SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的制作方法
【專利摘要】本發明涉及心血管病研究領域的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫，其主要特征是以T4DNA連接經BamHI酶切質粒SV40LTag DNA及載體pcDNA3.1(-)DNA的產物，構建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子；并以Ligation Mix連接經EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經感受態細胞擴增純化和鑒定后以脂質體轉染組織細胞，經G418篩選含陽性重組子的細胞克隆并擴大培養，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產物、免疫組化染色、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT基因轉染構建的先天性心臟病房間隔缺損體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平在體外長期研究其發病機制奠定基礎。
【專利說明】SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫

【技術領域】
[0001]本發明涉及SV40LT (猴腎病毒40大T抗原基因)及hTERT (端粒酶逆轉錄酶催化亞基)基因轉染(SV40LT和hTERT介導)構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫，主要用于心血管病研究領域，為先天性心臟病房間隔缺損的體外研究提供細胞模型并保存其科研資源。

【背景技術】
[0002]先天性心臟病房間隔缺損是發病率最高的出生缺陷之一，已成為嚴重的社會問題。我國每年新發先天性心臟病11.2萬-16.0萬例，將造成經濟損失109億-156億；先天性心臟病的治療費每年高達120億元，給社會和家庭造成了嚴重的心理負擔和精神痛苦，已嚴重影響我國的人口質量，已成為社會發展的沉重負擔和可持續發展的嚴重障礙。
[0003]先天性心臟病等出生缺陷的研究及干預已成為我國政府行為，黨中央《決定》自2006年開始實施“出生缺陷干預工程”；中華人民共和國主席令《1994年10月27日第三十三號》公布我國自1995年6月I日起施行(出生缺陷)產前診斷的有關法規標準；全國人民代表大會相繼頒布了《中華人民共和國母嬰保健法》、《中華人民共和國母嬰保健法實施辦法》等一系列法規，促進了出生缺陷產前診斷、干預工作的開展；在《國民經濟和社會發展的第十一個五年規劃綱要》中強調加大出生缺陷干預力度，改善出生人口素質；在《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006-2020年)》中將出生缺陷的研究列為優先主題。
[0004]目前認為先天性心臟病房間隔缺損是遺傳和環境因素等復雜關系相互作用的結果，主要包括①.胎兒發育的環境因素:如妊娠前三個月患病毒或細菌感染尤其是風疹病毒，其次是柯薩奇病毒，其出生的嬰兒先天性心臟病的發病率較高。其它如羊膜的病變，胎兒受壓，妊娠早期先兆流產，母體營養不良、糖尿病、苯酮尿、高血鈣，放射線和細胞毒性藥物在妊娠早期的應用，母親年齡過大等均有使胎兒發生先天性心臟病的可能。②遺傳因素:多數的先天性心臟病是由多個基因與環境因素相互作用所形成。③其他因素:與地區、性別也有關系。
[0005]近年來，對先天性心臟病等出生缺陷的研究主要是針對遺傳、生物、物理、化學因素與發病(率)的關系進行流行病學方面的調查研究。但是，由于沒有可在體外長期培養的、可用于先天性心臟病發病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究先天性心臟病房間隔缺損細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制，從而嚴重限制了先天性心臟病房間隔缺損的進一步研究。
[0006]國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制。
[0007]但國外最近有研究發現,SV40Tag轉染的細胞伴隨著DNA損傷修復機制的丟失、核型的不穩定性以及少數細胞致瘤性轉化。此外，長期體外培養發現部分轉染SV40Tag的細胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數細胞會最終進入危機期(M2期)而死亡，說明細胞并未獲得永生化。同時SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發生、發展有關，因此SV40Tag轉染的細胞對某些研究也存在一定程度的限制性。
[0008]國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正常”的生長特征。可以用于人類和動物某些種類的細胞模型的建立，對借助于研究轉基因永生化細胞模型而研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制，具有重要的意義。在口腔醫學領域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數達150次以上，細胞均表現原有的生物學特性，誘導培養后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。
[0009]另有國外研究表明，人體組織細胞在體外培養時會在較短時間內死亡而無法傳代，即在進入衰老期(Ml期)前就會死亡。但猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化，可使細胞渡過Ml期后繼續存活、傳代培養20-30代，然后細胞又會進入危機期(M2期)，細胞死亡率增加并伴染色體異常，分裂的細胞逐漸減少，絕大多數細胞發生死亡。而hTERT可以維持細胞染色體端粒的穩定，從而使細胞渡過危機期(M2期)，可繼續存活、傳代達100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同時轉染人離體組織細胞建立永生化細胞系，那么SV40可以使細胞渡過Ml期，hTERT可以使細胞渡過M2期，比單獨使用其中之一建立的細胞系更穩定、壽命更長。
[0010]但是，至今尚未見有關以猴腎病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆轉錄酶催化亞基(hTERT)同時導入細胞以建立永生細胞系并以此構建可用于在體外從細胞水平研究先天性心臟病房間隔缺損發病機制的永生細胞模型及其細胞庫的文獻報道，也無法開展相關項目的研究。為了解決這一問題，本發明人提出了本發明。


【發明內容】

[0011]本發明的目的是要提供SV40LT及hTERT基因轉染(SV40LT和hTERT介導)構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，另一目的是為在體外從細胞水平研究先天性心臟病房間隔缺損的發病機制提供SV40LT和hTERT基因轉染構建的房間隔缺損細胞模型及其細胞庫。
[0012]本發明的目的是這樣實現的:以T4DNA連接經BamHI酶切質粒SV40LTag DNA及載體 pcDNA3.1 (-)DNA 的產物，構建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子；并以 Ligat1nMix連接經EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經感受態細胞擴增純化和鑒定后以脂質體轉染入先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，經G418篩選含陽性重組子的細胞克隆并擴大培養，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導先天性心臟病房間隔缺損體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平在體外長期研究其發病機制奠定基礎。
[0013]本發明以PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳提純SV40LT和hTERT，分別經基因載體pcDNA3.1 (-)DNA和pLXSNneo以脂質體轉染法導入先天性心臟病房間隔缺損細胞而構建其細胞模型，其組織細胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規的胰蛋白酶消化，以僅使引起細胞粘連的膠原被消化或使細胞懸浮，減少了細胞壁的蛋白質被消化而傷及細胞，使細胞培養的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的特定培養基，使細胞不會生長過快而影響hTERT基因的整合，也不會因缺少營養或細胞生長刺激因子而使細胞在未達到要求的匯合率、未進入對數生長期前就過早死亡，或對數生長期縮短；制備的細胞系在_196°C液氮中凍存I個月后復蘇培養，均能生長出貼壁細胞；在作細胞系染色體鑒定時，秋水仙素的用量及作用時間是常規的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計數和分析；此外，用SV40LT和hTERT同時轉染人離體組織細胞建立永生化細胞系，SV40可以使細胞渡過Ml期，hTERT可以使細胞渡過M2期，比單獨使用其中之一建立的細胞系更穩定、壽命更長。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發明制備的先天性心臟病房間隔缺損細胞模型(貼壁生長)圖。
[0015]如圖1，細胞傳代至第135代、培養至第7天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏。

【具體實施方式】
[0016]1、SV40LT和hTERT的提取:(I)酶切SV40LT和hTERT:①酶切SV40LT:從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質粒，溶解于適量的H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液、18uL H2O和限制性內切酶BamH I (l_5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應以備電泳。②酶切hTERT:hTERT位于質粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點之間，pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點。從市售購買pCIneo-hTERT質粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H2O,加入限制性內切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應，按常規PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以備電泳。(2) SV40LT和hTERT電泳:①SV40LT (SV40DNA)電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關閉電源。②hTERT電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的標準對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動，在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(30min)，關閉電源。(3) SV40LT和hTERT純化與回收:①SV40LT純化與回收:從瓊脂糖中分離出約2600bp SV40大T抗原DNA:在300_360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，在下層DNA的溶液中加入等體積酹氯仿(2個)抽提2次,上清液轉入到另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g, 4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μ I TE溶解DNA。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。②hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長波紫外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酹氯仿(2個)抽提2次,上清轉入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
[0017]2、SV40LT 和 hTERT 分別與載體 pcDNA3.1 和 pLXSNneo 構建重組子:(I) SV40LT/pcDNA3.1重組子的構建:取9 μ I上述DNA成份(0.1-5 μ g)、10 μ 12X連接緩沖液、1μ 110mmol/L ATP、T4DNA連接酶(20?500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1 空載體混合，15°C溫育 24h，構建成 SV40LT/pcDNA3.1 重組子。(2) pLXSNneo-hTERT重組子的構建:取9 μ I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ 110mmol/L ATP、1ulLigat1n Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15 °C溫育24h，構建pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0018]3、重組子的純化、擴增、鑒定:(I) SV40LT/pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定:①大腸桿菌感受態的制備:其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌，本法適用于大多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養物，轉到一個含有10mlLB培養基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2?3h(旋轉搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值^ 0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒數培養液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以1ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心1min,以回收細胞，倒出培養液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養液流盡，每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，_70°C貯存備用，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200 μ I轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物(體積彡10 μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物,在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養基，用水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每個90mm平板可達200 μ I)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的SOB培養基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養，12?16h后可出現菌落。②重組子的篩選、擴增與提取:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養基或豐富培養基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養基)中，培養過夜后，再加入到500mL含LB培養基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養至飽和狀態(OD6c4，為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在_20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入211^70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。③重組子的鑒定:上述從感受態大腸桿菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(2) pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定:①大腸桿菌感受態的制備:其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌，本法適用于大多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養物，轉到一個含有10mlLB培養基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2?3h (旋轉搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值& 0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒數培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以1ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心1min,以回收細胞，倒出培養液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養液流盡，每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存備用。②以感受態大腸桿菌純化和擴增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中分別取200 μ I轉移到無菌的微量離心管中，在每管中加DNA或連接反應混合物(體積< 10 μ 1，DNAS 50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ I SOC培養基，用水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每90mm平板可達200μ I)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的SOB培養基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養，12?16h后可出現菌落。③篩選、擴增重組子:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養基或豐富培養基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養基)中，培養過夜后，再加入到500mL含LB培養基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養至飽和狀態(0D_ ^ 4，為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4°C，6000g離心lOmin，用4nL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在_20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin，于室溫，1500g離心1minJPA 2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。④重組質粒的鑒定與擴增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養基中，37°C，250r/min搖床中培養，14h后收集培養物，4°C、10000r/min離心5min,按試劑盒說明書小量提取并純化重組質粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質粒反應體系:限制性內切酶各0.5ul、10Xbuffer2ul、重組質粒1ul、加水補足至20ul，37°C酶切Ih。酶切產物于80V電壓條件下進行0.8%瓊脂糖電泳，時間30min，凝膠成像系統拍照；按常規測定重組質粒的序列；重組質粒經酶切、測序鑒定準確后，將含有該質粒的細菌接種至LB培養液中，擴增培養，按大劑量質粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質粒抽提純化，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度后備用。
[0019]4、重組子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT導入先天性心臟病房間隔缺損細胞及其陽性克隆的篩選:(I)先天性心臟病房間隔缺損細胞的收集與培養:以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多余、廢棄的先天性心臟病房間隔缺損患者的羊水脫落組織細胞，以細胞終濃度約為lX105/mL備用，取上述呈單個分散的細胞或經處理后成為單個分散的細胞接種于含5?10nmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養基中，置于37°C，體積分數5% C02培養箱內，細胞貼壁培養約3?4天、細胞形態為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數生長期時，即考慮收集培養細胞，先吸干凈培養瓶中的培養液，加入l-2ml0.01%的膠原酶II液或胰酶(以消化液能覆蓋整個瓶底為準)，靜置2-10min (顯微鏡下動態監測)，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養液，用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，使成細胞懸液，離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導入。(2)重組子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT導入先天性心臟病房間隔缺損細胞:方法1:選用脂質體轉染法，取上法分離所得細胞的2X 15個細胞接種于35mm培養皿中，在37°C CO2培養箱培養24?36h，使細胞生成單層、細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于剛進入對數生長期時，即可轉染SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT。在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將重組子SV40LT/pcDNA3.1溶于50 μ I無血清培養液中；管B，將重組子pLXSNneo-hTERT溶于50 μ I無血清培養液中；管C，將20 μ I脂質體Lipofectamine溶解于80 μ I無血清培養液中，管Α、管B和管C混勻，置室溫下45min。吸去上述細胞培養液后，用無血清培養液洗滌細胞2次，在LipOfectamine-SV40LT/pcDNA3.1和Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml無血清培養液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養皿內，然后加入Iml無血清培養液，在CO2培養箱培養10h，吸出轉染液，加4ml完全培養液繼續培養16h，棄去培養液，更換濃度為400mg° Γ1的G418培養液繼續培養，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培養后再加大G418濃度到800mg° L—1，將能在高濃度的G418環境中穩定生長的克隆進行傳代擴增。方法2:吸取1/10-1/40細胞懸液，配制成終濃度為IX 105/mL細胞懸液，接種于培養瓶內，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養基，其中含20mL/L胎牛血清、lOnmol/L胰島素，培養48h后，使細胞生成單層、細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數生長期時，采用脂質體轉染的方法，將重組子pLXSNneo-hTERT和SV40LT/pcDNA3.1轉染至先天性心臟病房間隔缺損細胞內，用含700mg/L G418的培養液篩選lw，將G418濃度改為300mg/L，至出現陽性克隆，將其轉移至新培養瓶進行擴大、傳代培養；方法3:將上述細胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養液配成5X 108/L終濃度的細胞懸液接種于24孔的培養板中，待細胞長至90%左右融合時用于轉染，將各含0.2μ g的重組子SV40LT/pcDNA3.1 和 pLXSNneo-hTERT，分別用 DMEM 或 RPMI1640 調整體積為 50 μ 1，室溫放置5min ;脂質體15 μ 1，用DMEM調整體積為50 μ 1，然后室溫放置5min，將上述試劑輕輕混勻，然后室溫放置20min，將24孔板內的細胞用DMEM洗3次，每孔加入培養液100 μ I后，再加入 Lipofectamine_SV40LT/pcDNA3.1 和 Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT 混合物輕輕在細胞表面鋪均勻后，于37°C 5% C02培養箱放置6h，隨后用0.01g/L膠原酶將細胞消化，轉入6孔板內，加入完全培養基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細胞長出。約1d后有單克隆細胞集落長出，挑取并置于24孔板內繼續培養，以300mg/L的G418維持并穩定傳代擴增培養。以此建立可在體外反復傳代培養的永生化先天性心臟病房間隔缺損細胞模型。
[0020]5、SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT轉染先天性心臟病房間隔缺損細胞模型的傳代擴增:收集上述經脂質體轉染法導入SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT的陽性單克隆細胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養基配成約I X 105/mL的細胞懸液，接種于數瓶20?50cm2培養瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養基，至細胞貼壁生長、匯合率達到80?85%、處于對數生長期的前期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養，如此反復傳代接種、培養，記錄代數并觀察細胞生長特點，如圖1，細胞傳代至第135代、培養至第7天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏。其中對數生長是指細胞生長速度快，細胞數量的增加與培養時間呈倍增關系，通常按常規按種細胞進行培養時，培養I?2天便可在顯微鏡下找到生長的單個細胞；4?5天時可見細胞集落，貼壁生長細胞鋪蓋培養瓶底的1/3，培養7?13天時可見貼壁生長細胞鋪蓋培養瓶底的2/3以上，甚至細胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達95?100% )，細胞光亮，無顆粒、無粗糙感等老化現象，也可據細胞計數與培養時間的關系來判斷；死亡的細胞少，每周因死亡而漂浮的細胞少于10% [通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞，因為正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經死亡，方法是每周吸取一定量的細胞培養懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數1000個細胞總數，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比]。
[0021]6、永生化先天性心臟病房間隔缺損細胞模型生物學特性的鑒定:使用SV40LT/peDNA3.1和pLXSNneo-hTERT建立的細胞模型(細胞系)，鑒定的關鍵問題有:一是要求該細胞具有持續的增殖能力；二是要求其形態、基本生理功能等保持不變。①觀察細胞形態:在倒置光學顯微鏡下每日觀察細胞是否呈典型的上皮細胞樣貼壁生長，是否呈梭形、或小園形生長。本細胞系傳代擴增培養的細胞形態與正常人成纖維細胞形態無明顯差異；②觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉染細胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細胞懸液，經計數，分別取1.4X 14細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM-培養基培養瓶。每天取2瓶細胞進行計數，計算均值，連續觀察直至細胞數量明顯下降，培養3天后每隔2天給未計數的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養基中的生長情況。結果以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸(對數)，描繪在半對數座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發明采集的原代細胞，則說明該細胞系沒有發生惡性轉化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現異常的DNA群體，如果沒有，也說明細胞系未出現瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細胞生長密度達85-95% (其中小園形細胞占10% )、處于對數生長期的培養物中按5mL培養液中加入預熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養箱4小時，吸干培養液，加入預熱的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細胞，經離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長試驗:將細胞以5X 104/ml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內，觀察三周后，未發現克隆形成，說明本實驗的永生化細胞不能在軟瓊脂內形成克隆，符合永生化特點裸鼠致瘤試驗:將永生化細胞以3X107接種裸鼠背部皮下，2個月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細胞為非惡化細胞；⑥轉染細胞hTERT mRNA表達產物測定:按試劑盒做PCR擴增后電泳，檢出hTERT mRNA條帶。如以免疫組織化學檢測，hTERT轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細胞內轉染細胞端粒酶活性:收集細胞系，按試劑盒說明制備裂解液，作PCR擴增和電泳分析，以302nm紫外光觀察結果，可見呈端粒酶陽性條帶。⑧流式細胞術檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是hTERT和SV40LT整合、表達的結果；另外以流式細胞術檢測細胞增殖周期及細胞凋亡率，本細胞系的細胞增殖指數較轉染前無明顯改變，轉染后細胞凋亡率較轉染前明顯降低轉染細胞SV40大T基因檢測:如以免疫組織化學檢測，SV40轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細胞內；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細胞中的表達，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5，-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3，;擴增產物長度為 268bp，擴增條件為 94°C，5min,即:(94°C，lmin ；55°C, lmin, -0.5°C / 循環；72°C，lmin) X 30、(94°C，30S ；40°C，30S,72°C，30S) X15，擴增體系為 50 μ 1: [Mg2+] 2mmol/L、dNTPs200 μ mol/L、引物濃度 0.4 μ mol/L、TaqlU、模板5 μ I ;實驗組以第19代細胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，產物_20°C保存)；陰性對照設兩個，分別以無菌水、原代細胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因為SV40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5μ I進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20°C保存備用)SV40大T基因mRNA表達產物測定:T抗原mRNA RT-PCR產物測序:取100 μ I體系的擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產物，取2μ I DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進行測序，符合SV40大T基因mRNA表達產物的序列。
[0022]所以，本發明的細胞模型為(I)細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發明采集的原代細胞；(4)細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；
(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中同時整合了 SV40LT和hTERT基因，同時表達SV40LT和hTERT基因的mRNA產物；(7)細胞傳代至第135代、培養至第7天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏；(8)能反復凍溶、傳代培養135代以上；(9)作為細胞模型用于體外從細胞水平研究先天性心臟病房間隔缺損的病理機制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同時整合的先天性心臟病房間隔缺損的遺傳資源。
[0023]7、SV40LT和hTERT介導先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫:篩選并擴大培養經上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞，經過消化、終止和離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細胞，細胞密度為5 X 15個/ml，加入凍存管，分裝、標注，經4°C，0.5h ；~20V,2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。以此法構建生物學特性穩定的永生化先天性心臟病房間隔缺損細胞模型及其細胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，并作為先天性心臟病房間隔缺損發病機制體外研究的細胞模型，以加速拓展先天性心臟病房間隔缺損研究的新途徑、從細胞水平在體外長期研究先天性心臟病房間隔缺損細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制。
[0024]8、細胞模型應用:先天性心臟病房間隔缺損細胞模型作為科研細胞:使先天性心臟病房間隔缺損細胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風疹病毒，巨細胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養，然后取體外長期傳代的不同周期的活細胞、傳代過程的凋亡細胞、含有傳代培養中所產生的代謝產物的培養液從不同角度和水平，對比研究先天性心臟病房間隔缺損細胞模型、正常對照細胞模型對有害物的耐受性的差異、有害物致先天性心臟病房間隔缺損的機制。例如應用常規方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態性、甲基化水平；運用原位雜交(FISH)、Northern blot,Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術檢測基因所在研究細胞模型中的基因轉率表達、定位及調控；利用酶反應學、代謝組學技術鑒定細胞模型長期傳代中蛋白質代謝過程和關鍵的代謝產物；應用雙向電泳、MALD1-T0F質譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術研究細胞模型在長期傳代中的蛋白質功能及蛋白質間的相互作用，從活細胞培養過程動態、長期研究先天性心臟病房間隔缺損細胞對環境有害因素的耐受性和適應性，例如:①環境中常見的毒性物質苯并芘致先天性心臟病房間隔缺損的研究:使先天性心臟病房間隔缺損細胞模型和對照細胞分別在含有0.1、1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培養液中培養，檢測在培養2周、4周、6周、8周、16周等不同培養時間的可作為細胞毒性指標的細胞凋亡、壞死、雙核細胞率和可作為遺傳毒性指標的微核率、核質橋率、核芽率，即在光學顯微鏡下計數10000個雙核細胞中的微核數、核質橋數和核芽數；500個活細胞中的凋亡和壞死細胞數、雙核細胞數，以及檢測細胞存活率，即應用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養液后，在96孔板上加入20 %的5mg/mlMTT的無血清培養液，繼續培養4h，小心吸棄孔內上清液，每孔加入150yL 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結晶物充分溶解，本酶標儀以490nm測定各孔的吸光度值，計算出細胞存活率。還可以其他常規實驗方法檢測不同培養時間的含毒性物與不含毒性物、先天性心臟病房間隔缺損細胞模型與正常細胞中各組細胞的基因突變、蛋白質組學、細胞分泌功能、染色體畸變、細胞存活率(壽命)等，以從活細胞培養過程中從細胞水平動態、長期研究環境有害因素對先天性心臟病房間隔缺損細胞的作用機制。②以某種病源微生物替換毒性物質苯并芘做同樣的研究，即可從活細胞培養過程中從細胞水平動態、長期研究先天性心臟病房間隔缺損細胞對生物因素的耐受性和適應性及作用機制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學物質以及細胞模型共同培養，檢測細胞培養過程壽命、基因突變、各種分子變化等，即可從活細胞培養過程中從細胞水平動態、長期研究藥物對先天性心臟病房間隔缺損的治療效果及干預效果。④同樣可用先天性心臟病房間隔缺損細胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗。⑤以細胞模型的形式保存先天性心臟病房間隔缺損者的遺傳資源。
【權利要求】
1.一種用于醫學領域的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其主要特征是以T4DNA連接經BamHI酶切質粒SV40LTag DNA及載體pcDNA3.1(-)0嫩的產物，構建5￥401^1。0嫩3.I (-)重組子；并以Ligat1n Mix連接經EcoRI和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經感受態細胞擴增純化和鑒定后以脂質體轉染導入先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，經G418篩選含陽性重組子的細胞克隆并擴大培養，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT基因轉染構建的先天性心臟病房間隔缺損體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)在體外長期研究其發病機制奠定基礎。
2.根據權利要求1所述的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所指細胞模型為(I)細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發明采集的原代細胞；(4)細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中同時整合了 SV40LT和hTERT基因，同時表達SV40LT和hTERT基因的mRNA產物；(7)細胞傳代至第135代、培養至第7天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96 %以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏；(8)能反復凍溶、傳代培養135代以上；(9)作為細胞模型用于體外從細胞水平研究先天性心臟病房間隔缺損的病理機制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同時整合的先天性心臟病房間隔缺損的遺傳資源。
3.根據權利要求1所述的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的先天性心臟病房間隔缺損患兒羊水脫落細胞構建之。
4.根據權利要求1所述的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所用的培養液為含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM培養液。
5.根據權利要求1所述的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是用作傳代培養以備脂質體轉染法導入重組子的先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，在原代擴增培養中，其收集指標是細胞貼壁培養約3?4天、細胞形態為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數生長期時收集細胞；用作脂質體轉染法導入重組子的傳代先天性心臟病房間隔缺損組織細胞，其時機選擇的指標是細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數生長期時的培養細胞；傳代細胞系收集的指標是選擇細胞貼壁生長的匯合率達80?85%、處于對數生長期的前期時收集細胞；染色體核型分析的細胞收集指標是細胞生長密度達85-95%、小園形細胞占10%以上、處于對數生長期的細胞。
6.根據權利要求1所述的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長的組織細胞，作染色體核型分析時，每5mL培養液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養箱4小時。
7.根據權利要求1所述的SV40LT及hTERT基因轉染構建房間隔缺損細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是細胞庫的構建包括(I)篩選經鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的SV40LT和hTERT基因轉染構建的先天性心臟病房間隔缺損細胞；(2)作傳代、擴大培養，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經消化、終止、離心(1200r/min，6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5X 15個/ml的細胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；-20°C,2h ;_70°C，過夜；入_196°C液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT和hTERT基因轉染構建的先天性心臟病房間隔缺損細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號】C12N5/10GK104419662SQ201310403789
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優先權日:2013年9月1日
【發明者】翁炳煥, 羅玉琴, 金帆, 黃荷鳳, 朱瑞建, 陳雁 申請人:翁炳煥