專利名稱：花粉輻射誘變創制梨s基因純合體新種質的方法
技術領域：
本發明涉及花粉輻射誘變創制梨S基因純合體新種質的方法，屬于分子遺傳學領 域。
背景技術：
梨是我國乃至世界主要水果之一，我國現有栽培面積108. 74萬公頃(2007年中 國農業年鑒的數據)，是典型的配子體型自交不親和性果樹，絕大多數梨品種自花授粉不結 實，生產上必須合理配置授粉樹才能保證坐果，正因為如此，梨屬植物中目前尚沒有基因純 合的品種(個體)。此外，在梨屬植物中還存在品種間雜交授粉不親和的現象，因而田間配 置授粉品種存在一定的盲目性。迄今的研究已經表明，梨自花授粉不結實以及品種間雜交 授粉不結實是受S基因控制的，表現為當花粉的1個S基因與花柱中兩個S基因之一相同 時，它們之間相互授粉就不能結實，即花粉的自花授粉不結實的表現型是由花粉(配子體， Gametophyte)自身的S基因型決定。因此，弄清梨花粉S基因與S基因及其產物的特異性 識別功能，對于研究梨自花授粉不親和性機理具有實質性意義。但是，梨品種存在兩個不同 的S基因位點，即存在兩個花粉S基因和兩個花柱S基因，這種異源二倍體基因型在研究梨 花粉特異性識別功能和梨花柱S糖蛋白特異識別功能時會存在相互間的干擾，無法弄清是 哪個基因的作用。創制梨S基因純合體種質是深入開展相關研究的前提條件，也為梨基因 組學研究與特異性狀基因的分析等提供了基本保障。另外，在倍性育種方面，梨S基因純合 體的創制也為本項工作的順利開展奠定基礎，人們可以根據自身研究的需要，自行創制組 合所需要的S基因植株，這些材料不僅豐富了育種資源，還為以后培育出優良的新品種創 造了條件。總之，創制梨S基因純合體不僅有著良好的理論價值，而且還有著廣闊的應用前 景，為完善自花授粉不結實性理論體系提供了重要的試材。

發明內容
技術要求本發明的目的是提供了一種快速創制梨S基因純合體新種質的方法。通過對花 粉實施誘變后利用其進行自花授粉的方法，達到有效克服梨自花授粉不結實，從而獲得了 自交的后代，從后代中篩選出S基因純合體的植株，并建立了快速鑒定梨S基因純合體新種 質的技術體系，為梨倍性育種、花粉與雌蕊的相互識別的細胞信號轉導、S基因時空表達特 性及其蛋白產物的功能驗證等方面的研究提供了很好的試材。技術方案花粉輻射誘變創制梨S基因純合體新種質的方法，其特征在于將采集好的‘黃花’、‘豐水’梨花粉用Co6tlY射線進行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻 射時間15min，各重復2次，處理當日即對去雄的‘黃花’、‘豐水’進行人工自花授粉，套上硫 酸紙袋，授粉后25d調查花序坐果率，每花序留1 2個果，種子成熟后采果并取出種子，育 苗；
根據梨S-RNase基因的保守序列，用Primer premier 5. 0軟件設計正反向通用引物PF 5' -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3‘PR 5' -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3‘擴增兩自花授粉后代株系的基因組DNA，檢測梨S-RNase基因的擴增技術體系反應體系總體積為25μ L :10XPCR Buffer 2. 5 μ L 3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP, 各引物0. 1 μ Μ, 20-50ng模板，Taq酶1. OU ；通用引物PCR所用程序為94°C預變性2min, 94°C 15s, 48°C 30s, 72°C 3min, 10 個循環后，94°C變性 15S，48°C退火 30S，72°C 3. 5min，25 個循環后72°C延伸7min ；在‘黃花’花粉誘變自交后代的株系中，若只能擴增出一條S2-RNase的1347bp帶 型，則說明該株系為S2S2的純合體，若只能擴增出一條S1-RNase的367bp帶型，則說明該株 系為S1S1的純合體；在‘豐水’花粉誘變自交后代的株系中，均可擴增出一條384bp的擴增片段，用 AlwNI酶切擴增產物，AlwNI酶切技術體系為:15μ 1反應體系中，IOXBuffer R 1. 5 μ 1， Cail 0. 5 μ 1，PCR產物7. 5 μ 1，ddH205. 5 μ 1，酶切反應條件37°C環境下反應12h 14h， 若酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則對應該株系為S5S5的純合體；若酶切后依然是 一條384bp的帶型，則說明該株系為S3S3的純合體，從而獲得純合的S基因種質。有益效果本發明所提供的花粉誘變自花授粉創制梨S基因純合體種質的方法，具有以下優占.
^ \\\ ·(1)本發明操作簡便，分子標記鑒定方法準確快速。梨為典型的配子體型自交不 親和性植物，自花授粉通常不結實，故很難得到S基因純合的植株。通過花粉的輻射誘變， 讓自交不親和性發生紊亂，以便讓自花花粉能順利通過花柱到達子房完成受精，從而得到S 基因純合的植株。本發明花粉處理方法簡單，所用到的標記鑒定只涉及基因組DNA的PCR 擴增，和簡單的酶切反應，可以在幼苗期進行，不受環境條件的影響，并可在短時間內進行 大量樣品的檢測，節約生產成本。(2)本發明采用Co6tlY射線進行輻射處理定向誘變，試驗證明，重復性好。創制出 的S基因純合體種質對今后梨倍性育種、梨花粉特異性識別功能的驗證和梨花柱S糖蛋白 特異性功能等方面的研究都提供了優良的試材，并可用于指導田間授粉，具有良好的理論 研究價值和實際應用前景。從29株黃花誘變輻射自交后代中篩選出S1基因純合體植株7 株、S2基因純合體植株4株。從14株豐水誘變輻射自花授粉后代中篩選出S3基因純合體 植株3株、S5基因純合體植株2株。(3)本發明所運用的分子標記檢測準確性高。該標記與控制花粉自花不結實基因 的遺傳距離為0，沒有遺傳重組，檢測的準確性為100%。
四

圖1 ‘黃花’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴增產物的瓊脂糖電泳；圖2 ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴增產物及酶切產物的瓊脂糖電 泳；
A ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴增產物的瓊脂糖電泳；B ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴增產物AlwNI酶切產物瓊脂糖電 泳；C ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴增產物Eco0109I酶切產物瓊脂糖 電泳；H 黃花；1 29 : ‘黃花’花粉輻射誘變自花授粉的29株后代；
F 豐水；1 14 : ‘豐水’花粉輻射誘變自花授粉的14株后代；
五具體實施例方式(一 )實驗方法1、供試品種‘黃花，(HuanghuhS1S2)和‘豐水，(Hosui，S3S5)均為生產上主要栽培 品種(中國梨在線，http //www. pear. org. cn/)。2、選取品種長勢為5-6年生樹，采集各品種幼嫩葉片，保存液氮中備用。采集 開花前Id或當天花蕾，取出花藥，置于硫酸紙上，于干燥處自然散粉后裝入密閉瓶內，貯 于-20°C冰柜內備用。將采集好的‘黃花’、‘豐水’花粉用Co6tlY射線進行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻射 時間15min，各重復2次。處理當日即對去雄的‘黃花’、‘豐水’進行自花授粉，各授100朵 花序，再套上硫酸紙袋。授粉后25d調查花序坐果率，每花序留1 2個果，種子成熟后采 果并取出種子，育苗。3、CTAB法(張妤艷，黃紹西，張紹鈴，等.京白梨等品種S基因型鑒定及新基因 S28、S3(I的核苷酸序列分析[J].園藝學報，2006，33 (3) 496-500)提取各后代株系幼葉的基 因組DNA。4、禾Ij用設計的梨雌蕊S基因(S-RNase)通用引物 PF(5' -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3‘ )PR(5' -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3‘)對各自交 后代株系DNA進行PCR擴增反應體系總體積為25 μ L 10 X PCR Buffer 2. 5 μ L 3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP，各 引物 0. 1 μ M，20_50ng 模板，Taq 酶 1. OU ；通用引物PCR所用程序為:94°C 預變性 2min，94°C 15s，48°C 30s, 72 °C 3min，10 個循環后，94 °C變性155，481退火305，721 3. 5min，25個循環后72°C延伸7min ；應用 PTC-200擴增儀(BIO-RAD)進行擴增。5、反應結束后取PCR產物5 μ 1，用1. 5%的瓊脂糖凝膠在80V電壓條件下電泳45 分鐘，檢測PCR產物。EB染色，在紫外燈下觀測。6、利用 AlwNI 內切酶(酶切位點5，... CAGNNN J, CTG... 3，，3，... GTC NNNGAC— 5，)和 Eco0109I 內切酶(酶切位點5，...PuG J, GNCCPy... 3，，3，-PyCCNG GPu." 5，) 酶切‘豐水’誘變輻射自花授粉后代的PCR產物反應體系為15μ 1 反應體系中，IOXBuffer R 1. 5μ 1, Mbol 0. 5 μ 1，PCR 產物 7. 5 μ 1，ddH205. 5 μ 1。酶切反應條件37°C環境下反應12h 14h。7、取7 μ 1酶切產物在1. 5%的瓊脂糖凝膠在80V電壓條件下電泳45分鐘，EB染色，在紫外燈下觀測酶切譜帶。( 二)結果與分析如圖1所示‘黃花’誘變輻射自花授粉的后代株系表現出三種不同的S-RNase帶 型一種只擴增出一條S2-RNase的1347bp帶型，另一種是只擴增出一條S1-RNase的367bp 帶型，還有一種是兩種兼有的帶型。根據基因的分離規律，二倍體的黃花基因型為S1S2，其 自交后代應該具有三種不同的基因型，即S1SpS1S2A2Sy故根據擴增產物帶型可以確定，若 只能擴增出一條S2-RNase的1347bp帶型，則說明該株系為S2S2的純合體，若只能擴增出一 條S1-RNase的367bp帶型，則說明該株系為S1S1的純合體。故從29株黃花誘變輻射自交 后代中篩選出S1基因純合體植株7株、S2基因純合體植株4株。如圖2A所示，豐水花粉誘變自花授粉的后代均能擴增出一條384bp的帶型。根據 AlwNI特異酶切結果可以確定(圖2B)，酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則該株系為 S5S5的純合體；酶切后依然是一條384bp的帶型，則說明該株系為S3S3的純合體。Eco0109I 內切酶均可將14株后代切出118bp和266bp兩條帶型(圖2C)，故可確認‘豐水’自花授粉的后代中確實只存在S3-RNase或S5-RNase基因型，符合基因的分 離規律。故從14株豐水誘變輻射自花授粉后代中篩選出S3基因純合體植株3株、S5基因 純合體植株2株。最終，共從43株自花授粉后代中篩選鑒定出S1基因純合體植株7株，S2基因純合 體植株4株，S3基因純合體植株3株，S5基因純合體植株2株。
權利要求
花粉輻射誘變創制梨S基因純合體新種質的方法，其特征在于將采集好的‘黃花’、‘豐水’梨花粉用Co60γ射線進行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻射時間15min，各重復2次，處理當日即對去雄的‘黃花’、‘豐水’進行人工自花授粉，套上硫酸紙袋，授粉后25d調查花序坐果率，每花序留1～2個果，種子成熟后采果并取出種子，育苗；根據梨S-RNase基因的保守序列，用Primer premier 5.0軟件設計正反向通用引物PF 5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′PR 5′-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′擴增兩自花授粉后代株系的基因組DNA，檢測梨S-RNase基因的擴增技術體系反應體系總體積為25μL10×PCR Buffer 2.5μL 3.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，各引物0.1μM，20-50ng模板，Taq酶1.0U；通用引物PCR所用程序為94℃預變性2min，94℃15s，48℃30s，72℃3min，10個循環后，94℃變性15S，48℃退火30S，72℃3.5min，25個循環后72℃延伸7min；在‘黃花’花粉誘變自交后代的株系中，若只能擴增出一條S2-RNase的1347bp帶型，則說明該株系為S2S2的純合體，若只能擴增出一條S1-RNase的367bp帶型，則說明該株系為S1S1的純合體；在‘豐水’花粉誘變自交后代的株系中，均可擴增出一條384bp的擴增片段，用AlwNI酶切擴增產物，AlwNI酶切技術體系為15μl反應體系中，10×Buffer R 1.5μl，Cail 0.5μl，PCR產物7.5μl，ddH2O5.5μl，酶切反應條件37℃環境下反應12h～14h；若酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則對應該株系為S5S5的純合體；若酶切后依然是一條384bp的帶型，則說明該株系為S3S3的純合體，從而獲得純合的S基因種質。
全文摘要
本發明涉及花粉輻射誘變創制梨S基因純合體新種質的方法，屬于分子遺傳學領域。通過Co60γ40Gy誘變劑量輻射‘黃花’和‘豐水’梨花粉，再進行人工自花授粉，共從自交后代株系篩選鑒定出S1基因純合體植株7株、S2基因純合體植株4株、S3基因純合體植株3株、S5基因純合體植株2株。這些S基因純合體的植株為今后為梨倍性育種、花粉與雌蕊相互識別的細胞信號轉導、S基因時空表達特性及其蛋白產物的功能驗證等方面的研究提供了很好的試材，并可在田間授粉上起指導作用，具有良好的理論研究價值和生產應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101836582SQ201010121729
公開日2010年9月22日 申請日期2010年3月11日 優先權日2010年3月11日
發明者吳俊 , 吳華清, 張紹鈴, 陶書田, 齊開杰, 齊永杰 申請人:南京農業大學