專利名稱：具有提高的活性的β-葡糖苷酶變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶的表達(dá)和優(yōu)化。更具體地，本發(fā)明涉及包 含至少一個氨基酸修飾的β-葡糖苷酶變體，這些修飾的氨基酸根據(jù)里氏木霉菌β-葡糖 苷酶的SEQ ID No. 2的編號位于第225、238、240和241位。本發(fā)明還涉及這些具有改善的 效能的變體在纖維素分解方法和生物燃料(例如乙醇、丁醇、異丙醇)的制備方法中的用 途。
背景技術(shù)：
乙醇是一種清潔燃料，并且起始原料來源廣泛，因此從纖維素制備乙醇的可能性 已經(jīng)得到了極大的關(guān)注。該方法的天然纖維素起始原料用術(shù)語“生物質(zhì)”表示。許多類型的生物質(zhì)，包括木 材、農(nóng)業(yè)廢棄物、草本作物和固體廢物，被認(rèn)為可以用作制備生物燃料的起始原料。這些原 料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維素組成。纖維素是由葡萄糖分子組成的聚合物，其中葡萄糖分子通過β 1-4鍵連接，該連 接對于酸、酶或微生物的分解或解聚作用具有很強(qiáng)的抗性。一旦纖維素轉(zhuǎn)變成葡萄糖，所述 葡萄糖就易于通過酵母發(fā)酵形成生物燃料，例如乙醇。這些將纖維素轉(zhuǎn)變成糖的傳統(tǒng)研究方法都是基于酸水解作用。這些方法可在濃酸 或稀酸存在的情況下進(jìn)行。但是，這些方法存在一些缺點，例如在使用濃酸時，酸的回收率 差，在使用稀酸時，葡萄糖產(chǎn)率低，這些都使酸水解方法不能實現(xiàn)商業(yè)化。為了克服酸水解方法的缺點，最近提出了使用纖維素型酶進(jìn)行酶水解的纖維素轉(zhuǎn) 化方法。但是酶水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)(例如纖維素)的方法也有工業(yè)生產(chǎn)成本過高的缺 點。因此，有必要使用分泌更加有效的纖維素酶的微生物株。在此方面，許多微生物含有水解纖維素的酶，例如真菌木霉菌(Trichoderma)、 曲霉菌(Aspergillus)、腐質(zhì)霉菌(Humicola)或鐮孢菌(Fusarium)，以及細(xì)菌，例如熱 單孢菌(Thermomonospora)、芽孢桿菌(Bacillus)、纖維單胞菌(Cellulomonas)和鏈霉菌 (Streptomyce)。這些微生物中的酶在用于將纖維素轉(zhuǎn)變成葡萄糖時具有三種活性類型，因 此可被分成三組內(nèi)切葡聚糖酶，隨機(jī)地作用于纖維素纖維的內(nèi)部；外切葡聚糖酶，作用于 纖維素的末端，釋放出纖維二糖；β-葡糖苷酶，將此纖維二糖水解成葡萄糖。這些葡 糖苷酶是纖維素轉(zhuǎn)化方法的限速步驟。這是因為該方法的主要困難在于纖維二糖轉(zhuǎn)化成葡 萄糖，因為在制備生物燃料時，在方法結(jié)束時任何未水解的纖維二糖代表收率的損失。由于一些產(chǎn)生纖維素酶的微生物，包括木霉菌，產(chǎn)生的β -葡糖苷酶極少，因此在 酶水解方法中纖維二糖的蓄積是一個主要的問題。具體而言，工業(yè)木霉菌株產(chǎn)生的所有蛋 白質(zhì)中，β-葡糖苷酶類型要少于1%。因此，較低的β-葡糖苷酶量導(dǎo)致將纖維二糖水解 成葡萄糖的容量較低，從而導(dǎo)致了所述纖維二糖在系統(tǒng)中的蓄積。而且，高濃度的纖維二糖 抑制了其它以纖維二糖作為最終反應(yīng)產(chǎn)物的纖維素酶，特別是外切葡聚糖酶的活性。已經(jīng)提出了幾種提高微生物中的β -葡糖苷酶活性，從而提高纖維二糖到葡萄糖的轉(zhuǎn)化率的方法。第一種方法包括加入外源性產(chǎn)生的β -葡糖苷酶到微生物分泌的混合物中，以促 進(jìn)水解。然而，該方法由于成本昂貴而沒有商業(yè)可行性。第二種方法，如WO 92/010581中描述，采用基因工程方法將新的β-葡糖苷酶基 因的拷貝插入到微生物的基因組中，如此所述微生物產(chǎn)生大量的酶。第三種方法，如WO 99/46362中描述，包括使用包含啟動子、成熟的β -葡糖苷酶 基因和木聚糖酶分泌信號序列的基因構(gòu)建物對微生物進(jìn)行遺傳修飾。木聚糖酶分泌信號序 列的存在使得可能顯著提高微生物產(chǎn)生的β-葡糖苷酶的量。然而，為了使木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解有效和有經(jīng)濟(jì)價值，該酶混合物必須由一 種并且是唯一的菌株產(chǎn)生，并且必須包括平衡比例的各種酶活性(尤其是，但不僅僅是，外 切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡糖苷酶)。舉例來說，在里氏木霉菌的天然混 合物中，一般存在70-80%的外切葡聚糖酶、15-20%的內(nèi)切葡聚糖酶、數(shù)個百分比的半纖維 素酶和約0.5%的β-葡糖苷酶。該混合物完全適合水解大多數(shù)的預(yù)處理的底物(例如，在 酸性條件下蒸汽爆破(steam-explode)處理的麥稈)，并且收率可以接受。總之，如果通過 富集酶的量以增加β -葡糖苷酶的活性，其必須不能損害其它酶的活性。因此，不顯著改變混合物中所有酶的比例而獲得高β-葡糖苷酶活性的可能性， 對于將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成生物燃料的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于這種想法，申請人公司做出了巨大的努力，通過大量的研究發(fā)現(xiàn)了分離的或 者純化的多肽，該多肽具有比野生型BGLl蛋白質(zhì)(SEQ ID No. 2)的β _葡糖苷酶活性提高 的β-葡糖苷酶活性，包含相比SEQ ID No. 2的氨基酸序列有至少一個氨基酸被修飾的氨 基酸序列，所述修飾的氨基酸選自氨基酸序列SEQ ID Νο.2的第225、238、240和241位， 所述的氨基酸序列與SEQ ID No. 2有至少75%的序列同一性，優(yōu)選與SEQ ID No. 2有至少 80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 的序列同一性。此外，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有對葡萄糖產(chǎn)生的抑制作用較不敏感的優(yōu)點，因此，在 高葡萄糖濃度的存在下維持了較好的葡糖苷酶活性。在一個實施方式中，上述多肽的特征在于與在缺乏葡萄糖時測定的野生型BGLl 蛋白(SEQ ID No. 2)的葡糖苷酶活性相比，在葡萄糖存在時測定的葡糖苷酶活性 得到了提高。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以，例如，使用底物ρηρ-吡喃葡萄糖苷通過酶活性測試確定本 發(fā)明多肽的酶活性的增加(換言之，確定多肽的酶活性的提高)。葡糖苷酶作用后獲得 的對硝基苯酚的量可以例如通過在414nm下讀取吸光度而確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員用來確定本發(fā)明的多肽相比于野生型BGLl蛋白質(zhì)是否具有提高 的酶活性的方案的實例如下-形成表達(dá)本發(fā)明多肽的大腸桿菌儲存培養(yǎng)物，在37°C下過夜。-在20°C下用的儲存培養(yǎng)物接種LB培養(yǎng)基Mh;-在13000rpm下離心2分鐘；-將細(xì)胞沉淀物用IOOmMpH 5的琥珀酸緩沖液重懸浮(OD6tltl終值為100)；
-用含有15mMpnp-吡喃葡萄糖苷的IOOmM pH 5的琥珀酸緩沖液100 μ 1在50°C 下孵育50 μ 1細(xì)胞1. 5小時，隨后在冰上孵育5分鐘；-加入0. 2Μ 的 Na2CO3 溶液 150 μ 1 ；-在13 OOOrpm下離心2分鐘；-在414nm下讀取150μ 1上清液的吸光度。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用上述方案，用含有15mM的pnp-吡喃葡萄糖苷和60g/ 1葡萄糖的IOOmM pH 5的琥珀酸緩沖液100 μ 1在50°C下孵育50 μ 1細(xì)胞1. 5小時，以確 定本發(fā)明的多肽相比于野生型BGLl蛋白質(zhì)是否對葡萄糖產(chǎn)生的抑制作用更不敏感。本發(fā)明上下文中，“修飾的”氨基酸表示“取代的”、“插入的”或“缺失的”氨基酸。根據(jù)一個實施方式，“修飾的”氨基酸為相比于SEQ ID No. 2的氨基酸序列“取代 的”氨基酸。根據(jù)一個實施方式，“修飾的”氨基酸為相比于SEQ ID No. 2氨基酸序列“插入的”
氨基酸。根據(jù)一個實施方式，“修飾的”氨基酸為相比于SEQ ID No. 2氨基酸序列“缺失的”
氨基酸。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于，與氨基酸序列SEQ ID Νο.2相比，氨基 酸序列有至少2個氨基酸是經(jīng)修飾的，所述經(jīng)修飾的氨基酸選自序列SEQ ID Νο.2的第 225,238,240 和 241 位。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于，與氨基酸序列SEQ ID Νο.2相比，氨基 酸序列的至少3個氨基酸是經(jīng)修飾的，所述經(jīng)修飾的氨基酸選自序列SEQ ID No. 2的第 225,238,240 和 241 位。根據(jù)一個實施例，上述多肽的特征在于與氨基酸序列SEQ ID No. 2相比，氨基酸 序列的至少4個氨基酸是經(jīng)修飾的，所述經(jīng)修飾的氨基酸為氨基酸序列SEQ ID No. 2的第 225,238,240和241位的氨基酸。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于與氨基酸序列SEQ ID No. 2相比，氨基 酸序列的至少1個、至少2個、至少3個或至少4個氨基酸是經(jīng)修飾的，所述修飾選自Q225H、 V238I.T240G 和 T241S。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于，與序列SEQ ID No. 2相比，1個氨基酸是 經(jīng)修飾的，所述修飾為Q225H。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于，與序列SEQ ID No. 2相比，3個氨基酸是 經(jīng)修飾的,所述修飾為V238I、T240G和T241S。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于與序列SEQ ID Νο.2相比，4個氨基酸 是經(jīng)修飾的，所述修飾為Q225H、V238I、T240G和T241S。根據(jù)一個實施方式，上述多肽也包含至少1個另外的經(jīng)修飾的氨基酸，所述氨基 酸選自氨基酸序列 SEQ ID No. 2 的位置 97、99、100、118、119、121、123、126、127、128、130、 132、134、135、140、147、151、153、163、168、173、174、177、179、182、187、193、206、207、212、 217 和 621。根據(jù)一個實施方式，上述多肽的特征在于所述另外的經(jīng)修飾的氨基酸包含一個 或者多個修飾，所述修飾選自由 V97I、Y99F、S100G、V118T、N119E、I121M、E123Q、Q126E,
6F127Y、I128L、E130A、V132A、A134G、S135C、S135V、I140L、P147A、T151I、Q153H、V163T、 T168A、G173A、G173S、Q174E、N177E、I179L、V182A、V182N、T187C、L193V、N206D、P207V、 L212M、T217L、L621F 和 L621T 組成的組。根據(jù)一個實施例方式，上述多肽選自-選自SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 14的氨基酸序列；或-氨基酸序列SEQID No. X，其具有i)相對于SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14的長度，至少70 %同一性，優(yōu)選75 %、 80%、85%、90%、95%、98%或99%的相同殘基百分比；ii)相對于 SEQ ID No. X 的長度，至少 70% 同一性，優(yōu)選 75%、80%、85%、90 %、 95%、98%或99%的相同殘基百分比。本發(fā)明的氨基酸序列的變體可通過多種常規(guī)方法制備，例如用本文中出現(xiàn)的全部 或部分核苷酸或肽序列進(jìn)行隨機(jī)誘變、定點誘變、基因合成或改組。這些變體包括，例如，酶 的氨基酸序列中的殘基的缺失和/或插入和/或取代。本發(fā)明涉及從本文中出現(xiàn)的序列 獲得的任何變體，只要所述氨基酸序列的變體與Bgl-I相比保持提高的β -葡糖苷酶功能 (定義如上)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由于實用原因以下稱為SEQ ID No. X的氨基酸序 列，當(dāng)其與SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14排比時，包括a)相對于SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14的長度，至少70 %同一性，優(yōu)選75 %、 80%、85%、90%、95%、98%或99%的相同殘基百分比；和b)相對于 SEQ ID No. X 的長度，至少 70 % 同一性，優(yōu)選 75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%或99%的相同殘基百分比。根據(jù)本發(fā)明，相對于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的長度的相同殘基百分比對 應(yīng)于在SEQ ID No.X和SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14之間相同的殘基數(shù)目除以SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14中的殘基數(shù)目。當(dāng)使用GenomeQuest數(shù)據(jù)庫時，所述相對于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的長度的相同殘基百分比對應(yīng)于查詢(Query)同一性百分比(％ id Query)，其中查詢對應(yīng)于序列SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14。根據(jù)本發(fā)明，相對于SEQ ID No. X的長度的相同殘基百分比對應(yīng)于在SEQ ID No.X 和SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14之間相同的殘基數(shù)目除以SEQ ID No. X中的殘基數(shù)目。當(dāng) 使用GenomeQuest數(shù)據(jù)庫時，所述相對于SEQ ID No. X的長度的相同殘基百分比對應(yīng)于目 標(biāo)(Subject)同一性百分比(% id Subject)，其中目標(biāo)對應(yīng)于SEQ ID No.X。本發(fā)明的主題也在于編碼至少一種上述的多肽的純化的或分離的核酸。下表1包 括對Bgl-I基因和基因A和C、以及本發(fā)明的多肽的核酸和多肽序列的鑒定。表 權(quán)利要求
1.一種與野生型BGLl蛋白(SEQ ID No. 2)的β-葡糖苷酶活性相比具有提高的β-葡 糖苷酶活性的分離的或純化的多肽，其特征在于它含有一種氨基酸序列，其中至少一個氨 基酸與氨基酸序列SEQ ID No. 2相比是經(jīng)修飾的，所述經(jīng)修飾的氨基酸選自氨基酸序列SEQ ID No. 2的第225位、第238位、第240位和第241位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于與所述氨基酸序列SEQID No. 2相比，所述 氨基酸序列的至少一個氨基酸是經(jīng)修飾的，所述修飾選自Q225H、V238I、T240G和T241S。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于所述多肽還包含至少一個另外的經(jīng)修 飾的氨基酸，所述修飾的氨基酸選自氨基酸序列SEQ ID No.2的位置97、99、100、118、119、 121、123、126、127、128、130、132、134、135、140、147、151、153、163、168、173、174、177、179、 182、187、193、206、207、212、217 和 621。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的多肽，其特征在于所述多肽還包含至少一個另外 的經(jīng)修飾的氨基酸，所述修飾選自:V97I、Y99F、S100G、V118T、N119E、I121M、E123Q、Q126E、 F127Y、I128L、E130A、V132A、A134G、S135C、S135V、I140L、P147A、T151I、Q153H、V163T、 T168A、G173A、G173S、Q174E、N177E、I179L、V182A、V182N、T187C、L193V、N206D、P207V、 L212M、T217L、L621F 和 L621T。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的分離的或純化的多肽，其特征在于所述多肽選自選自 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14的氨基酸序列；或-氨基酸序列SEQ ID No. X，其具有i)相對于SEQ ID No. 4、6、8、10、12 或 14 的長度，至少 70%，優(yōu)選 75%、80%、85%、 90%、95%、98%或99%的相同殘基百分比；ii)相對于SEQ ID No. X 的長度，至少 70%，優(yōu)選 75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99%的相同殘基百分比。
6.一種純化的或分離的核酸，其特征在于其編碼權(quán)利要求1-5中任一項所述的至少一 種多肽。
7.一種載體，其特征在于其包含權(quán)利要求6所述的核酸。
8.一種分離的宿主細(xì)胞，其特征在于它包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的至少一種多 肽，或包含權(quán)利要求6所述的至少一種核酸，或包含權(quán)利要求7所述的至少一種載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的宿主細(xì)胞、其特征在于其選自木霉菌屬、曲霉菌屬、 脈孢菌屬、腐質(zhì)霉菌屬、青霉菌屬、鐮孢菌屬、熱單孢菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏 菌屬、梭菌屬、纖維單胞菌屬、鏈霉菌屬、亞羅酵母屬、畢赤酵母和酵母屬。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的分離宿主細(xì)胞，其特征在于其選自里氏木霉菌，綠色 木霉菌，康氏木霉菌，黑曲霉菌，構(gòu)巢曲霉菌，文氏曲霉菌，米曲霉菌，海棗曲霉菌，粗糙脈孢 霉菌，灰色腐殖霉菌，嗜松青霉菌，草酸青霉菌，大腸桿菌，丙酮丁醇桿菌，解糖梭菌，拜氏梭 菌，丁酸梭菌及其混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的多肽用于β-寡糖的水解的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的多肽用于將纖維二糖水解成葡萄糖的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的多肽用于制備生物燃料的用途。
14.一種對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)起作用的酶組合物，所述酶組合物是由絲狀真菌產(chǎn)生的， 而且包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的至少一種多肽。
15.一種從生物質(zhì)制備生物燃料的方法，其特征在于它包括以下步驟 -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相中；-加入權(quán)利要求14所述的對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)起作用的酶組合物，以開始水解； -測定釋放的糖；-分離糖溶液與未水解的固體部分； -發(fā)酵糖溶液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
16.一種從生物質(zhì)制備生物燃料的方法，其特征在于它包括以下步驟 -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相中；-同時加入權(quán)利要求14所述的對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)起作用的酶組合物和發(fā)酵生物體； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
全文摘要
本發(fā)明涉及與木質(zhì)纖維素生物質(zhì)分解有關(guān)的酶的表達(dá)和優(yōu)化。更具體地，本發(fā)明涉及包含至少一個氨基酸修飾的β-葡糖苷酶變體，這些修飾的氨基酸根據(jù)里氏木霉菌β-葡糖苷酶的SEQ ID No.2的編號位于第225、238、240和241位，本發(fā)明還涉及具有改善的效能的這些變體在纖維素分解方法和生物燃料的制備方法中的用途。
文檔編號C12N15/81GK102149819SQ200980136701
公開日2011年8月10日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者于格·馬蒂, 安東尼·馬爾若, 尼古拉斯·洛普·費(fèi)雷拉, 洛朗·富拉熱 申請人:Ifp新能源公司, 普羅托斯公司