專利名稱：一種芽孢桿菌及采用該菌種生產透明質酸酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌及用該芽孢桿菌生產透明質酸酶的方法，屬于生物發酵技術領域。
背景技術：
透明質酸酶是能夠降解透明質酸的一類酶，Karl Meyer根據透明質酸酶的作用機制，將透明質酸酶分為三類(1)內切β_Ν-乙酰氨基葡糖苷酶為水解酶，作用于β_1，4糖苷鍵，終產物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉糖苷酶活性，睪丸、蜂毒以及溶酶體透明質酸酶屬于此類。(2)水蛭、十二指腸蟲來源的透明質酸酶，為內切β-葡糖苷酸酶，作用于β _1，3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產物是四糖，特異性降解透明質酸。(3)細菌透明質酸酶，也稱透明質酸裂解酶，作用于β_1，4糖苷鍵。目前市場上的透明質酸酶主要是動物來源的透明質酸酶，用于人體暫時降低細胞間質的粘性，可促使皮下輸液、局部積貯的滲出液或血液加快擴散而利于吸收，為一種重要的藥物擴散劑。臨床用作藥物滲透劑，促進藥物的吸收，促進手術及創傷后局部水腫或血腫消散。由于動物來源的透明質酸酶成本高，而且人們擔心動物病毒感染的風險，多家提取法制備透明質酸酶制劑的廠家已停止該制劑的生產，人們希望使用更安全價廉的透明質酸酶。微生物來源的透明質酸酶不受來源限制，提取容易，純度高，不易產生免疫反應，可以滿足人們的這種需求，因此多家研究機構致力于研究微生物發酵法制備透明質酸酶。自透明質酸酶發現以來，人們發現多種微生物可以產生透明質酸酶，包括 Streptococcus、Staphylococcus、Clostridium、Propionibacterium^ Peptostreptococcus 以及Streptomyces等，但是迄今為止，文獻中報道的微生物產的透明質酸酶酶活均較低， 較高的酶活報道出現在專利W02010130810A1中，該專利中透明質酸酶生產菌是鏈霉菌，最高酶活是1. 3 X 102IU/ml，其余文獻的酶活均低于100IU/ml，因此制備透明質酸酶及酶法制備低分子透明質酸及寡聚透明質酸都處于實驗室規模，不能用于大規模生產。

發明內容
為了解決現有透明質酸酶生產工藝少，且所得的透明質酸酶酶活低的問題，本發明提供了一種生產高活性透明質酸酶的菌種——芽孢桿菌OfeciBm )A50。本發明還提供了采用該芽孢桿菌OfeciBm) A50生產透明質酸酶的方法，以該菌種生產透明質酸酶，酶活高，可用于大規模生產，并且解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，便于大規模工業化生產。所得的透明質酸酶可用于降解高分子透明質酸，生產低分子透明質酸及寡聚透明質酸，應用前景廣闊。本發明的芽孢桿菌(ifeciBm) A50是從空氣中分離得到，因為無法重復得到，所以該菌種已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，保藏號為CGMCC NO. 5744，保藏時間為2012年2月8日。
菌種芽孢桿菌UaciBm)A50 CGMCC NO. 5744的獲取過程為將裝有富集培養基的平皿打開蓋，放置于空氣中，收集空氣中沉降菌，約1小時后，蓋上蓋，置于25 40°C 培養箱中有氧培養，培養M小時后，將分離得到的單菌落接種于篩選培養基中，25 40°C， 150rpm，有氧培養12 16小時，采用中國藥典方法測定透明質酸酶活力，選擇酶活力最高的菌種作為本發明的菌種，菌種酶活力可達IO5 IU/ml。上述所采用的各培養基組成如下
富集培養基(IOOml)蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉0. 2 2. Og, K2HPO4 · 3H20, MgSO4 · 7H20 0. 05 0. 15g、透明質酸鈉 0.01 ~ Ig,瓊脂粉 2g。篩選培養基(100ml):蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉 0. 2 2. 0g，K2HPO4 ·3Η20 0. 05 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. 05 0. 15g，透明質酸鈉 0. 01 Igo篩選所得的芽孢桿菌UaciBm)A50 CGMCC NO. 5744具有如下的特征 1、形態特征
菌體桿狀，單個或鏈狀。菌落乳白色，有皺褶。2、分子生物學特征
菌種A50的16S rDNA序列如SEQ NO: 1所示。本發明菌種適于在25、0°C下進行有氧培養，該菌種可以用來生產透明質酸酶，方法是將芽孢桿菌CGMCC No. 5744經斜面培養、種子培養、發酵培養制得透明質酸酶。具體包括以下步驟
(1)將芽孢桿菌CGMCC No. 5744菌種進行斜面培養，得斜面菌種；
(2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 40°C、100 200rpm的條件下培養10 Mh，得種子液；
(3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 40°C、100 300rpm的條件下培養12 Mh，得透明質酸酶。上述生產透明質酸酶的方法中，每100ml斜面培養基中含有以下成分蛋白胨 0. 2 2. 0g，酵母粉 0. 2 2. 0 g, K2HPO4 ·3Η20 0. 05 0. 15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. 15 g，葡萄糖0. 5 1. 5 g，瓊脂粉2g，pH調至6. 0 8. 0，斜面培養的溫度為25 40°C。上述生產透明質酸酶的方法中，每100ml種子培養基中含有以下成分蛋白胨 0. 2 2. 0g，酵母粉 0. 2 2. 0 g, K2HPO4 ·3Η20 0. 05 0. 15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. 15 g，葡萄糖0. 5 1. 5 g, pH調至6. 0 8. 0。上述生產透明質酸酶的方法中，每100ml發酵培養基中含有以下成分蛋白胨 0. 2 2. Og,酵母粉 0. 2 2. 0 g, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15 g, MgSO4 · 7H20 0. 05 0. 15 g，葡萄糖 0. 5 1. 5 g，吐溫 80 0. 05ml，pH 調至 6. 0 8. 0。上述生產透明質酸酶的方法中，斜面種子培養和發酵培養的接種量可以通過現有技術得到，不需付出創造性的勞動。種子培養基的接種量能夠達到發酵培養所需接種量的種子液即可，發酵培養基的接種量一般在3-15%即可。上述生產透明質酸酶的方法中，可采用鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或一種以上調節斜面培養基、種子培養基和發酵培養基PH。本發明提供了一種高活性的芽孢桿菌菌種，該菌種是從空氣中富集、篩選而來的， 可用于生產透明質酸酶，在現有技術中未見報道。該芽孢桿菌所產生的透明質酸酶活性高，可達到105IU/ml，與現有技術相比，采用本發明中的芽孢桿菌制備的透明質酸酶活性高， 熱穩定高，PH穩定性高，可用于大規模生產，同時得到的透明質酸酶可降解高分子透明質酸，用來制備低分子透明質酸及寡聚透明質酸，成本顯著降低，解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，在生化研究領域及低分子透明質酸和寡聚透明質酸的生產方面有廣闊的應用前景。保藏信息
本發明芽孢桿菌(ifeciBm) A50已于2012年2月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 5744。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明進行進一步的闡述，應該明白的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。實施例1
斜面培養基組成(100ml):蛋白胨 0. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖0. 5g，瓊脂粉2g，用鹽酸將pH調至6. 0。種子培養基組成(100ml)蛋白胨0. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 ·7Η20 0.05g，葡萄糖0. 5g，用鹽酸將pH調至6. 0。發酵培養基組成(100ml)蛋白胨0. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖0. 5g，Tween80 (吐溫80) 0. 05ml。所有培養基均以水為溶劑。取斜面菌種(芽孢桿菌UaciBm)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，25°C，150rpm培養M小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 250C，200rpm培養M小時，發酵過程中用硫酸將pH維持在6. 0，發酵生產得到發酵液， 發酵液中含有透明質酸酶，可以直接應用，也可以為了滿足要求純化后再應用。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為1. 2X105IU/ml。實施例2
斜面培養基組成(100ml)蛋白胨 1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖1.(^，瓊脂粉28，用磷酸將？!1調至7.0。種子培養基組成(100ml)蛋白胨1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. lg,葡萄糖1. Og用磷酸將pH調至7. 0。發酵培養基組成(100ml)蛋白胨1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 1. 0g, Tween80 0. 05ml,。取斜面菌種(芽孢桿菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，300C，IOOrpm培養15小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 350C，300rpm培養16小時，發酵過程中用硫酸將pH維持在7. 0，發酵生產得到透明質酸酶，采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為2. SXlO5IU/ ml ο實施例3
斜面培養基組成(100ml):蛋白胨 1. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖1.58，瓊脂粉28，用硫酸將？!1調至8.0。
5
種子培養基組成(100ml)蛋白胨1.5g，酵母粉 1.5g，Κ2ΗΡ04· 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖1. 5g，用硫酸將pH調至8. 0。
發酵培養基組成(100ml)蛋白胨0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 1. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌種(芽孢桿菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，350C，200rpm培養13小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 400C，IOOrpm培養12小時，發酵過程中用鹽酸將pH維持在7. 0，發酵生產得到透明質酸酶，采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為1.8X105IU/ ml ο
實施例4斜面培養基組成(100ml):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖1. Og,瓊脂粉2g，用硫酸將pH調至6. 5。
種子培養基組成(100ml)蛋白胨2. 0g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖1. 0g，用硫酸將pH調至6. 5。
發酵培養基組成(100ml)蛋白胨1. 5g，酵母粉 0. 2g，K2HPO4 · 3Η200· 15g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 1. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌種(芽孢桿菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，400C，ISOrpm培養10小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 360C，280rpm培養15小時，發酵過程中用磷酸將pH維持在8. 0，發酵生產得到透明質酸酶，采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為1.5X IO5IU/ ml ο
實施例5斜面培養基組成(100ml):蛋白胨 0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0.58，瓊脂粉28，用磷酸將？!1調至7.5。
種子培養基組成(100ml)蛋白胨0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0. 5g，用磷酸將pH調至7. 5。
發酵培養基組成(100ml)蛋白胨2. 0g，酵母粉 0. 2g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌種(芽孢桿菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，360C，120rpm培養14小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 300C，ISOrpm培養20小時，發酵過程中用磷酸將pH維持在7. 5，發酵生產得到透明質酸酶，采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為2. 5X105IU/ ml ο
實施例6斜面培養基組成(100ml)蛋白胨 1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖1.58，瓊脂粉28，用鹽酸將？!1調至7.0。
種子培養基組成(100ml)蛋白胨1. 0g，酵母粉 1. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 ·7Η20 0. 15g，葡萄糖 1.58，用鹽酸將？!1調至7.0。
發酵培養基組成(100ml)蛋白胨1. 5g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g,MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 1. 5g, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌種(芽孢桿菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，320C，150rpm培養18小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 280C，200rpm培養22小時，發酵過程中用鹽酸將pH維持在8. 0，發酵生產得到透明質酸酶，采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為1.6X105IU/ ml ο
實施例7斜面培養基組成(100ml):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖0.58，瓊脂粉28，用磷酸將？!1調至7.0。
種子培養基組成(100ml)蛋白胨2. 0g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 ·7Η20 0. 15g，葡萄糖0. 5g，用磷酸將pH調至7. 0。
發酵培養基組成(100ml)蛋白胨0. 5g，酵母粉 1. 5g，K2HPO4 · 3Η200· 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 1. Og, Tween80 0. 05ml。
取斜面菌種(芽孢桿菌UaciB^s)A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，300C，200rpm培養20小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為 10%, 34°C，220rpm培養14小時，發酵過程中用磷酸將pH維持在7. 5，發酵生產得到透明質酸酶，采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力，透明質酸酶的活力為2. IXlO5IU/ ml ο
權利要求
1.一種芽孢桿菌 UaciWw1S)A50 CGMCC NO. 5744。
2.一種透明質酸酶的生產方法，其特征是采用權利要求1中所述的芽孢桿菌 {Bacillus) KbQ CGMCC NO. 5744，經斜面培養、種子培養、發酵培養制得透明質酸酶。
3.根據權利要求2所述的生產方法，其特征是，具體包括以下步驟(1)將芽孢桿菌(Mcillus)A50 CGMCC NO. 5744菌種進行斜面培養，得斜面菌種；(2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 40°C、100 200rpm的條件下培養10 Mh，得種子液；(3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 40°C、100 300rpm的條件下培養12 Mh，得透明質酸酶。
4.根據權利要求3所述的生產方法，其特征是每IOOml斜面培養基中含有以下成分 蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉0. 2 2. 0 g,K2HPO4 ·3Η20 0.05 0.15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 — 0. 15 g，葡萄糖0. 5 1. 5 g，瓊脂粉2g，pH調至6. 0 8. 0。
5.根據權利要求3所述的生產方法，其特征是每IOOml種子培養基中含有以下成分 蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉0. 2 2. 0 g,K2HPO4 ·3Η20 0.05 0.15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 — 0. 15 g,葡萄糖 0. 5 1. 5 g, pH 調至 6. 0 8. 0。
6.根據權利要求3所述的生產方法，其特征是每IOOrnl發酵培養基中含有以下成分 蛋白胨0. 2 2. 0g，酵母粉0. 2 2. 0 g,K2HPO4 ·3Η20 0.05 0.15 g, MgSO4 ·7Η20 0. 05 — 0. 15 g，葡萄糖 0. 5 1. 5 g，吐溫 80 0. 05ml, pH 調至 6. 0 8. 0。
7.根據權利要求3所述的生產方法，其特征是采用鹽酸、硫酸和磷酸中的一種或一種以上調節斜面培養基、種子培養基和發酵培養基的PH。
全文摘要
本發明公開了一種芽孢桿菌(Bacillus)A50 CGMCC No.5744及采用該菌種生產透明質酸酶的方法，該方法為將芽孢桿菌(Bacillus)A50 CGMCC No.5744經斜面培養、種子培養、發酵培養制得透明質酸酶。該芽孢桿菌所產生的透明質酸酶活性高，可達到105IU/ml,與現有技術相比，采用本發明中的芽孢桿菌制備的透明質酸酶活性高，熱穩定高，pH穩定性高，可用于大規模生產，同時得到的透明質酸酶可降解高分子透明質酸，用來制備低分子透明質酸及寡聚透明質酸，成本顯著降低，解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，在生化研究領域及低分子透明質酸和寡聚透明質酸的生產方面有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102559559SQ20121003911
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者劉愛華, 李海娜, 欒貽宏, 石艷麗, 薛蔚, 郭學平 申請人:山東福瑞達生物醫藥有限公司