存在于肝素結 合結構域的C-末端。包含具有對VLA-4的結合活性的25個氨基酸的區域，稱為CS-1，存在 于IIICS中。可以用于本發明的纖連蛋白片段可以是含有III-7、8、9、11、12、13和CS-I的 任何結構域的片段，此外，可以是其中復數個結構域重復和連接的片段。例如，含有含VLA-5 配體的細胞粘附結構域、肝素結合結構域、為VLA-4的配體的CS-I結構域等等的片段被用 于本發明中。例如,在上述 J. Biochem.，Volume 110，pp284_291 (1991)中描述的 CH-271、 CH-296.H-271和Η496，以及其衍生物和變體被指出作為所述片段的實施例。上述CH-296 是以名稱RetroNectin(注冊商標)商業上可獲得的。在下文中，具體地描述了本發明。1.本發明的生產方法本發明涉及生產細胞群體的方法，所述細胞群體中導入了期望的基因，所述方法 包括以下的步驟(1)在含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中培養含有T細胞的細胞群體的 步驟；和(2)向步驟(1)的容器添加攜帶期望的基因的載體的步驟。注意到，上述步驟(1)可能在此被描述為第一步驟，步驟( 被描述為第二步驟。本發明的方法產生的細胞群體是含有其中導入了期望的基因的T細胞的細胞群 體。對于要導入的期望的基因沒有特別的限制，它可以根據基因導入的目的適當地選擇。沒 有任何特別的限制，編碼多肽例如酶、抗體、結構蛋白、細胞因子、趨化因子、毒素或熒光蛋 白的基因，編碼反義核酸的基因，產生RNA干擾的RNA，等等，可以通過本發明的方法導入。 在本發明的一個方面中，編碼識別期望的抗原的受體的基因被指出作為實例。
上述“識別期望的抗原的受體，，是特異性識別目標抗原的蛋白質。來自人類的T 細胞受體(TCR)，來自人類以外的生物體的TCR，等等，被指出作為識別期望的抗原的受體 的實例。作為TCR，已知的是由α鏈和β鏈組成的異二聚體以及由Y鏈和δ鏈組成的異 二聚體，兩者都可以在本發明中適當地使用。此外，嵌合受體、T細胞表面抗原(例如，CD8、 CD28)和其部分(重組TCR)也可以作為識別期望的抗原的受體適當地使用，在所述嵌合受 體中，這些TCR的抗原識別位點或識別期望的抗原的抗體的抗原識別位點與選自與TCR締 合的一組分子的一種或更多種成分組合，來形成抗原識別復合物(例如，CD3()。受體可以是由一種分子組成的受體，或由復數種分子組成的同二聚的或異二聚的受體。作為由一種 分子組成的受體，具有scFv(單鏈Fv)的抗原識別位點的受體也可以適當地使用。雖然不 受特別的限制，識別期望的抗原的受體可以由識別期望的抗原的細胞外結構域、跨膜結構 域和轉移信號的細胞內結構域構成，并可以進一步含有鉸鏈或接頭結構域。在本發明中，編 碼識別期望的抗原的受體的基因是外源基因，是在導入該基因的T細胞中原本不存在或不 表達的基因。也就是說，“編碼識別期望的抗原的受體的基因”是指被人工地導入本發明中 使用的T細胞的基因，包括來自與所述T細胞相同物種或不同物種的那些。含有用受體基 因轉導的T細胞的細胞群體是含有識別所述期望的抗原的T細胞的細胞群體。所述細胞群 體是與沒有導入編碼所述受體的基因的細胞群體相比具有對抗原的高特異性的群體，并能 快速地應答所述期望的抗原的刺激。此外，在本發明的生產方法中，可以添加期望的抗原、 公知的蛋白質、細胞因子、趨化因子或其他組分，此外，通過添加分隔或分離步驟，細胞群體 可以被誘導、培養或分離。此外，生產含有這些細胞的細胞群體的方法也被包括在本發明的 方法中。在本發明的生產細胞群體的方法中，優選的是，培養的總時間是4到14天。注意， “培養的總時間”包括步驟(1)和O)，以及，例如，除了上述兩個步驟之外為了提高細胞的 數量進行的培養步驟的時間。當培養的總時間是4到14天時，獲得的細胞群體是具有提高 的細胞生長速度、提高的幼稚T樣細胞的比例和提高的IFN-Y產生水平的細胞群體，適合 于用于細胞治療的領域。注意的是，當培養的總時間少于4天，不能獲得足夠用于一般免疫 治療的細胞數量。在本發明中，培養的總時間更優選的是5到14天，再更優選的7到14天。在本發明的生產細胞群體的方法中，第一步驟是其中含有T細胞的細胞群體被培 養在含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中的步驟。在開始培養之后，進行當前步驟 至少一天或更久，更優選的2到7天，再更優選的2到5天。注意的是，在本發明中，在存在 上述活性成分的情況下的培養不僅僅限于這個第一步驟，而根據需要可以對已經導入了期 望的基因的細胞進行。在本發明中，對培養時纖連蛋白、其片段或其混合物的濃度沒有特別的限制，但 是，例如，0. 001到500 μ g/mL,特別是0. 01到500 μ g/mL是優選的。在本發明中，CD3配體沒有特別的限制，只要它是具有結合CD3的活性的物 質，但是，例如，它可以是抗CD3抗體，特別優選地可以使用抗CD3單克隆抗體。例如， 0KT3 [Science, Volume 206，pp347_349 (1979)]被指出作為實例。對培養基中CD3配體的 濃度沒有特別的限制，但是，例如，當使用抗CD3單克隆抗體時，例如，0. 001到100μ g/mL， 特別是0. 01到100 μ g/mL是優選的。另外，在本發明中，根據需要，細胞還可以通過添加其他共同刺激因子，例如⑶觀 配體來共同刺激。期望的抗原、糖皮質激素誘導的TNF相關的受體配體(GITRL)、抗0擬8抗 體、⑶80、Β7-1、Β7-2等等被指出作為共同刺激因子的實例。本發明的方法中用于生產細胞群體使用的培養基沒有特別的限制，只要它含有上 述活性成分，但可以使用通過混合T細胞擴增所必需的成分制備的公知的培養基。例如， 可以選擇商業上可獲得的培養基并適當地使用。這些培養基除了其原始成分之外可以含 有細胞因子、合適的蛋白質和其他成分。作為細胞因子，例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、 IFN-y等等被指出作為實例。優選的，使用含有IL-2的培養基。對培養基中IL-2的濃度沒有特別的限制，但是其可以是，例如，優選的0.01到lX105U/mL，更優選的1到IXlO4U/ mL。此外，作為合適的蛋白質，例如，抗IL-4抗體被指出作為實例。此外，也可以添加淋巴 細胞刺激因子，例如凝集素。此外，雖然其中要導入期望的基因的細胞可以在轉導之前通過 添加γ δ T細胞活化因子來活化，它也可以在轉導之后活化。對γ δ T細胞活化因子沒有 特別的限制，只要它們顯示了對Y S T細胞的活化作用和生長促進作用，但是，例如，它們 可以是二膦酸的化合物，例如，帕米膦酸(pamidronate)和唑來磷酸(zoledronate)，焦磷 酸單酯化合物，例如異戊烯焦磷酸和2-甲基-3- 丁烯基-1-焦磷酸、phosphohalohydrins、 phospho印oxides，等等。對培養基中的組分的濃度沒有特別的限制，只要獲得了期望的效^ ο此外，血清或血漿可以添加到培養基中。雖然對添加到培養基中的數量沒有特別 的限制，按體積0%到按體積20%作為實例給出，此外，使用的血清或血漿的數量可以取決 于培養階段而變化。例如，以逐步的方式降低血清或血漿濃度是可能的。注意的是，血清或 血漿的來源可以是自體的(意味著所述來源與培養的細胞相同)或非自體的(意味著所述 來源與培養的細胞不同)；然而，從安全性的角度，適當地使用來自自體來源的那些。雖然對在本發明中培養的開始時細胞的數量沒有特別的限制，其可以是，例如，優 選的10個細胞/mL到IX IO8個細胞/mL，更優選的IO2個細胞/mL到5 X IO7個細胞/mL， 再更優選的IO3個細胞/mL到2X IO7個細胞/mL。此外，對培養條件沒有特別的限制，可以 使用用于細胞培養的常規的條件。例如，在如37°C和5% CO2的條件下培養在此是可能。此 外，以合適的間隔時間，通過添加新鮮的培養基來稀釋細胞培養溶液，置換培養基，或置換 細胞培養工具是可能的。對本發明的細胞群體生產方法中使用的細胞培養工具沒有特別的限制，但是，例 如，可以使用平板、燒瓶、袋子、大的培養容器、生物反應器，等等。注意的是，可以使用0)2氣 體可滲透的細胞培養袋作為袋子。此外，當商業上制備大量細胞群體時，可以使用大的培養 容器。此外，雖然培養可以在開放系統或封閉系統中進行，從獲得的細胞群體的安全性的角 度，優選的是在封閉系統中進行培養。注意的是，除了被溶解以共存于培養基中之外，纖連蛋白或其片段和CD3配體、其 他共同刺激因子、合適的蛋白質、細胞因子或培養基中含有的其他組分也可以固定在合適 的固相上，例如，細胞培養工具(包括用于開放系統和封閉系統的)，例如平板、燒瓶和袋 子、細胞培養支持物，例如珠子、膜或載玻片。對這些固相的材料沒有特別的限制，只要它可 以用于細胞培養。當各種成分被固定在培養工具或細胞培養支持物上時，優選的，在培養中 使用的組分的數量與培養基的數量的比例被調節到與組分溶于培養基時使用的濃度相同 的比例；然而，這種比例沒有限制，只要獲得的期望的效果。對將纖連蛋白或其片段、CD3配體或其他組分固定在固相上的方法沒有特別的限 制，但是，例如，這些物質可以通過在適當的緩沖溶液中使它們與固相接觸來固定。此外，對于纖連蛋白的片段在固相上的固定，固定也可以根據WO 97/18318冊和 WO 00/09168冊中描述的方法來進行。當如上所述的各種組分或本發明中使用的活性成分在固相上固定時，活性成分等 等可以通過在根據本發明的方法培養T細胞群體之后僅僅從固相中分離T細胞群體來截 留，其可以防止活性成分等等混合到T細胞群體中。
在本發明生產細胞群體的方法中，第二步驟是一種步驟，其中帶有期望的基因的 載體被添加到第一步驟的容器中，來將基因導入細胞。也就是說，第一步驟和第二步驟在相 同的容器中進行，不更換容器。載體的添加不限于一次，在第二步驟期間載體可以添加幾 次。載體的添加可以通過合適的途徑進行，例如，將含有載體的溶液添加到容器中的培養溶 液中，或用含有載體的培養基替換容器中的培養基。雖然對要導入細胞的期望的基因的數量沒有限制，它可以是一種基因，或包括幾 種基因的復數種基因。例如，根據要轉導的細胞，可以同時地、預先地或隨后地導入適合的 基因，如編碼T細胞表面抗原的基因。例如，在α β TCR基因被導入γ δ T細胞中的情況下， 優選的是除了該基因之外還導入編碼⑶8的基因。在本發明中，對攜帶期望的基因的載體沒有特別的限制，但是，它可以選自公知的 載體并適當地使用。例如，利用病毒載體的方法和利用非病毒載體的方法都可以用于本發 明中。對于這些方法的細節已經公開了各種文獻。雖然對上述病毒載體沒有特別的限制，轉導方法中通常使用的公知的病毒載體 可以使用，例如，逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體、偽型載體)、腺病毒載體、腺病毒相 關病毒載體、猿猴病毒載體、牛痘病毒載體、仙臺病毒載體，等等。優選的，可以使用逆轉 錄病毒載體、腺病毒載體或慢病毒載體。作為病毒載體，缺乏復制能力、其在感染的細胞 中的自我復制被抑制的病毒載體是適合的。此外，用于改善基因轉移效率的物質，例如， RetroNectin(注冊商標，Takara Bio Inc.制造)也可以在轉導時使用。雖然對本發明中使用的非病毒載體沒有限制，例如，質粒載體可以用作非病毒載 體，并通過利用載體如脂質體、配體-聚賴氨酸等等的方法，或磷酸鈣方法、電穿孔方法或 顆粒槍方法等等來導入。在本發明中，在存在纖連蛋白或其片段和CD3配體的情況下將期望的基因導入細 胞。本發明中使用的纖連蛋白或其片段具有提高逆轉錄病毒載體或慢病毒載體的基因轉移 效率的作用。此外，逆轉錄病毒載體和慢病毒載體可以將載體中的外源基因穩定地導入要 導入所述載體的細胞的染色體DNA中，并被用于基因治療等等的目的。由于載體可以感染 處于分裂或生長中的細胞，它們特別適合于在本發明的生產方法的步驟中進行轉導。例如，期望的基因可以被插入載體、質粒等中，用來表達處在適合的啟動子控制下 的基因。此外，為了實現基因的高效轉錄，與啟動子或轉錄起始位點協作的其他調節元件， 例如，增強子序列和/或終止子序列可以在載體中存在。此外，為了通過同源重組插入轉導 目標T細胞的染色體，例如，基因可以置于側翼序列之間，所述側翼序列包含分別同源于染 色體中基因的期望目標插入位點兩端存在的核苷酸序列。雖然第二步驟可以在第一步驟開始一定時間之后進行，它也可以與第一步驟的開 始同時地進行。在后一種情況中，含有T細胞的細胞群體和攜帶期望的基因的載體同時地 添加到含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中。在本發明的優選的方面，但不是限制 本發明，第二步驟在進行第一步驟之后至少一天或更久進行，更優選的1到7天，再更優選 的2到5天。所述第二步驟，但不是限制本發明，一般在進行第一步驟之后進行1到3天， 優選的1到2天。此外，為了在第二步驟中提高細胞和病毒之間的接觸頻率，物理地提高載體和細 胞之間的接觸頻率的操作可以在添加載體之后進行。例如，載體和細胞之間的接觸頻率可以通過向容器添加離心力來將載體和細胞移動到容器的底面，和通過攪動容器的內容物來 提高。內容物的攪動可以優選地通過振動或搖動容器來進行。向細胞中的基因轉移效率 通過這些操作進一步提高。作為優選的方面，向含有載體的容器添加離心力被指出作為實 例。雖然要添加的離心力沒有特別的限制，只要它處在細胞不承受過度的損傷和基因轉移 效率改善的范圍之內，一般地，250到2000Xg和優選的500到1500Xg是優選的。此外，3 到120分鐘和特別是5到60分鐘是添加離心力的合適的持續時間。本發明的方法特征在于在含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中培養含有 要被轉導的T細胞的細胞群體，隨后在同一容器中進行向細胞群體的轉導。通常，在存在合 適的刺激因子的情況下進行預培養細胞，然后，細胞轉移到另一個容器進行轉導。根據本發 明，由于轉移的細胞的損失或不必要的刺激可以被避免，基因轉移的效率可以改善。特別 地，本發明的方法適合于利用封閉系統的培養容器的轉導，例如細胞培養袋子。本發明用于生產細胞群體的方法可以進一步包括培養第二步驟中獲得的轉導的 細胞的步驟作為第三步驟。也就是說，載體可以在完成第二步驟之后移除(例如，通過用沒 有載體的培養基置換培養基)，細胞的培養可以繼續。上述步驟可以通過細胞培養的常規方法進行，例如，公知的T細胞培養方法。細胞 的培養可以在與上述第一步驟相同的條件下進行，或在除了在上述方法中使用纖連蛋白或 其片段和CD3配體作為活性成分之外與第一步驟中使用的條件類似的條件下進行。此外，本發明的生產方法也可以包括在每個步驟之前或之后將細胞群體分離成期 望的亞細胞群體的步驟。例如，如上所述，高比例的幼稚T樣細胞被含在通過在存在本發明 的活性成分的情況下培養獲得的細胞群體中。因而，通過進一步分離和獲得表達期望的表 面抗原標記物的細胞，可以獲得幼稚T樣細胞或以更高比例含有幼稚T樣細胞的T細胞群 體。此外，表達期望的基因的細胞可以在本發明的生產方法的第二步驟之后分離和獲得。雖 然對分離操作沒有特別的限制，分離可以通過利用例如細胞分選儀、磁性珠子、柱等等通過 公知的方法進行。此外，當有適合的手段時，可以選擇含有導入了受體基因的細胞的亞細胞 群體。此外，通過從本發明的方法產生的細胞群體克隆T細胞，也可能維持穩定的T細 胞。此外，通過本發明的方法獲得的細胞群體也可以用于通過本發明的方法或公知的方法 的另外培養來獲得新的細胞群體。本發明的方法獲得的細胞群體含有高比率的表達⑶45RA和表達⑶62L或CCR7的 細胞，也就是說，幼稚T樣細胞，其是未分化的T細胞。雖然細胞群體的細胞毒性活性也可 以通過公知的體外測試來評估，通過本發明的生產方法獲得的細胞群體在這樣的評估系統 中不一定展現高細胞毒性活性，因為如上所述的本發明獲得的T細胞群體以高比率含有未 分化的幼稚T樣細胞。此外，與常規方法制備的細胞群體相比，本發明的方法生產的細胞群體具有生物 體中極好的生存力，在生物體中保持針對同一物種或不同物種的抗原的高活性。因此，本發 明的方法是用于過繼性免疫療法的新的T細胞擴增方法，包括用纖連蛋白或其片段刺激細 胞和導入期望的基因的步驟，本發明的方法獲得的轉導的T細胞被有效地移植到生物體中 并維持。也就是說，本發明的方法可以提供用于細胞治療的細胞群體，其可以在生物體中維 持在高濃度很長時間，并且是更有用的，可以廣泛地應用于基于T細胞的所有基因治療方法。2.本發明的細胞群體、藥物、治療方法或預防方法和用途本發明的方法生產的細胞群體是可以取決于導入的基因顯示期望的效果的細胞 群體。此外，與常規方法制備的細胞群體相比，維持了期望的基因的比例更高。例如，其中 導入了編碼識別期望的抗原的受體的基因的細胞群體對于治療多種疾病是有用的，因為它 展現了針對細胞的細胞毒性活性，所述細胞呈遞由導入的受體基因編碼的受體所識別的抗 原。雖然對于施用細胞群體的疾病沒有特別的限制，例如，癌癥(白血病、實體腫瘤等等)、 肝炎、由病毒引起的傳染性疾病(流感病毒、HIV等等)、細菌(結核分枝桿菌、MRSA、VRE等 等)、真菌(曲霉屬、假絲酵母屬、隱球菌屬等等)被指出作為實例。此外，本發明的方法生 產的細胞群體也可以用于在骨髓移植或輻射、用于緩解復發的白血病的供體淋巴細胞輸注 等等之后的傳染性疾病預防。此外，本發明提供了包含上述細胞群體作為活性成分的藥物組合物(治療試劑)。 含有細胞群體的治療試劑適用于免疫治療中。在免疫治療中，例如，經由穿靜脈的、穿動脈 的、皮下的、腹膜內的等的注射或滴注，施用適合于患者的治療的T細胞。在上述疾病或供 體淋巴細胞輸注的運用中，所述治療試劑是極其有用的。根據藥物領域中公知的方法，通 過與適合于胃腸外施用的公知的有機或無機載體、稀釋劑、穩定劑等等混合作為活性成分 的本發明的方法制備的T細胞群體，所述治療試劑可以被制備為，例如，滴注試劑或可注射 的。注意的是，本發明的細胞群體在治療試劑中的含量、治療試劑的劑量和治療試劑的條 件可以根據公知的免疫療法適當地確定。例如，雖然對藥物中本發明的T細胞群體的含量 沒有特別的限制，例如，其可以是優選的ι χ IO3到1 X IO11個細胞/mL、更優選的1 X IO4到 IX IOltl個細胞/mL，再更優選的IX IO5到IX IO9個細胞/mL。此外，雖然對本發明的藥物 的劑量沒有特別的限制，例如，其可以是對于成年人優選的IXlO6到IXlO12個細胞/天、 更優選的IXlO7到5X IO11個細胞/天，再更優選的IX IO8到2X IO11個細胞/天。此夕卜， 可以使用用所述治療試劑的免疫療法與通過施用公知藥物的藥物治療或通過放射治療或 外科手術的治療的組合。此外，本發明提供了包含所述細胞群體作為活性成分的診斷試劑。例如，通過用本 發明的診斷試劑分析和篩選獲自患者的細胞，容許對治療效果、有效轉基因的選擇等等的 推斷。本發明進一步提供了疾病的治療方法或預防方法，包括向受試者施用有效量的通 過上述方法獲得的細胞群體。雖然對此處的受試者沒有特別的限制，優選的，患有上述疾病 的生物體(例如，人類患者或非人動物)被指出，為所述疾病施用本發明的方法制備的T細 胞群體。注意的是，含有其中導入了編碼T細胞受體的基因的細胞群體作為活性成分的本 發明的治療試劑，被施用給表達HLA分子的受試者，所述HLA分子相同于所述細胞群體表達 的HLA分子、或具有與所述細胞群體表達的HLA分子的最多三個基因座錯配。此外，此處的有效量是T細胞群體的數量，與沒有施用所述T細胞群體的受試者 相比，當所述T細胞群體被施用給受試者時所述數量發揮治療或預防效果。雖然具體的有 效數量可能取決于劑型、施用方法、使用目的、受試者的年齡和體重、癥狀等等而變化，優選 的，它是類似于上文所述的藥物的。施用方法也沒有限制，但是，類似于上述藥物，例如，通 過滴注、注射等等的施用是優選的。
此外，通過提供用至少一種刺激因子刺激的、通過如上所述的本發明的生產方法 獲得的細胞群體，本發明可以生產含有活化的T細胞的細胞群體，所述至少一種刺激因子 選自由具有呈遞抗原的能力的細胞、呈遞抗原的細胞、抗原、CD3配體、CD28配體、細胞因 子、趨化因子或具有生產細胞因子能力的細胞構成的組。此外，本發明提供了通過上述生產 方法獲得的細胞群體。含有上述獲得的活化的T細胞的細胞群體可以用作藥物組合物的 活性成分，類似于上述生產方法獲得的T細胞群體。在此，對刺激因子的刺激沒有特別的限 制，只要它是如下刺激，在其中通過所述刺激因子、本發明的生產方法獲得的上述細胞群體 被活化，但是，例如，刺激可以通過在同時存在本發明的生產方法獲得的T細胞群體和所述 刺激因子的情況下進行培養來提供。在本說明書中，對具有呈遞抗原的能力的細胞沒有特別的限制，只要它是一般被 用作抗原呈遞細胞的細胞，但是，例如，樹突狀細胞、Y S T細胞、單核細胞、B細胞、T細胞、 巨噬細胞、成纖維細胞、郎格罕氏細胞和含有至少一種上述細胞的細胞群體，以及特別優選 的，樹突狀細胞、Y S T細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞和含有至少一種上述細胞 的細胞群體被提出作為實例。此外，雖然具有呈遞抗原的能力的細胞的來源可以是對于要 施用的患者是自體的或非自體的，自體的來源是優選的。在此，具有呈遞抗原的能力的細胞 是指具有呈遞抗原的能力的細胞，而不是呈遞著抗原的細胞。在本說明書中，作為呈遞著抗原的細胞，可以使用已經人工添加了合適的抗原的、 具有呈遞上述抗原的能力的細胞，其中被導入基因以表達抗原的細胞，或采集自生物體、已 經呈遞著抗原的細胞的任一。在本說明書中，對呈遞的抗原沒有特別的限制，只要它容許肽被呈遞在抗原呈遞 細胞上或被T細胞識別，容許T細胞被有效地活化，但是，例如，肽、糖肽、腫瘤細胞提取物、 腫瘤細胞超聲降解物和腫瘤細胞熱水提取物、來自病毒的核酸(DNA和RNA)等等、細菌、蛋 白質等等，被指出作為實例。此外，在此，提及的⑶3配體和⑶觀配體被指出作為⑶3配體和⑶觀配體的實例。 注意的是，通過向通過本發明的生產方法獲得的細胞群體提供抗CD3抗體和抗CD^抗體的 共同刺激，可以制備具有細胞因子生產能力的活化的淋巴細胞群體。在本說明書中，細胞因子沒有特別的限制，只要它可以作用于和活化T細胞，然 而，例如，IL-2、IFN-γ、TGF-β、IL-15、IL-7、IFN-α、IL-12、CD40L、IL-27 等等被指出作 為實例，從增強細胞免疫的角度來看，IL-2.IFN-Y和IL-12特別優選地被指出作為實例。在本說明書中，對趨化因子沒有特別的限制，只要它作用于T細胞并展現遷移活 性，然而，例如，RANTES、CCL2UMIPl α ,MIPl β、CCL19、CXCL12、IP-IO 和 MIG 被指出作為實 例。在本說明書中，對具有產生細胞因子的能力的細胞沒有特別的限制，只要它是具 有產生細胞因子的能力的細胞，但是，例如，從增強細胞免疫的角度來看，Thl細胞被指出作 為實例。通過向通過本發明的生產方法獲得的T細胞群體添加抗原刺激，容許有用的抗原 特異性CTL的誘導，具有極高的細胞毒性活性和高抗原識別能力。此外，除了上述刺激因子 之外，培養可以在存在上述纖連蛋白、其片段或其混合物、或用于T細胞的培養的已知組分 的情況下進行。在本發明中生產的T細胞群體可以在生物體中長時間存活，是具有高治療12效果的極其有用的T細胞群體。注意的是，在本說明書中，細胞或細胞群體的生產與細胞或細胞群體的培養是同 義的，是指一種過程，其包括細胞或細胞群體的誘導(活化)、維持、擴增的每個步驟，或組 合了這些步驟的步驟。實施例以下，將通過給出實施例來更具體地描述本發明；然而，本發明不僅僅限于以下實 施例。此外，在本說明書中描述的操作之中，基礎的操作是根據在ColdSpring Harbor Laboratory, 2001 出片反白勺、T. Maniatis 入 IS 胃白勺 Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed.中描述的方法。實施例1 用ZsGreen表達逆轉錄病毒載體的轉導的細胞的制備(1)病毒載體的制備ZsGreen表達逆轉錄病毒載體如下制備首先，使用具有SEQ ID 1的核苷酸序列 的A2引物和具有SEQ ID 2的核苷酸序列的ZsGreen引物，用pZsGreen (Clontech制造的) 作為模板進行PCR，獲得含有編碼hGreen的區域的擴增片段。這個片段插入到文獻(Gene Therapy，February 21st，2008，online edition (PMID : 18288212))中描述的人類 T 細胞受 體表達載體MS-Wa的TCR受體β亞基基因的下游來獲得pMS-abZ。(2)生產者細胞的制備從用 Retrovirus Packaging Kit(Takara Bio Inc.，Shiga, Japan 制造的)中含 有的質粒pGP和pE-eco、以及pMS-abZ轉化的細胞制備嗜親性逆轉錄病毒。在生產者 細胞PG13(ATCC# :CRL-10686)用獲得的嗜親性逆轉錄病毒感染三次之后，通過限制性稀釋 來選擇克隆來獲得MS-abZ生產細胞。(3)病毒溶液的制備在從MS-abZ生產細胞系的培養物除去上清液之后，用5mL的PBS (磷酸鹽緩沖鹽 水)洗滌樣品一次，MS-abZ生產細胞在室溫下用1. 5mL胰蛋白酶/EDTA處理一分鐘，懸浮 在含有10%胎兒牛血清和50單位/mL青霉素-50 μ g/mL鏈霉素的DMEM中。以5X IO6細 胞每一個Φ IOOmrn平皿(Iwaki制造的)進行接種。在培養M小時之后，除去培養物上清 液，將含有5mM 丁酸鈉的SmL新鮮培養基添加到平皿中。進一步進行培養M小時，回收上 清液，用0. 45 μ m濾器過濾，保存在_80°C。這種上清液用作隨后的實驗中的MS-abZ病毒溶 液。(4)hGreen轉導的細胞的制備在PBS中溶解纖連蛋白片段(ItetroNectin，Takara Bio Inc.制造的)達到25 μ g/ mL，抗 CD3 抗體(0KT3, Janssen Pharmaceutical K. K.)達至Ij 5 μ g/mL。以 0. 4mL/ 反應孑L 添加這種溶液到組織培養物處理的12孔平板中，容許在室溫保持5小時。此后，除去溶液， 以ImL/孔用PBS洗滌平板兩次，然后，通過添加ImL/孔的RPMI 1640并洗滌平板，獲得纖 連蛋白片段/抗⑶3抗體固定的平板。此外，作為轉導方法的陽性對照，在轉導時將細胞重 新平板接種到另一個轉導病毒結合平板上的方法(RN結合方法)中所使用的用于細胞的平 板，如下制備。纖連蛋白片段/抗⑶3溶液以1. 2mL/孔添加到組織培養物處理的6孔平板 中，容許在室溫下保持5小時。此后，除去溶液，以2mL/孔用PBS洗滌平板兩次，然后，通過添加2mL/孔的RPMI 1640來洗滌平板，獲得纖連蛋白片段/抗CD3抗體固定的平板。在RN結合方法中使用的平板如下制備纖連蛋白片段溶于PBS中達到20μ g/mL，這個溶液以ImL/孔添加到未用組織培養 物處理的12孔平板，容許在4°C保持過夜。在除去溶液之后，PBS (2mL/孔)用于洗滌平板 兩次，3mL兩倍稀釋的MS-abZ病毒溶液添加到反應孔，在32°C、2000Xg進行離心2小時。 在離心之后，除去病毒溶液，含有1.5%人血清白蛋白(HSA)的PBS(3mL/孔)洗滌平板兩次 來制備病毒結合平板。在含有1 % 自體血菜、600IU/mL IL_2、0. 2 % HSA 和 2· 5 μ g/mLFungizone 的 GT-T503培養基(Takara Bio Inc.制造)中懸浮人類外周血單核細胞(PBMC)以達到 0. 3X IO6個細胞/mL，這個懸浮液添加到纖連蛋白片段/抗⑶3抗體固定的平板上，獲得 0. 75mL/cm2來啟動培養。轉導操作如下進行。在細胞平板接種到纖連蛋白片段/抗CD3抗體固定的平板上 之后，在第0天、第1天和第2天將MS-abZ病毒溶液添加到每個反應孔以稀釋兩倍，容許保 持、或在1000 Xg離心1小時，進一步按原樣培養直到第3天。在第3天，回收細胞，制備來 獲得2 X IO5個細胞/mL，2mL的這種細胞懸浮液重新平板接種到M孔平板上，在(X)2孵化器中培養。相反，在RN結合方法中，在存在纖連蛋白片段/抗CD3抗體的情況下培養了 3天 的PBMC，被制備來分別獲得1 X IOVcm2和2 X IO6個細胞/mL，2mL的這種細胞懸浮液添加到 病毒結合平板。平板在32°C、1000Xg離心10分鐘之后，在37°C在CO2孵化器中進行培養 4小時。制備培養的細胞，以獲得2X IO5個細胞/mL，2mL的這種細胞懸浮液平板接種到M 孔平板，在CO2孵化器中培養。在PBMC培養開始的第7天回收培養的細胞，以hGreen陽性細胞的比例來測量基 因轉移效率。基因轉移效率的測量結果在附圖1中示出。對于基因轉移效率，在從培養開始的 第1天添加病毒溶液的樣品中觀察到提高，在第2天添加溶液的樣品中有更多的提高。此 外，當在添加病毒溶液之后增加離心操作時，基因轉移效率進一步提高。實施例2 重復轉導的作用(I)AcGFP表達病毒載體的制備AcGFP表達載體MT-AcGFP如下制備首先，利用具有SEQ ID 3的核苷酸序列的 AcGFP5引物和具有SEQ ID 4的核苷酸序列的AcGFP3引物，用pIRES2_AcGFP 1 (Clontech 制造的)作為模板進行PCR來獲得擴增片段。將這個片段插入到pMT載體[在Gene TherapyVolume 7，pp797-804(2000)中描述的 pM 載體]的 MluI-BglII 位點來制備 pMT-AcGFP。(2)生產者細胞的制備從用 Retrovirus Packaging Kit (Takara B io Inc. , Shiga，Japan 制造的)中含 有的質粒pGP和pE-eco、以及pMT-AcGFP轉化的細胞制備嗜親性逆轉錄病毒。在用獲 得的嗜親性逆轉錄病毒感染生產者細胞PG13(ATCC# :CRL-10686)三次之后，通過限制稀釋 獲得幾個克隆。根據通過實時PCR測量培養物上清液中病毒RNA的數量的結果選擇克隆， 與上清液接觸的培養細胞的AcGFP表達數量的測量結果充當指示物，來獲得MT-AcGFP生產細胞。(3)病毒溶液的制備用與實施例1(3)相似的方法制備表達AcGFP的逆轉錄病毒。獲得的上清液用作 隨后的實驗中的MT-AcGFP病毒溶液。(4) AcGFP轉導的細胞的制備如實施例1(4)中描述的，纖連蛋白片段/抗⑶3抗體溶液以1.2mL/孔添加到組 織培養物處理的6孔平板，容許在室溫保持5小時。此后，除去溶液，用PBS洗滌平板兩次 (2mL/孔)，然后，通過添加aiiL/孔的RPMI1640來洗滌平板，獲得纖連蛋白片段/抗⑶3抗 體固定的平板。在含有1 % 自體血菜、600IU/mL IL_2、0. 2 % HSA 和 2· 5 μ g/mLFungizone 的 GT-T503培養基(Takara Bio Inc.制造的)中懸浮PBMC以獲得0. 3X IO6個細胞/mL，這 種懸浮液添加到纖連蛋白片段/抗⑶3抗體固定的平板以獲得0. 75mL/cm2。(5)轉導操作在將細胞平板接種到纖連蛋白片段/抗CD3抗體固定的平板上之后，在第2天將 MT-AcGFP病毒溶液添加到反應孔以稀釋兩倍，在1000 Xg離心一小時，培養直到第3天。此 外，在進行第二次轉導操作的條件中，重復與第3天的相類似的操作。在第3天，如果轉導 操作進行一次或兩次，分別在第3天或第4天回收細胞，并制備來獲得2 X IO5個細胞/mL， 其中2mL重新平板接種到M孔平板上并在CO2孵化器中培養。在從PBMC培養開始的第8天，回收培養的細胞，以AcGFP陽性細胞的比例來測量 基因轉移效率。基因轉移效率的測量結果在附圖2中示出。對于AcGFP陽性率，在纖連蛋白片段 /抗⑶3抗體固定的平板的情況下，通過向同一平板重復病毒添加，觀察到基因轉移效率的提尚。實施例3 通過利用逆轉錄病毒載體的轉導的細胞的制備在PBS 中溶解纖連蛋白片段 CH-296 [RetroNectin (注冊商標)，Takara Bio Inc. 制造的]，以獲得 25 μ g/mL，溶解抗 CD3 抗體(0KT3, Janssen Pharmaceutical K. K.)以獲 得5 μ g/mL。以0. 4mL/反應孔添加這種溶液到組織培養物處理的12孔平板中，容許在室 溫保持5小時。此后，除去溶液，用0. 5mL PBS洗滌反應孔兩次，然后，用RPMI1640培養基 0. 5mL洗滌來獲得OH96/抗⑶3抗體固定的平板。在含有1 %自體血漿、600IU/ml IL-2、 0. 2% HSA 和 2. 5 μ g/mLFungizone 的 GT-T503 培養基(Takara Bio Inc.制造的)(以下由 培養基表示)懸浮人類外周血單核細胞(PBMC)以獲得0. 3 X IO6個細胞/mL，3mL的細胞懸 浮液添加到CH196/抗⑶3抗體固定的12孔平板，在37°C和5% CO2的條件下進行培養。作為對照1，在含有30ng/mL 0KT3的培養基中懸浮PBMC以獲得0. 3 X IO6個細胞 /mL, 3mL的細胞懸浮液添加到12孔平板，在37°C和5% CO2的條件下進行培養。作為對照2，0KT3以5 μ g/mL的濃度固定在組織培養物處理的12孔平板上，在培 養基中懸浮PBMC以獲得0. 3 X IO6細胞/mL，在37°C和5% CO2的條件下進行培養。作為對照3，在培養基中懸浮PBMC以獲得0. 3 X IO6個細胞/mL，懸浮抗⑶3抗體/ 抗 CD^ 抗體固相珠子(Dynabeads M450CD3/CD28T-cell Expander, hvitrogen 制造的) 以獲得0. 3 X IO6個細胞/mL，3mL的細胞懸浮液添加到12孔平板，在37°C和5% CO2的條件下進行培養。在開始培養的第2天，從每個孔除去1. 5mL的上清液，添加實施例2中制備的 1. 5mL MT-acGFP病毒溶液，在32°C、1000Xg的條件下進行轉導1小時，在第3天和第7天 進行細胞培養物溶液的稀釋，在第7天用流式細胞計作為^Green陽性細胞的比例分析基 因轉移效率。此外，在第10天，回收細胞，通過錐蟲藍染色對細胞的數目計數，10天培養的 擴增速度根據第3天和第7天的稀釋比來計算。分別地，基因轉移效率的測量結果在表1 中示出，細胞生長速度在表2中示出。表1 在每種條件下的基因轉移效率
權利要求
1.一種生產細胞群體的方法，所述細胞群體中導入了期望的基因，所述方法包括以下 的步驟(1)在含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中培養含有T細胞和/或T細胞的祖 細胞的細胞群體的步驟；和(2)向步驟(1)的容器添加攜帶所述期望的基因的載體的步驟。
2.根據權利要求1的方法，其中，在步驟O)中，所述載體是逆轉錄病毒載體。
3.根據權利要求1的方法，其中，在步驟( 中，在添加載體之后，進行物理地提高載體 和細胞之間的接觸頻率的操作。
4.根據權利要求3的方法，其中通過添加離心力或攪動所述容器的內容物物理地提高 所述載體和所述細胞之間的接觸頻率。
5.根據權利要求1的方法，進一步包括培養步驟( 中獲得的轉導的細胞群體的步驟。
6.根據權利要求1的方法，進一步包括從步驟O)中獲得的轉導的細胞群體分離期望 的亞細胞群體的步驟。
7.一種其中導入了期望的基因的細胞群體，其是可通過根據權利要求1到6的任一項 的方法獲得的。
8.—種藥物，包含其中導入了期望的基因的細胞群體作為活性成分，所述細胞群體是 可通過根據權利要求1到6的任一項的方法獲得的。
9.一種疾病的治療或預防方法，包括向受試者施用有效量的其中導入了期望的基因的 細胞群體的步驟，所述細胞群體是可通過根據權利要求1到6的任一項的方法獲得的。
10.其中導入了期望的基因的細胞群體用于生產藥物的用途，所述細胞群體是可通過 根據權利要求1到6的任一項的方法獲得的。
全文摘要
公開的是生產其中導入了期望的基因的細胞群體的方法，其特征在于包括以下的步驟(1)和(2)(1)在含有纖連蛋白或其片段和CD3配體的容器中培養含有T細胞和/或T細胞的祖細胞的細胞群體；和(2)向步驟(1)的容器添加攜帶期望的基因的載體。通過在同一容器中進行步驟(1)和(2)，可以以高效率實現基因轉移。
文檔編號C12N15/09GK102046780SQ200980119390
公開日2011年5月4日 申請日期2009年3月27日 優先權日2008年3月27日
發明者加藤郁之進, 后藤優美, 峰野純一, 戶坂泰弘, 糠谷育衛 申請人:寶生物工程株式會社