專利名稱：一種獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法
技術領域：
本發明涉及到基因誘變和基因重組領域，具體表現為紫外誘變和快中子誘變技術，以及原生質體融合技術，獲得高產菌株，不僅提高了企業的經濟效益，也拓寬了微生物的遺傳種質資源，豐富了基因庫的內容。
背景技術：
目前紅霉素生產菌發酵水平較低，生產成本相對較高，滿足不了當今市場的需求。因此選育紅霉素高產菌株是紅霉素生產發展中有待解決的關鍵問題。目前常規的理化因子誘變育種在紅霉素生產菌的選育中應用較多，誘變育種在一定程度上可以提高菌種生產能力，改善生產菌的性狀和抗生素的品質。由于目前環境因素的改變使得紅霉素生產菌抗性能力提高，利用單一誘變方法已很難較大程度的提高紅霉素生產菌的生產能力。原生質體融合技術可以實現遺傳物質的充分重組，能夠提高融合子成為高產、并具有優良性狀的重組子的可能性。而且原生質體融合往往能夠引起細胞質粒的消除，這可以導致細胞染色體的改變，或是次級代謝途徑的變化，從而增加高產菌株出現的幾率。本發明將兩種誘變方法得到的高產菌株經原生質體融合，大大提高了獲得高產重組子的幾率，能夠為生產提供高產菌種，獲得較高的經濟效益；同時也拓寬了微生物的遺傳種質資源，豐富了基因庫的內容。

發明內容
本發明的內容與要點分述如下:
一.紅霉素鏈霉菌高產菌株I的獲得，其步驟是:
(O篩選出發菌株:選取效價較高且穩定的紅霉素鏈霉菌作為出發菌株。(2)紫外線照射誘變:將出發菌株制備成孢子懸液進行紫外線照射誘變，稀釋后涂布于培養皿上培養。(3)篩選高產菌株:隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價。(4)遺傳穩定性考察:對篩選得到的高產菌株進行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。之上所述的紫外照射條件為15W、30cm照射90s，利用搖瓶考察來篩選高產菌株，所用斜面培養基為:可溶性淀粉6g，玉米漿7g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。種子瓶培養基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g，硝酸銨1.2g，氯化鈉3g，玉米漿7.lg，分析純碳酸鈣6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。發酵瓶培養基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g,中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質碳酸|丐6g,豆油4ml,加水定容至1000ml,調pH值至7.0。 二.紅霉素鏈霉菌高產菌株II的獲得，其步驟是:(I)篩選出發菌株:選取效價較高且穩定的紅霉素鏈霉菌作為出發菌株。(2)快中子照射誘變:將出發菌株制備成孢子懸液進行快中子輻射誘變，稀釋后涂布于培養皿上培養。(3)篩選高產菌株:隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價。 (4)遺傳穩定性考察:對篩選得到的高產菌株進行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。之上所述的快中子輻射劑量為6X 10nN/cm2。之上所述的篩選培養基成分同一。三.高產菌株I和II的原生質體融合，其步驟是:
(I)孢子懸液的制備:將權利要求書I和2中所得到的高產菌株I和II分別制備成孢子懸液。(2)菌體的培養:取適量孢子懸液接入種子瓶內，在適宜條件下將菌體培養至對數生長期。(3)原生質體的融合:將權利要求1和2中得到的高產菌株I和II進行原生質體融合，包括原生質體的分離、融合及再生。(4)篩選高產菌株:隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價。(5)遺傳穩定性考察:對初篩的高產菌株進行多次傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。(6)發酵罐試驗:將所篩選的高產菌株進行發酵罐試驗，測定其效價。之上所述的原生質體融合過程中溶菌酶濃度為2.5mg/ml，34°C，酶解Ih ;熱滅活溫度為60°C，時間為IOmin ;紫外滅活照射條件為15W、30cm照射150s。本發明的優點及效果
1.本發明中首先對出發菌株進行兩種方法的誘變以獲得誘變后高產且穩定的菌株，菌株代謝能力起點較高，為后續獲得高產的重組子奠定了良好的基礎。2.本發明中采用原生質體融合技術對兩株紅霉素高產菌株進行融合，通過遺傳物質的充分重組，獲得了高產且具有優良性狀的重組子。有效提高了菌株的代謝能力，獲得了良好的經濟效益，是一種比較理想的微生物菌種選育方法。同時也拓寬了微生物的遺傳種質資源，豐富了基因庫的內容。
具體實施例方式下面通過實施例子對本發明做進一步說明，下述實例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發明的保護范圍。一.紫外和快中子誘變獲得高產菌株I和II 1.出發菌株的篩選
用接種鏟從沙土管中取適量含有紅霉素鏈霉菌的沙土，放入盛有玻璃珠的三角瓶中，用力震蕩以打散孢子，梯度稀釋后按梯度分別涂布于平皿上，34土 TC，濕度50%培養9-lld。從平皿上挑取10個單菌落轉接入斜面中，成熟后接入到搖瓶中測定其效價(表1)，選擇效價高且較穩定的菌株SE7作為出發菌株(表2)。
2.誘變
A.紫外誘變
孢子成熟后，制備孢子懸液，用無菌玻璃珠打散均勻，血球計數板計數，將孢子濃度調整為IO8個/ml，作為待處理菌液，分別取4-5ml加到6個平皿中，打開平皿蓋，用15w的紫外燈30 11處分別照射08、308、608、908、1208、1508后黑暗中放置201^11，在紅燈下將誘變后的菌液分別稀釋IO3-1O4,取0.1ml涂布于篩選培養皿上，用黑布包好后避光，340C，濕度50%培養條件下培養9-lld，記錄菌落數，計算致死率。通過大量實驗證明，紫外照射時間為90s時，正突變率較高，因此將紫外線照射時間確定為90s (表3)。B.快中子誘變
孢子成熟后，制備孢子懸液，用無菌玻璃珠打散均勻，血球計數板計數，將孢子濃度調整為IO8個/ml，作為待處理菌液，分別取4-5ml加到6個小瓶中，分別用劑量為OXlOllN'cm'3 X IO11N.Cnr2AxiollNcnr2Axio11Ncm'12 X IO11Ncm'15 X IO11N.CnT2 的快中子輻射，將誘變后的菌液分別稀釋IO3-1O4,取0.1ml涂布于篩選培養皿上，34°C，濕度50%培養條件下培養9-lld，記錄菌落數，計算致死率。通過大量實驗證明，快中子劑量為6 X IO11N cnr2時正突變率最高，因此將快中子劑量確定為6X 10nN.CnT2 (表4)。3.篩選高產菌株
隨機挑選若干株誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，7天后，測定其效價。

其中紫外線誘變突變株UV17效價較高，為5931u/ml，較原始菌株SE7提高了6.1%。其中快中子輻射誘變突變株FN23效價較高。為6143u/ml，較原始菌株SE7提高了
9.3%。4.遺傳穩定性考察
為確定初篩高產菌株的穩定性，將突變株UV17和FN23分別進行五次傳代傳代后轉接搖瓶發酵培養，7d后測定各代菌株紅霉素效價，效價測定方法為有機溶劑萃取與反萃取法。突變株UV17和FN23性狀穩定，因此將兩株菌株確定為誘變后高產菌株。二.高產菌株I和II的原生質體融合
1.孢子懸液的制備
取高產菌株I (UV17)和II (FN23)新鮮成熟孢子斜面各一支，將孢子刮下，放入裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，打散均勻后，血球計數板計數，將孢子濃度調整為IO8個/ml，作為待處理菌液。2.菌體培養
在250ml的三角瓶內裝25ml種子培養基，接種孢子懸液0.5-1.0ml, 34°C，250rpm振蕩培養46h左右。為使生長的菌絲體容易被溶菌酶酶解成原生質體，需加入等體積0.5%的甘氨酸高滲預處理Ih。3.原生質體的融合 A.原生質體的分離3000r/min離心IOmin收集生長較好的菌絲體,用高滲穩定液反復離心洗漆兩次,棄上清，加入IOml 2.5mg/ml溶菌酶溶液用吸管輕輕吸打，使菌絲體均勻地懸浮于酶溶液中，34°C水浴中酶解lh，酶解后3000r/min離心lOmin，棄上清，用高滲穩定液反復離心洗滌兩次以除去殘余溶菌酶，再將原生質體懸浮于定量的高滲溶液中，使得孢子濃度達到IO7-1O8個/ml。B.原生質體的融合
取兩種制備好的原生質體各Iml混合，離心去上清，用0.5M CaCl2洗滌，加入PEG4000溶液室溫下震蕩融合30min。C.原生質體的再生
為了簡化融合子的篩選采用親本滅活的方法處理融合前的原生質體，親本I (UV17)選擇熱滅活方法，親本2 (FN23)采用紫外滅活的方法。親本I的原生質體懸液在60°C下滅活lOmin，用高滲溶液做10—1，10_2，10_3，10_4梯度稀釋后，涂布于高滲完全培養基上。親本2的原生質體懸液在15W、30cm照射150s，用高滲溶液做10—1，10_2，10_3，10_4梯度稀釋后，涂布于高滲完全培養基上。平板分別在34°C培養7d。4.篩選高產菌株
隨機挑選若干株融合后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，7天后，測定其效價(表5)。其中以融合子PF26效價最高，為6513，較出發菌株SE7提高了 14.5%，較紫外誘變菌株UV17提高了 8.9%，較快中子誘變菌株FN23提高了 5.7%。5.遺傳穩定性考察 為確定初篩高產菌株PF26的穩定性，對其進行五次傳代，每代菌轉接搖瓶發酵培養，7d后測定其紅霉素效價，效價測定方法為有機溶劑萃取與反萃取法。PF26性狀穩定(表6)，可以確定其為高產且性狀穩定的菌株。6.發酵罐試驗:將高產菌株PF26進行發酵罐試驗，接種量為10%，培養170h后，放罐測定其效價，小試發酵罐效價達到11000u/ml以上。附表:
表I原始菌株效價
權利要求
1.采用紫外線照射誘變選育紅霉素鏈霉菌高產菌株I，其步驟是: (1)篩選出發菌株:選取效價較高且穩定的紅霉素鏈霉菌作為出發菌株； (2)紫外線照射誘變:將出發菌株制備成孢子懸液進行紫外線照射誘變，稀釋后涂布于培養皿上培養； (3)篩選高產菌株:隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價； (4)遺傳穩定性考察:對篩選得到的高產菌株進行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。
2.采用快中子照射誘變選育紅霉素鏈霉菌高產菌株II，其步驟是: (O篩選出發菌株:選取效價較高且穩定的紅霉素鏈霉菌作為出發菌株； (2)快中子照射誘變:將出發菌株制備成孢子懸液進行快中子輻射誘變，稀釋后涂布于培養皿上培養； (3)篩選高產菌株:隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價； (4)遺傳穩定性考察:對篩選得到的高產菌株進行多次傳代試驗，搖瓶考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選得到高產且穩定的菌株。
3.采用原生質體融合技術將權利要求1和權利要求2中獲得的高產菌株I和II進行融合，獲得新的高產重組子，其步驟是: (1)孢子懸液的制備:將權利要求書I和2中所得到的高產菌株I和II分別制備成孢子懸液； (2)菌體的培養:取適量孢子懸液接入種子瓶內，在適宜條件下將菌體培養至對數生長期； (3)原生質體的融合:將權利要求1和2中得到的高產菌株進行原生質體融合，包括原生質體的分離、融合及再生； (4)篩選高產菌株:隨機挑選若干誘變后長出的菌株，制備母斜面，培養成熟后接搖瓶進行發酵培養，測定其效價； (5)遺傳穩定性考察:對初篩的高產菌株進行多次傳代試驗，考察其遺傳性狀的穩定性，最終篩選到高產且穩定的菌株； (6)發酵罐試驗:將所篩選的高產菌株進行發酵罐試驗，測定其效價。
4.根據權利要求1所述的采用紫外線照射誘變獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法，其特征在于:所述的紫外照射條件為15W、30cm照射90s。
5.根據權利要求2所述的采用快中子照射誘變獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法，其特征在于:所述的快中子輻射劑量為6X10nN/cm2。
6.根據權利要求3所述的采用原生質體融合的方式將兩株高產菌株融合獲得新的高產重組子的方法，其特征在于:溶菌酶濃度為2.5mg/ml，34°C，酶解Ih ;熱滅活溫度為60°C，時間為IOmin ;紫外滅活照射條件為15W、30cm照射150s。
7.根據權利要求1、 要求2和要求3中所述的紅霉素鏈霉菌高產菌株的初篩和復篩方法，其特征在于:利用搖瓶發酵培養測定紅霉素效價的方式來篩選高產菌株，所用斜面培養基為:可溶性淀粉6g,玉米楽；7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,加水定容至1000ml,調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g ;種子瓶培養基配方為:玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g,硫酸銨1.2g,硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米楽；7.1g,分析純碳酸韓6g,豆油2ml,加水定容至1000ml，調pH值至7.0 ;發酵瓶培養基配方為:玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質碳酸|丐6g,豆油4ml,加水定容至1000ml,調pH值至7.0。
8.根據權利要求3所述的發酵罐試驗的方法，其特征在于:所用種子罐培養基配方為:玉米淀粉15g,糊精30g,黃豆餅粉15g,氯化鈉2g,硫酸銨1.2g,玉米楽；3g,輕質碳酸 丐8g,豆油5ml，消沫劑0.3ml ;發酵罐培養基為:玉米淀粉30g，糊精10g，黃豆餅粉30g，氯化鈉2g,硫 酸銨1.8g,玉米楽:13g，輕質碳酸隹丐8g，豆油5ml,消沫劑0.3ml。
全文摘要
本發明涉及一種獲得紅霉素鏈霉菌高產菌株的方法，其特征是先利用紫外線和快中子分別誘變紅霉素鏈霉菌，獲得高產菌株Ⅰ和Ⅱ，再利用原生質體融合技術將兩株高產菌株融合獲得新的高產重組子。該重組子搖瓶效價為6513u/ml，較原始菌株提高了14.5%，較誘變菌株Ⅰ和Ⅱ分別提高了8.9%和5.7%，經多次傳代后效價穩定，小試發酵效價達到11000u/ml以上。該方法有效地提高了菌株的代謝能力，獲得了良好的經濟效益，是一種比較理想的微生物菌種選育方法。
文檔編號C12N15/03GK103160445SQ20111041102
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者李瑾, 程傳東, 何海燕, 張麗麗, 于新令, 王鳳灘 申請人:山東方明藥業集團股份有限公司