專利名稱：大豆GmFTL3蛋白和GmFTL5蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及兩個大豆開花基因、其編碼蛋白及其在植 物光周期和開花時間調節中的應用。
背景技術：
大豆是重要的農作物之一，是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂 等次生代謝產物的重要來源。因為大豆是短日植物，開花受光周期的嚴格控制，因而不同區 域間的優異品種不能相互引種、生育期也受環境光周期的制約ahang等.，2008)。如果能 降低大豆對光周期的敏感性，突破大豆開花對光周期的限制，就能解決大豆的引種問題，從 而實現各區域間優質品種的相互交換，豐富各地優異種質資源，調節大豆生育期，提高大豆 產量和品質。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過雜交的方法獲得新品種，但是，這種育 種方法具有對親本的依賴性強和周期長等缺點，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應性 品種。對擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復雜的調節網絡控制的 (Mouradov等.，2002 ；Turck等，2008)。但是，其中一個關鍵蛋白對開花時間的調節起著 至關重要的作用，它就是FloweringLocusT (簡稱FT)，它在葉片中產生，通過維管組織系統 運輸到生長點并誘導生長點形成花(Blazquez and ffeigel,2000 ；Lee等·，2000 ；Samach 等，2000 ;Turck 等，2008)。因而，FT 蛋白被稱為成花素(Corbesier 等，2007 Jaeger and ffigge,2007 ；Mathieu等，2007)。該成花素的表達可以降低植物對光周期的敏感性，促進 植物開花。FT基因的功能在不同的植物中有報道(Bohlenius等，2006 ;Hsu等，2006 ;Yan 等，2006 ；Corbesier 等，2007 Jaeger and ffigge, 2007 ；Lin 等·，2007 ；Mathieu 等，2007 ； Tamaki等，2007 ;Li and Dubcovsky，2008)，但在大豆FT基因的功能及其應用未見報道。通 過調節大豆開花基因表達來改變植物對光周期的敏感性和開花時間也沒有報道。

發明內容
本發明的目的是提供兩個大豆開花基因、其編碼蛋白及其在植物光周期和開花時 間調節中的應用。包括(1)克隆兩個大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5 ;(幻提供基因及其編 碼蛋白的序列；C3)提供這兩個基因在育種中的應用，尤其是在調節植物光周期以及開花 時間中的應用。為了實現本發明目的，本發明提供一種大豆GmFTL3蛋白，其具有如SEQ ID No. 1 所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列，以及大豆GmFTL5蛋白，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經 替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發明還提供編碼上述的大豆GmFTL3蛋白和大豆GmFTL5蛋白的基因。編碼大豆 GmFTL3蛋白的基因具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。編碼大豆GmFTL5蛋白的基因 具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
本發明的GmFTL3 和 GmFTL5(全稱為 Glycine max FloweringLocus T Like 3 和 5)是從大豆墾農18 glycine max L. Kennong 18)中克隆到的兩個基因，它們編碼蛋白 的氨基酸序列之間的同源性為90.9%，與擬南芥FT蛋白的氨基酸序列之間的同源性分別 為72. 2%和71.6%。并且GmFTL3和GmFTL5蛋白與擬南芥FT具有相同的保守域。因此， GmFTL3和GmFTL5與擬南芥FT基因具有類似促進開花的功能。但是，GmFTL3和GmFTL5的蛋 白質序列與擬南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTL3和GmFTL5的蛋白質 第131位氨基酸殘基為谷氨酸(E)，第150位氨基酸殘基是亮氨酸(L)，而擬南芥相應部位 是谷胺酰胺(Q)和異亮氨酸(I)。這些差異導致GmFTL3和GmFTL5的活性比擬南芥FT高。 大豆GmFTL3和GmFTL5基因主要在開花前期和開花期的葉中表達。本發明包括通過各種方法獲得的、如SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序 列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白質以及 編碼這些衍生蛋白質的基因。本發明將GmFTL3和GmFTL5基因構建到表達載體p35S_GW上，并在大腸桿菌DH5 α 中擴繁。通過農桿菌介導轉化方法，將P35S-GW攜帶的GmFTL3和GmFTL5基因轉入擬南芥， 獲得擬南芥轉化植株。結果表明，GmFTL3和GmFTL5具有降低植物對光周期的敏感性并促 進擬南芥開花的作用。本發明還包括含有GmFTL3和GmFTL5核苷酸序列或其片段的克隆載體或各類表達 載體、含有所述載體的宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉化植物細胞和轉基因 植物。本發明的優點在于⑴提供了大豆GmFTL3和GmFTL5基因及其編碼的蛋白本身； (2)通過在植物中過表達GmFTL3和GmFTL5基因縮短植物生育期，促進植物開花。因此， GmFTL3和GmFTL5基因及其編碼的蛋白可以調節花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇 的問題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的問題以及光周期敏感性問題和引種問 題；(3)大豆GmFTL3和GmFTL5基因調節花期的效應明顯比擬南芥FT基因的效應強。


圖1為本發明大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5編碼蛋白的氨基酸序列與FT基因 編碼蛋白的氨基酸序列的比較；圖2為本發明實施例3的植物表達載體p35S-GW的結構示意圖；圖3為本發明實施例4的克隆中間載體pGWCm的結構示意圖；圖4顯示大豆開花基因GmFTL3轉化擬南芥，導致擬南芥早開花；圖5顯示大豆開花基因GmFTL5轉化擬南芥，導致擬南芥早開花；圖6A為本發明實施例7的大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5在轉基因植物中的表 達水平；圖6B為本發明實施例7的大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5在轉基因植物中的表 達水平；圖7A為本發明實施例8的大豆開花基因GmFTL3在轉基因植物細胞核中的定位；圖7B為本發明實施例8的大豆開花基因GmFTL3在轉基因植物細胞核中的定位；圖7C為本發明實施例8的大豆開花基因GmFTL5在轉基因植物細胞核中的定位；
其中，在圖6A和圖6B中，短線前面的字母表示植株的發育時期，短線后面的字母 表示器官，U代表單葉；T代表復葉(T后面的數字為復葉的順序)；F代表花；Pd代表莢；Pt 代表葉柄(其后數字表示不同時期的莢)；R代表根；HH代表上胚軸；EH代表下胚軸；SAM代 表生長點At代表莖；L代表側生葉；C代表子葉。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1 大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5的克隆分別利用正向引物5，-ATGCCTAGTGGAAGTAGGGAT-3，和反向引物 5，-TTAGTATAACCTCCTTCCACC-3，以及正向引物 5，-AACCAATTGTAAAGTAGTTTCCA-3，和反向引 物 5，-GTCCCTTATTTTATAAAGATCAAAA-3，從大豆墾農 18 (Glycine max L. Kennong 18)中克 隆并測序獲得GmFTL3和GmFTL5基因，其基因序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示；由 其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1和SEQ ID NO. 2所示。PCR 反應程序為95°C 5min 預變性，95°C 30S，55°C 35S,72°C Imin，25 個循環， 72 0C IOmin 延伸。實施例2大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5編碼蛋白的氨基酸序列分析大豆開花基因的GmFTL3和GmFTL5蛋白序列之間的同源性大于90. 9%，C端的功 能域與擬南芥高度同源，但存在重要區別，如圖1所示。大豆GmFTL3和GmFTL5的蛋白質第 131位氨基酸殘基為谷氨酸(E)，第150位氨基酸殘基是亮氨酸(L)，而擬南芥相應部位是谷 胺酰胺(Q)和異亮氨酸(I)。這些差異導致GmFTL3和GmFTL5的活性比擬南芥FT高。實施例3 大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5的克隆載體從實施例1中擴增獲得的PCR產物直接按照TA克隆方法克隆到如圖3所示的 pGWCm載體上。先將pGWCm載體用Ahd I內切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產物以 獲得T載體。然后PCR產物和T載體于16°C進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5ci，并 在其中擴增，篩選陽性克隆并測序。實施例4大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5的植物表達載體分別將從實施例3中得到的大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5的克隆載體與如圖2 所示的植物表達載體P35S-GW等比例混合后通過LR反應(兩種質粒各50ng，LR酶1 μ 1， 補H2O至終體積5 μ 1，混勻后25°C反應6小時以上)，將GmFTL3和GmFTL5構建在p35S_GW 上，用于在植物中過表達大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5，研究其功能。植物的轉化方法采 用農桿菌介導法進行。植物中的篩選標記為Bar。實施例5大豆開花基因GmFTL3促進擬南芥開花從實施例4獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型Col對照)在長日植株生長 室中的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· S—1)下同時培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖4顯示大豆開花基因GmFTL3轉化擬南芥，導致擬南芥早開 花，對光周期不敏感。如圖4所示，其中右側代表對照野生型Col，左側代表轉基因植株。說 明大GmFTL3蛋白具有開花活性，可以促進植物開花。實施例6大豆開花基因GmFTL5促進擬南芥開花從實施例4獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型Col對照)在長日植株生長室中的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· S—1)下同時培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖5顯示大豆開花基因GmFTL5轉化擬南芥，導致擬南芥極早 開花，對光周期不敏感。如圖5所示，其中右側代表轉基因植株，左側代表對照野生型Col。 說明大GmFTL5蛋白具有開花活性，可以促進植物開花。實施例7大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5在轉基因植物中的表達水平利用實時定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測定大豆開花基因 GmFTL3和GmFTL5在轉基因植物中的表達。實時熒光定量PCR采用ABI MepOne進行，用 SYBR Green I檢測熒光信號。反應體系為SYBR Primix Ex Taq (2 X) (TaKaRa) 7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1下游引物(10μ Μ)0. 3μ 1ROX Reference Dye (50x)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1ddH20 (滅菌雙蒸水)5· 6 μ 1反應參數為兩步法95°C 10S，熱啟動；95°C 5S，60°C lmin，40個循環。用基因芯片 數據分析軟件Genesis對基因的表達進行標準化并作圖。大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5主要在開花前期和開花期的葉片中表達，GmFTL3 在開花期的第二復葉中高水平表達，GmFTL5在葉柄中高水平表達，如圖6所示。實施例8大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5編碼蛋白在轉基因植物中的定位將大豆開花基因GmFTL3與GFP的融合基因轉化至擬南芥原生質體中。具體方法 如下1、原生質體提取1)將生長4周左右的擬南芥葉片切成細條，放入甘露醇溶液中；2)配制酶解液將上述溶液55°C加熱lOmin，室溫放置后，加入CaCl2IOmM, β -巰 基乙醇5mM，BSA 0. 1 % (ff/V) ,0. 45 μ M濾頭過濾，避光4°C保存備用；3)將步驟1)中的細條撈出，放入酶解液中(1%纖維素酶R_10，0.4%離析酶 R-10,0. 4M 甘露醇，20mM KCl,20mM MES, pH5. 7)，23°C避光，40 60rpm 酶解汕；4)金屬篩過濾QOO目)至小燒杯中(冰上操作)，濾液吸至IOml塑料離心管中， 100 Xg離心lmin，棄上清。2、轉化1)向IOml離心管中加入預冷的等體積W5溶液(154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl,2mM MES pH5. 7)沖洗原生質體，輕輕顛倒混勻，100X g離心lmin，棄上清，再加入預冷 的1/2體積W5溶液，輕彈使沉淀懸浮起來，冰上放置30min ；2) IOOXg離心lmin，拿出時放冰上，棄上清，加適量預冷的匪g溶液(0. 4M甘露 醇，15mM MgCl2,4mM MES pH5. 7)沖洗原生質體，100 X g離心lmin，棄上清，加適量預冷的 MMg溶液懸浮原生質體；3)取10 μ 1融合表達載體的質粒DNA (10 μ g)于1. 5ml離心管中，用去掉尖端的平 頭槍頭加入100 μ 1原生質體提取液，輕輕吸打混勻，再加入110 μ 1的PEG/Ca2+溶液，混勻， 23°C避光溫浴30min，進行轉化；
4)向離心管中加入440μ1 W5溶液，23°C，IOOXg離心lmin，去除上清，向沉淀中 加入100μ 1 W5溶液，混勻，23°C，100Xg離心lmin，吸棄上清，加100 μ 1 W5溶液，重復1 次，23°C，100Xg離心lmin，吸棄上清，再加入Iml W5溶液將沉淀混勻；5)將懸浮液倒入六孔板中(先用5%的BSA溶液充分潤洗)，避光，平放于23°C暗 培養12 16h ；6) IOOXg離心lmin，直接吸取一定量的原生質體沉淀在Confoal顯微鏡下觀察。采用基因槍轟擊的方法，將大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5與YFP的融合基因，轉 化至大豆葉片中。具體方法如下1)微粒子彈的制備將10 μ g重組質粒DNA與6 μ 1 50mg/ml的金粉懸液(直徑 為1. 0 μ m)、4 μ 1 0. lmol/L亞精胺(抽濾滅菌)和6 μ 1 2. 5mol/LCaCl2,渦旋振蕩混勻，冰 上靜置15min，12，OOOrpm離心10s，收集金粉沉淀，用20 μ 1無水乙醇重懸。2)轟擊受體材料將幼嫩的洋蔥表皮或大豆幼嫩葉片擺放在MS培養基上，22°C 預培養4h。選用IlOOpsi的壓力膜，將20 μ 1金粉-DNA混合物點在轟擊膜中央，采用PDS 1000/He型基因槍(Bio-Rad)進行轟擊，轟擊距離6cm，真空度為25 . Hg。轟擊后的洋蔥表 皮細胞22°C暗培養24h后，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察。轉化細胞中的GFP/YFP熒光信號表示大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5編碼蛋白的 定位，如圖7所示。圖7顯示大豆開花基因GmFTL3 (圖7A和圖7B)和GmFTL5 (圖7C)編碼 的蛋白在擬南芥原生質體(圖7A)和大豆葉片(圖7B和圖7C)中主要定位于核。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.大豆GmFTL3蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 1所示的氨基酸序列或該序列 經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.大豆GmFTL5蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 2所示的氨基酸序列或該序列 經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權利要求1所述的大豆GmFTL3蛋白的基因。
4.編碼權利要求2所述的大豆GmFTL5蛋白的基因。
5.如權利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 3所示的核苷酸序列。
6.如權利要求4所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 4所示的核苷酸序列。
7.含有權利要求3-6任一項所述基因或其片段的載體。
8.含有權利要求7所述載體的宿主。
9.含有權利要求3-6任一項所述基因或其片段的轉化植物細胞。
10.權利要求3-6任一項所述的基因或其片段在調節植物光周期和開花時間中的應
全文摘要
本發明公開了一種大豆GmFTL3蛋白和GmFTL5蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。過表達大豆開花基因GmFTL3和GmFTL5可明顯促進植物(擬南芥)開花，使開花時間縮短，生育期縮短?？捎糜诮鉀Q雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C12N15/29GK102146124SQ20101011191
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者傅永福, 張曉玫 申請人:中國農業科學院作物科學研究所