專利名稱：：鑒別轉抗除草劑棉花llcotton25轉化體的pcr方法
技術領域：
：本發明屬于轉基因植物檢測領域，特別是涉及鑒別轉抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體的PCR方法
背景技術：
：我國是轉基因作物的主要種植國家之一，2009年種植面積位于全球第六位。我國商業化種植的轉基因作物主要為轉基因抗蟲棉花何抗木瓜環斑病毒的轉基因番木瓜等。其中，轉Bt基因抗蟲棉是我國種植面積最大的轉基因作物，2009年種植面積達370萬公頃，占我國棉花種植總面積的近70%(James，Clive.2009.GlobalStatusofCommercializedBiotech/GMCrops:2009.ISAAABrie預o.41.ISAAA:Ithaca，NY.)。我國種植的轉基因棉花主要為抗蟲轉基因棉花。此外我國還允許國外抗除草劑棉花LLC0TT0N25、抗蟲轉基因棉花531等5個轉基因棉花進口用作加工原料(http:〃www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。抗除草劑棉花LLC0TT0N25是由拜耳作物科學公司研發的通過農桿菌介導的轉bar基因的抗除草劑棉花品種，2003年在美國被批準商業化應用，隨后陸續在澳大利亞、巴西、力口拿大等國被批準應用(http:〃www.agbios.com/dbase.phpaction=Submit&evidcode=LLCotton25)。我國于2006年批準抗除草劑棉花LLC0TT0N25進口用于加工原料(農基安證字(2006)第360號)。因此建立抗除草劑棉花LLC0TT0N25的快速、特異性的檢測方法對其監管和安全性評價顯得十分必要。目前，PCR技術是轉基因作物檢測中應用最為廣泛的技術。在應用這種技術進行轉基因作物定性檢測時，根據其擴增的靶標區域和特異性將其分為四類一、篩選檢測，以轉基因通用的外源啟動子和終止子為靶標區域；二、基因特異性檢測，以特異的外源目的基因為靶標區域；三、構建特異性檢測，以轉基因元件之間的特異構建為靶標區域；四、轉化體特異性檢測，以轉化體特異性片段(外源插入片段與受體基因組連接區域)為靶標區域。這四類檢測方法對轉基因作物的檢測特異性是逐漸增加的，轉化體特異性檢測是目前對轉基因品系檢測特異性最高的檢測方法，也是目前轉基因檢測中最常用的身份檢測方法，這種檢測方法能夠區分同一轉化載體產生的不同轉化植株品系。經檢索公開文獻和專利發現，目前尚沒有抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性片段序列的報道。
發明內容針對上述領域中的空白，本發明提供了抗除草劑棉花LLC0TT0N25的5'端和3'端轉化體特異性序列以及鑒別抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性PCR方法，該PCR方法能利用普通的PCR儀器、試劑快速準確鑒別出抗除草劑棉花LLC0TT0N25，以及以抗除草劑棉花LLC0TT0N25為親本的棉花品系。鑒別轉抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據SeqIDNo.l所示核苷酸序列l-1723bp位置設計，反向引物是根據SeqIDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置設計。所述正向引物為LL25-5F:5'-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3'，所述反向引物為LL25-5R:5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'，擴增的片段為長度為411bp。鑒別轉抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據SeqIDNo.2所示核苷酸序列l-476bp位置設計，反向引物是根據SeqlDNo.2所示核苷酸序列477-1010bp位置設計。所述正向引物為LL25-3F:5'-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3'，所述反向引物為LL25-3R:5'-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3'，擴增片段長度為430bp。本發明通過Genomewalking方法獲得轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性序列，一條為外源重組載體5'端插入區域的特異性旁側序列，另一條外源重組載體的3'端插入區域的特異性旁側序列，根據這兩條旁側序列任意一條設計引物對，能夠專門用檢測LLC0TT0N25及以其為親本的棉花品種。本發明還進一步設計了兩對特異性引物，可以用于LLC0TT0N25及以其為親本的棉花品種鑒別的最優化方案。本發明提供的的轉化體特異性序列以及依賴其建立的轉化體特異性PCR方法可作為一種鑒定轉抗除草劑棉花LLC0TT0N25，以及以這個品種為親本的轉基因棉品系的有效手段，由于轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25是我國允許進口用作加工原料的轉基因棉花品系之一，因此本發明為特異性鑒定轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25提供了便利，該方法的優點在于快速、靈敏度高、特異性好、所需實驗條件不高，因此有非常高的實用價值。圖1轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體特異性序列的GenomeWalking擴增M:DNAMarkerDL2000;1-4:5'端DL1-DL4的Walking產物；5-8:3'端DL1-DL4的Walking產物圖2轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的5'端轉化體特異性PCR檢測結果M:DNAMarkerDL2000;1:轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25，2-9:8個市場棉花樣品；10:空白對照圖3轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的3'端轉化體特異性PCR檢測結果M:DNAMarkerDL2000;1:轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25，2-9:8個市場棉花樣品；10:空白對照具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等的分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實施例1轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體特異性序列的克隆1實驗材料1.1植物材料轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25(拜耳作物科學公司)，本實驗室有保存，可向公眾發放用于實驗研究。1.2酶與試劑分子生物學試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等購自大連寶生物工程有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。1.3實驗儀器PCR擴增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測序儀(A卯liedBiosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養箱等。2實驗方法和過程2.1棉花基因組DNA提取與檢測2.1.1棉花基因組DNA提取取子葉期的幼嫩棉花葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊，進行棉花材料總DNA的提取。2.1.2DNA檢測取5iU提取的DNA溶液，以O.8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質量。采用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。2.2Genomewalking分離轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性序列Genomewalking也是一種擴增已知序列旁側未知區域序列的方法，主要步驟為基因組DNA酶切、與接頭連接、兩次巢式PCR擴增等。本實施例采用Genomewalking的方法獲得了轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性序列。具體步驟參照GenomeWalkerTMUniversalKit(Takara大連公司)試劑盒說明，本實施例進行了部分改進，主要操作步驟如下。2.2.1基因組DNA酶切分別用DraI、StuI、Pvu11、EcoRV酶切轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25基因組DNA，標記為DL1DL4。酶切體系為:基因組DNA(O.1yg/yL)，25yL;10X酶切Buffer,lOyL;內切酶(10U/iiL)，8iiL;ddH20，57iiL;總體積100yL。37"溫浴2h，取出離心管，低速離心510s，繼續溫浴1618h。各取5L進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切是否完全。2.2.2純化酶切產物按回收試劑盒說明書純化酶切產物。2.2.3連接反應5連接反應體系純化的酶切產物，4iiL;接頭(25iiM)，1.9iiL;10X連接Buffer,1.6iiL;T4DNA連接酶(6U/iiL)，0.5iiL;ddH20，8iiL;總體積16iiL。混合反應液，16t:溫浴過夜，然后7(TC變性5min。每管加入72yLddH20，混勻，-2(TC保存備用。2.2.4PCR反應GenomeWalking共需要兩輪PCR反應，其PCR的反應體系見表1。表1反應體系(iiL)第一輪第二輪ddH2017.37536.2510XBuffer(Mg2+Plus)2.55dNTP(2.5mMeach)24APl(10uM)12GSPPrimer1(10uM)12ExT叫(5U/uL)0.1250.25Template(20ng/uU10.5(第一輪反應產物)Totalvolume25502.2.5和分析PCR在0.8%膠上進行用Gel兩輪PCR擴增的程序見表2。表2GenomeWalking擴增程序反應步驟設置循環數第一輪194。C,25s;72°C，3min7294。C,25s;67°C,3min32367。C,7min1第二輪194。C,25s;72°C，3min5294。C,25s;67°C，3min20367°C,7min1序列測定擴增產物的瓊脂糖電泳，采QIAquickExtractionkit回收擴增片段，連接到pGEM-Teasy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer進行序列測定。采用軟件vectorNTI10.0(Invitrogen)6對測定的序列進行拼接和分析。在NCBI數據庫(http:〃w麗.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN檢索相似的基因組序列。3實驗結果3.1轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體特異性序列測定分別經過1次GenomeWalking獲得轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的5'端和3'端轉化體特異性序列。5'端GenomeWalking以引物5W1-P1和5W1-P2(表3)分別進行第一輪和第二輪PCR擴增，結果獲得2006bp的擴增產物(圖1，泳道4)。3'端GenomeWalking以引物3W1-P1和3W1_P2(表3)，分別進行第一輪和第二輪PCR擴增，結果獲得1010bp的擴增產物(圖l，泳道6)。表3Ge謹eWalking弓l物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.2轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體特異性序列分析將獲得的序列提交NCBI數據庫比對分析，5'端轉化體特異性序列的l-1723bp為棉花基因組序列，1724-2006bp為轉化載體序列，序列見SEQIDNOl。3'端轉化體特異性序列的l-476bp為轉化載體序列，477-1010bp為棉花基因組序列，序列見SEQIDN02。實施例2本發明的轉化體特異性PCR方法應用于鑒別轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N251實驗材料1.l植物材料轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25(拜耳作物科學公司)，本實驗室有保存，可向公眾發放用于實驗研究。8個棉花材料，購自市場。1.2酶與試劑分子生物學試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。1.3實驗儀器PCR擴增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA電泳分析系統KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養箱等。2實驗方法和過程2.1棉花基因組DNA提取與檢測見實施例1中2.1棉花基因組DNA提取與檢測。2.2鑒別轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性PCR方法依據5'端轉化體特異性序列，設計引物LL25-5F/LL25-5R組合(序列見表4)，預期擴增片段為411bp;依據3'端轉化體特異性序列，設計引物LL25-3F/LL25-3R組合(序列見表4)，預期擴增片段為430bp。檢測購自市場的8個棉花樣品，見圖2和圖3。實驗結果表明，轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25這兩對引物均能獲得預期大小的擴增片段，而檢測的8個市場樣品均未獲得預期大小的擴增片段。分別克隆這兩個擴增片段，按實施例1中"2.2.5序列測定和分析"進行序列分析。序列分析結果表明，5'端擴增片段序列與SEQIDN01的1596-2006位完全一致，3'端擴增片段序列與SEQIDN02的120-549位完全一致。檢測結果表明本發明提供的PCR方法能很好地鑒別出棉花樣品中是否含有轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25。PCR反應體系為0.25iiLrTaq(5U/iiL)，5iiL10XPCRBuffer(Mg2+Plus)，4iiLdNTP(各2.5mM)，引物各2yL(10yM)，模板各2yL(20ng/yL)，加滅菌蒸餾水補足體積至50iiL。擴增程序為94。C預變性4min;94。C變性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸30sec，35個循環；72。C10min。表4鑒別轉基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉化體特異性PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求鑒別轉抗除草劑棉花LLCOTTON25轉化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據SeqIDNo.1所示核苷酸序列1-1723bp位置設計，反向引物是根據SeqIDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置設計。2.根據權利要求1所述的PCR方法，所述正向引物為LL25-5F:5'-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3'，所述反向引物為LL25-5R:5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'，擴增的片段為長度為411bp。3.鑒別轉抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據SeqIDNo.2所示核苷酸序列l-476bp位置設計，反向引物是根據SeqIDNo.2所示核苷酸序列477-1010bp位置設計。4.根據權利要求3所述的PCR方法，所述正向引物為LL25-3F:5'-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3'，所述反向引物為LL25-3R:5'-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3'，擴增片段長度為430bp。全文摘要本發明“鑒別轉抗除草劑棉花LLCOTTON25轉化體的PCR方法”，屬于轉基因植物檢測領域。本發明通過Genomewalking方法獲得轉基因抗除草劑棉花LLCOTTON25的轉化體特異性序列，一條為外源重組載體5’端插入區域的特異性旁側序列，另一條外源重組載體的3’端插入區域的特異性旁側序列，根據這兩條旁側序列任意一條設計引物對，能夠專門用PCR檢測轉基因棉花品種LLCOTTON25及以其為親本的棉花品種。文檔編號C12Q1/68GK101792813SQ20101014391公開日2010年8月4日申請日期2010年4月7日優先權日2010年4月7日發明者孫爻,張永軍,彭于發,謝家建申請人:中國農業科學院植物保護研究所